【doc】不同剂量黄柏的大补阴丸（汤）对CJ小鼠胸腺细胞凋亡的影响

【doc】不同剂量黄柏的大补阴丸（汤）对CJ小鼠胸腺细胞凋亡的影响 不同剂量黄柏的大补阴丸(汤)对CJ小鼠 胸腺细胞凋亡的影响 皖南医学院2004年第23卷第2期 文章编号:1002—0217(2004)02—0089—03 ? 89? 不同剂量黄柏的大补阴丸(汤)对CJ小鼠胸腺细胞凋亡的影响 赵向忠董群 (皖南医学院微生物学与免疫学教研室,安徽芜湖241001) 摘要:目的比较不同剂量黄柏的大补阴丸(汤)诱导q小鼠胸腺细胞凋亡的差别.方法用空肠弯曲菌免疫小 鼠制备自身免疫病模型,造模第二周起,分别用小,中,大三个不同剂量黄柏的大补阴丸(汤)灌胃,连续用药两周后 处死.取胸腺细胞,通过流式细胞仪计数,检测胸腺细胞凋亡率.结果胸腺细胞凋亡率随方中黄柏剂量的加大 而增高.结论大剂量黄柏的大补阴丸(汤)效果最好,黄柏在全方大补阴丸(汤)诱导的cJ小鼠胸腺细胞凋亡过 程中发挥重要作用. 关键词:黄柏;大补阴丸;自身免疫疾病;动物模型;细胞凋亡 中图分类号:R289.5;R363—332;R593.2文献标识码:A 胸腺细胞凋亡障碍是某些自身免疫病发生的 重要机制之一,能否诱导胸腺细胞凋亡从而减轻免 疫反应是目前治疗自身免疫病途径之一,也是生物 医学研究的热点方向.大补阴丸(汤)临床上已用于 自身免疫病的治疗,机理尚有待进一步探讨.本室 的前期研究已表明,该方对自身免疫病模型鼠的免 疫损伤有明显改善作用,可抑制T,B细胞活性.但 其对胸腺细胞凋亡的影响,尤其是组方中重要成分 黄柏(cortexpheUodendri,CP)在其中的作用尚不清 楚.研究已表明单味黄柏就有较强的免疫抑制作 用,因此,本文通过变化组方中黄柏剂量来探讨大补 阴丸(汤)对胸腺细胞凋亡的影响. 1与方法 1.1动物健康雌性ICR小鼠,体重(18?2)g,南 京医科大学动物中心提供,许可证号SCXK(苏) 2002—0031. 1.2方药黄柏(炒褐色),知母(酒浸炒),熟地黄 (酒蒸),龟板(酥炙)均购自芜湖张恒春大药店,并经 鉴定. 1.3主要试剂空肠弯曲菌—Sl31,空肠弯曲菌 营养琼脂培养基(上海市疾病预防控制中心),弗氏 完全佐剂(CFA),Pl染液(sigma公司),7O%冰乙 醇,10%小牛血清的PBS,流式细胞仪(FCM)由中 国科技大学提供协助. 1.4大补阴丸(汤)制备组方中黄柏剂量按0.5 倍,1倍,2倍递增,即组方中黄柏,知母,熟地黄,龟 基金项目:安徽省教育厅自然科学基金项目(2002kj301) 收稿日期:2003.11一O5 作者简介:赵向忠,女,1977年生,2001级硕:研究生;董群,女 教授,硕士生导师. 板比例分别是1:2:3:3,2:2:3:3(原方),4:2:3:3, 组成小,中,大三个剂量组. 1.5C1—131抗原的制备将CJ一131冻干粉溶解到 肉汤培养基中进行复苏,复苏成功后,在固体培养基 上划线接种,并进行常规革兰染色镜检以确证是所 需菌种后,用含0.3%的甲醛生理盐水洗下琼脂板 上培养48h的CJ一131菌苔,4000r/min,离心3O min,用生理盐水洗两次,然后在752分光光度计 540nm处,将细菌悬液调OD值为1.25(浓度:3× 10CFU/m1). 1.6模型制备…肠弯曲菌CJ一131辅以CFA免 疫小鼠,诱导自身免疫病动物模型,取上述CJ一131 细菌悬液和等量CFA混匀,完全乳化.取乳化液 5Ol右足趾部皮下注射,进行初次免疫,初次免疫 后l4天,尾静脉注射CJ一131细菌悬液0.2ml,加强 免疫1次.28天后检测血清ds—DNA抗体,ss-DNA 抗体水平,并做肝组织病理切片验证造模是否成功. 1.7分组及用药见表1. 表l具体分组及用药情况 *LCP,HCP分别指含有小剂量,大剂量黄柏的大补阴丸(汤) 1.8血清自身抗体测定参考文献[1],用100t*l ? 9O? 包被液[含ds—DNA和SS.DNA(取前者煮沸l0min, 冰水冷却得)2.5~g/m1]包被紫外线灯照射的酶标 板,4?过夜.甩掉孔内液体,用EBS-Tween (0.05%Tween-20,PBSpH7.4)洗涤3次.待测血 清按1:100稀释,取100l加入酶标板中,置37c(, 反应2h,甩掉孔内液体,用PBS-Tween洗涤3次, 加入1001羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶标抗体 (1:1ooo),37?作用2h,PBS-Tween洗板3次,再 加入100邻苯二胺底物溶液37?显色30rain, 用2mol/LH2SO4终止反应,实验结果在酶标仪490 nm处读OD值. 皖南医学院2004年第23卷第2 1.9细胞I)NA含量的流式细胞仪[2]每个 样品收集1--5×10细胞,冰冷ElLS洗2次,70%冰 乙醇固定细胞,置4?保存,染色前将细胞重悬于 PBS中,加RNA酶至终浓度为50~g/ml,再加入P1 染液至终浓度50~g/ml,室温避光30rain上机测 定,观察是否在G1峰前出现凋亡特有的AP峰 (apoptoticpeak),计算该细胞占总细胞的百分数,即 凋亡率. 统计学处理:实验数据以均数?差表示,进 行方差分析和q检验. 2结果见表2. 表2各组小鼠指标测定 注:与正常组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,?P<0.05,??P<0.01 从表2我们可以看出,小鼠经皮下免疫28天(尸<0.05),大剂量黄柏的大补阴丸(汤)作用最为 后,模型组(M)抗ds—DNA和抗ss—DNA明显高于正明显,胸腺细胞凋亡率远远高于中剂量黄柏组(P< 常组(N)(P<0.01),正常用药组与正常组无差别0.01). (P>0.05),中,大剂量黄柏组(M+DBYW,M-k HCP)可见抗体水平均明显降低(尸<0.01).而小 剂量黄柏组效果不明显,抗体水平仍高于正常组(P <0.01). 病理学改变:肝脏组织经固定,脱水,石蜡包埋, 常规切片,HE染色.可见模型组中央静脉周围有 明显的炎性细胞浸润,细胞间亦有散在的炎性细胞, 黄柏小,中,大剂量组均比模型组有所改善. 3讨论 自身免疫病是一类病因不明,致病机制也较复 杂的难治性疾病,大量的研究已表明自身免疫病与 遗传因素,药物,精神创伤,微生物感染等关系密切. 目前西医治疗仍以激素和免疫抑制剂为主,副作用 大,应用受到限制.中医认为自身免疫病多是”肾阴 虚”证,许多滋补肾阴的药物目前已用于自身免疫性 疾病的治疗,并且疗效比较好,毒副作用小,适合长 期用药,在自身免疫病治疗方面有广阔的应用前景. 中药复方大补阴丸(汤)为滋补肾阴一名方,临床上 已用于治疗系统性红斑狼疮J,糖尿病L4]等一些自 身免疫病,但其确切的作用机理尚不清楚,此外,由 于自身免疫病本身的复杂性,使大补阴丸(汤)的临 床应用缺乏一定的理论依据.为此,我们开展了对 大补阴丸(汤)免疫药理机制的研究.我们采用孙兵 等研究的自身免疫病动物模型(如前述)作为实验对 象,研究发现l5]大补阴丸(汤)对自身免疫病鼠有较 明显的作用,能够抑制T,B细胞增殖活性,降低自 皖南医学院2004年第23卷第2期 身抗体水平,缓解肝脏局部的炎性浸润,并且发现组 方中黄柏表现出较强的类似糖皮质激素样的作用, 据此我们通过改变组方中黄柏剂量来进行更进一步 的探讨. 自身抗体是自身免疫病的重要标志,它可以作 为自身免疫病诊断和疗效的一个重要参考指 标.我们的研究结果表明,DBYW对CJ致敏小鼠 增高的ds-DNA抗体,SS—DNA抗体有显着的降低作 用,对正常小鼠的抗体水平无影响,提示其不能刺 激正常鼠自身抗体的产生.中,大黄柏剂量组(M+ DBYW,M+HCP)可见ds—DNA抗体,SS—DNA抗体 水平均明显降低,但以大剂量组降低更为明显.黄 柏小剂量组效果不明显,抗体水平仍高于正常. DBYW降低ds-DNA抗体,SS—DNA抗体的机制,可 能是通过抑制了B细胞活性J,尤其是方中黄柏有 较强免疫抑制作用,使B细胞产生抗体的能力下 降.这表明DBYW能够降低自身抗体的水平,黄柏 在其中发挥了重要.这可能与黄柏中某些成分如黄 柏碱有关. 细胞凋亡障碍与多种疾病关系密切.自身免疫 性疾病就是其中一大类,诸如临床上常见的系统性 红斑狼疮,类风湿性关节炎,胰岛素依赖性糖尿病, 甲亢等.众多的研究表明这类疾病都存在细胞凋亡 障碍,尤其是免疫细胞.胸腺是机体重要的免疫器 官,胸腺细胞的凋亡对于T细胞发育,免疫系统自 稳有重要意义,并且还涉及一些与免疫有关疾病的 发生和治疗,胸腺细胞凋亡的研究是目前免疫学研 究的热点. 我们通过变换组方中黄柏剂量来探讨大补阴丸 (汤)对胸腺凋亡的影响,研究发现,大补阴丸(汤)能 够诱导正常和自身免疫病鼠胸腺细胞的凋亡,并与 ? 9l? 方中黄柏呈现一定的剂量依赖关系,组方中黄柏剂 量越大诱导胸腺细胞凋亡的能力越强,说明在诱导 胸腺细胞凋亡的作用中,黄柏起了重要作用.是否 是其主要成分小檗碱【6J,黄柏碱【6J有这种作用,还 需进一步证实.在细胞凋亡过程中Fas/FasL系统 介导的细胞凋亡是最普遍的一种凋亡途径.众多的 研究已表明Fas/FasL系统不仅具有调节外周T,B 淋巴细胞平衡,清除自身反应性细胞的作用,还在自 身免疫组织损伤机制中发挥重要作用.DBYW诱 导胸腺细胞凋亡的机制是否是通过调节Fas/FasL 的表达,或作用于其他一些凋亡相关分子还有待于 进一步探讨.而新近发现的程序化细胞死亡分子 PDCD5是一个凋亡的正调节分子,它可能也参与了 自身免疫病等疾病的异常凋亡过程,有可能成为辅 助诊断标志和治疗靶点【7J.中药诱导胸腺细胞凋亡 治疗疾病有广阔的研究和应用前景,因为中药作用 缓和,副作用小,尤其适用治疗自身免疫病.这就需 要我们在已有研究的基础上作更深入的研究,以期 为中药治疗自身免疫病提供可靠的理论基础. 参考文献: [1]孙兵,马宝骊,谢雅莉.甲醛化空肠弯曲菌(cJ.S131)与佐剂 诱导的自身免疫动物模型[J].上海免疫学杂志,1991,ll(5): 257,260. [2]刘仿,何德,郭震.CD3单抗诱导幼龄小鼠胸腺细胞凋 亡研究[J].微生物学免疫学进展,2000,28(4):27--29. 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EffectofDBYWwithdifferentdosageofcortexphen0dendri(CP) onthymocyteapoptosisinautoimmunemiceinducedbyCJ ZHOXiang—zhong,IX)NGQun (DepartmentofIm.zuludogy,Wamzal?Medica/Collage,Wu]zu241001,China) Abstract:ObjectiveToobserx,ethedifferencesofthymocytesal~ptosisinducedbyDBYWwithdifferent dosagesofCPinautoimmunemice.MethodsAutoimmunemicem(~elsinducedbyCJwereusedasexperi— mentalobjects.Fromthesecondweekafterirnnmnizationtothefourthweek,themiceweregivenDBYwwith differentdosagesofCP.Apoptosisofthymocytesofthesemicewasassayedbyflowcytometry.ResultsThe apoptosisratesincreaseddose—dependentlywith(,Pin1)ljYW.Conclusion DBYWwithhighdosageofCPis betterthantheotherS.CPplaysanimportantroleintheprocessofapoptosisofthymocytesinducedbyDBYW Keywords:cortexphellodendri;DaBuYinWan:auloimmunediseases;anim almodel;apoptosis