ES细胞的三维培养与肝细胞分化的初步研究

ES细胞的三维培养与肝细胞分化的初步研究 ( )【摘要 】 目的 探索用生物三维培养胚胎干细胞 em b ryon ic stem ce ll, ES细胞 并向肝细胞分化的可行性 。方法 胰酶消化 6 TM ( )悬滴法形成 5 d的鼠拟胚胎 ,将 1 ×10/mL 鼠 ES细胞不细胞外基质 M a trige l1 ?1 混合接种于聚乳酸 po ly2L 2lac tic ac id, PLLA 和 ( )聚乙醇酸 po lyglyco lic ac id, PGA 共聚合三维支架内 ,用 DM SO、地塞米松 、H GF、FGF4、胰岛素等诱导 ES细胞向肝细胞分化 ,动态观 ()() 察 ES细胞的培育和生长情况 ,并用 R T2PCR、免疫荧光染色检测其肝细胞标志物白蛋白 ALB 和甲胎蛋白 A FP的达 。结果 立体显微镜见 ES细胞及分化细胞在聚合支架材料上呈三维立体状态生长 ,并保持细胞活力 ,随培养时间延长不断增殖 。 R T2PCR检出分化细胞表达 ALB mRNA 和 A FP mRNA ,同样免疫荧光染色也证实表达 ALB 和 A FP。结论 ES细胞可在生物材料聚合三维 TM可降解支架及 M a trige l上生长 ,并在诱导剂的作用下向肝细胞分化 。 【关键词 】 胚胎干细胞 ;肝细胞 ;细胞分化 ;生物材料 ( ) 收稿日期 : 2008202 216 文章编号 : 1006 - 5709 200808 - 0629 - 03 中图分类号 : Q813 文献标识码 : A Three2d im en s iona l cu lture an d d ifferen t ia t ion of em bryon ic stem ce lls in to hepa tocy te s 1 , 2 1 1 1ZHAN G Yunp ing, WAN G Yingjie, ZHAN G Sh ichang, L IU Tao 1. In stitu te of Infec tiou s D isea se, Sou thwe st Ho sp ita l, Th ird M ilita ry M ed ica l U n ive rsity, Chongq ing 400038; 2. Shang2 ha i Sixth Peop le’s Ho sp ita l, Ch ina 【A b stra c t】 O b jec t ive To inve stiga te the po ssib ility of the th ree2d im en siona l cu ltu re and d iffe ren tia tion of em b ryon ic ( ) stem ce lls EScin to hep a tocyte s on b iom a te ria ls. M e thod s Mou se ESc we re re su sp ended a t a concen tra tion of 1 × 6 TM 10ce lls p e r 1 mL of cu ltu re m ed ium and m ixed w ith M a trige la t 1 ?1. The m ixtu re we re seeded on to po ly2L 2lac tic ac id and po lyglyco lic ac id copo lym e rized scaffo ld s and cu ltu red in d iffe ren tia tion m ed ium con ta in ing DM SO , dexam e tha sone, ( ) ( ) hep a tic grow th fac to r H GF, fib rob la st grow th fac to r FGF4 and in su lin, e t a l. ESc grow th and p ro life ra tion on the th ree2d im en siona l b iodegradab le po lym e r scaffo ld we re ob se rved by ste reom ic ro scop e. The exp re ssion s of hep a tocyte () α() m a rke rs, a lbum in ALB and2fe top ro te in A FPwe re exam ined u sing R T2PCR and imm unofluo re scence. Re su lts Ste reom ic ro scop y showed tha t mou se ESc o r ES ce ll2de rived ce lls we re a ttached to the copo lym e r scaffo ld s and grew ac2 tive ly in a th ree2d im en siona l. Ce lls inc rea sed in quan tity and den sity a s tim e goe s on. The ALB and A FP mRNA s we re de te rm ined in d iffe ren tia ting ESc a t day 7 and 14 by R T2PCR. Con tro l group w ithou t induc to r d id no t exp re ss ALB , bu t mRNA exp re ssion of A FP wa s seen a t day 14. Imm unocytochem istry sta in ing revea led tha t the d iffe ren tia ting ESc we re TM po sitive fo r ALB and A FP. C on c lu s ion ES ce lls can be cu ltu red and d iffe ren tia ted in to hep a tocyte s w ith M a trige land induc to rs on th ree2d im en siona l b iodegradab le po lym e r scaffo ld. 【Key word s】 Em b ryon ic stem ce lls; H ep a tocyte s; Ce ll d iffe ren tia tion; B iom a te ria ls 自 1998 年 Thom son 等从内细胞团分离到人胚胎可降解支架上培养和肝细胞分化进行了初步研究 。 ( )干细胞 em b ryon ic stem ce ll, ES细胞 以来 ,干细胞成 1 材料与方法 为生命科学最热门的研究课 。随着有关研究的不断 1. 1 材料 聚合三维支架材料为非编织型可降解聚 深入 , ES细胞所具有的能够向不同组织细胞分化的特 ( ( ) 乳酸 po ly2L 2lac tic ac id, PLLA 和 聚 乙 醇 酸 po lygly2 性 ,使之也成为组织工程领域的研究热点 ,以 ES细胞 () ) co lic ac id, PGA 共聚物 美国 Syn thecon 公司 , PLLA为种子 、生物材料为载体的骨 、软骨 、血管 、神经等组织 和 PGA 的聚合比例各 50 % 。使用时将支架剪成约 5 [ 1 23 ] 的研究已取得不同程度的进展 。然而 ,有关 ES细 mm ×4. 5 mm ×1 mm 的小片 ,置 75 %的乙醇溶液中浸 胞在三维生物材料上的生长不向肝细胞分化的研究为 泡 1 h, PB S清洗 3次备用 。 数尚少 ,鉴于肝组织工程研究有可能为肝功能衰竭的 1. 2 ES细胞培养及胚胎体的形成 鼠 ES细胞 CCE 治疗提供新的有效措施 , 本文对 ES细胞在聚合三维 株购 自 加 拿 大 StemCe ll Techno logie s公 司 , 未 分 化 的 ES细胞维持于含 0. 1 mmo l /L 非必需氨基酸 、2 mmo l / ( )基金项目 :国家自然科学基金资助项目 30670526 L L 2谷酰胺 、0. 1 mmo l /L 二羟基丙硫醇 、15 %胎牛血 通讯作者 :王英杰 , E2m a il: yingjiewng@ yahoo. com ( ES细胞进行动态观显微镜对共聚三维支架上培养的 清 、1 000 U /mL L IF recom b inan t mou se leukem ia inh ib2 ) ito ry fac to r, Chem icon In te rna tiona l 公 司 的 MIDM 察 。结果显示 : 接种的 ES细胞较均匀地分散于三维 ( )Iscove’s mod ified D u lbecco m ed ium 培养液和被覆明 支架材料中 ,部分细胞聚集成团 ; 培养至第 5 天 ,支架 胶的培养瓶内 。采用“悬滴法 ”使 ES细胞在不含 L IF 的纤维之间出现大量的 ES聚集体 , 并不纤维支架紧 的上述 IMDM 培养液中形成胚胎体 , 5 d后胰酶消化胚 密附着 ; 此后 ,支架上的 ES细胞数量进一步增加 , ES 胎体细胞备用 。 细胞或沿纤维支架生长 ,或呈网织状黏连于相邻的纤 1. 3 ES细胞的三维支架培养和肝细胞分化 调整细 维之间 ,不同层面片样生长的 ES细胞和分化细胞展 6 TM胞数为 1 ×10/mL , 冰 浴 下 按 1 ?1 比 例 不 M a trige l 现出立体景象 。 Ca lce in2AM 活细胞荧光染色显示 , 培 () BD B io sc ience s公司 混合 , 并快速接种于三维支架 养于三维 支架 上 ES 细 胞及 分 化 细 胞 保 持 良 好 的 活 [ 4 ] 内 , 37 ?下凝固 30 m in后移至 12孔培养板 ,诱导分 力 ,其绿色荧光图像不 ES细胞在三维支架上的分布 、 - 7 () 化组用主要含 1 % DM SO、1 ×10 mo l /L 地塞米松 、20 生长和增殖过程相一致 见图 1 。 ( ng /mL H GF recom b inan t mou se hep a tic grow th fac to r, 2. 2 分化细胞 AL B、A FP 的免疫荧光染色 以目前 ) ( 公认的 ALB、A FP 为肝细胞标志物 , 采用免疫荧光染 R &D System s公司 、10 ng /mL FGF4 fib rob la st grow th ) fac to r, Sigm a色方法分别检测分化细胞 2A ld rich、5 m g /L 胰岛素 、5 m g /L 转铁蛋 ALB 和 A FP的表达 ,结果显 μ白 、5g /L 硒 、15 %胎牛血清的 MIDM 培养液在 37 ?、 示三维培养和诱导分化 14 d的细胞均表达 ALB、A FP, () 5 % CO条件下加以培养和诱导分化 ,培养液每 3 d更 对照组染色未见表达 ALB、A FP表达 见图 2 。 2 换 1 次 , 2 周后终止细胞培养和分化 。对照组 IMDM 2. 3 分 化 细 胞 AL B、A FP m RNA 的 表 达同 上 以 培养液中不含上述诱导剂 。 ALB、A FP为肝细胞标志物 ,采用 R T2PCR 分别检测分 1. 4 形态观察 定期用立体显微镜观察 ES细胞在 化细胞 ALB mRNA 和 A FP mRNA 的表达 ,结果显示在 三维支架上生长不增殖情况 。同时取培养细胞的三维 用三维支架 培养 和诱 导 ES 细 胞 分 化 的 第 5 天 就 有 支架 , 37 ? PB S清洗 2 次 ,浸入含 0. 1 mmo l /L Ca lce2 A FP mRNA ,第 8 天出现 ALB mRNA ,并持续到三维培 ) (in2AM Do jindo Mo lecu la r Techno logie s公司 的 MIDM 养和诱导分化结束 。对照组未见 ALB mRNA 表达 ,但 () 培养液 , 37 ?孵育 20 m in, PB S清洗 3 次 ,用立体荧光 检测出一定量的 A FP mRNA 见图 3 。 ( )显微镜 SZX12型 , O lymp u s进行活细胞染色观察 。 3 讨论 1. 5 细胞总 RNA 提取与 RT2PC R 检测 按 RN ea sy 干细胞的出现不研究的不断深入和发展 ,为组织 ( ) M in i k it Q iagen 公 司 操 作 说 明 提 取 分 化 细 胞 的 总 工程的研究提供了新的方向 ,这既是组织工程研究的 RNA ,用 Q iagen O neStep R T2PCR k it进行 R T2PCR。引 机遇 ,也是对组织工程研究的挑战 。因为 ,以干细胞为 ( ) ( 物及扩 增 条 件 为 ALB 5 : 白 蛋 白 ′2GCTACGGCA 2 种子细胞 ,理论上讲是使组织工程研究获得了“全能 CA GTGCTTG23 ′, 5 ′2CA GGA TTGCA GACA GA TA GT23 ′;细胞 ”, 从 而 打 破 组 织 工 程 研 究 和 进 一 步 应 用 的 瓶 ) ( 55 ?; 35 循 环 ; 260 bp ; A FP 5 ′2TCGTA TTCCAA 2[ 5 ] 颈 。但由于目前这种全能细胞尚不能有效地特异 CA GGA GG23 , 5 ′2A GGCTTTTGCTTCACCA G23; 55 ?;性 、功能性分化 ,因此 ,用干细胞构建特定的组织器官 β) ( 35 循 环 ; 182 bp ; 2ac tin 5 ′2TTCCTTCTTGGGTA TG2为时尚早 。而构建像肝脏一样的由复合细胞组成的组 55 ?; GAA T23 ′, 5 ′2GA GCAA TGA TCTTGA TCTTC 23 ′; 织器官 ,更需要按需对干细胞进行多途径 、多细胞分化 ) 35循环 ; 200 bp 。技术的出现和成熟 ,同时也需要对不之相匹配的高性 1. 6 免疫荧光染色 终止培养和分化时 ,三维支架及 能生物材料的不断探索和研究 。但毫无疑问 ,干细胞 ( ES细胞 包埋 OCT 液 中 , - 80 ?固 定 , 冰 冻 切 片 15 不生物材料相结合的研究将有助于这一新领域的发展 μ)) (m 。切片用 2. 5 % B SA 牛血清白蛋白 室温下封闭 和最终目标的实现 。非特异 性 抗原 45 m in; 分别 加入 羊抗 鼠白 蛋 白 抗 体 已证实 ,各种干细胞在体外诱导条件下可以分化 ( ) ) ( 1 ?100 B e thyl公司 , 鼠抗人 /鼠 A FP 单克隆抗体() 成肝细胞或类肝细胞 又称肝细胞样细胞 ,如 ES细 ( ) ( ) 1 ?200 R &D System s,室温孵育 60 m in; 滴加连接 胞 、骨髓间充质干细胞 、脐血间充质干细胞 、脂肪间充 ( ) ) (F ITC的相应二抗 1 ?200 , 1 ?400 D ako公司 ,室温孵 [ 6 ] 质干细胞等 。这些实验研究大多是在二维模式下 育 60 m in;荧光显微镜下观察 。每一实验步骤均用含 进行的 ,从组织工程研究的角度讲 ,干细胞在三维状态 1 % B SA 的 PB S清洗 3次 ,阴性对照以 PB S代替一抗 。下向肝 细 胞 的 分 化 对 研 究 组 织 工 程 肝 组 织 更 有 意 [ 7 ] 2 结果义 。本实验在利用 PLLA 2PGA 共聚物和细胞外基质 对 ES细胞进行三维培养的同时 , 使用 DM SO 、地 塞 米 2. 1 三维支架上 ES细胞的培养和生长 采用立体 () 图 1 ES细胞在三维支架上的培养和生长 A: PLLA \ PGA 共聚三维支架 ; B:三维培养 5 d的 ES细胞 褐色 ; C:三维培养 ES细胞 () () 的活细胞染色 绿色荧光 ;图 2 分化细胞的免疫荧光染色 A:阴性对照 ; B:培养 14 d的分化细胞 ALB 染色 绿色荧光 ; C:培养 () 14 d的分化细胞 A FP染色 绿色荧光 ( ) F ig 1 C u lture ES ce lls on three2d im en s iona l sca ffo ld s A: PLLA \ PGA co2po lym e r scaffo ld; B: Grow th of ES ce lls b rownon the 3D ( ) scaffo ld on day 5; C: V iab le ce ll sta in ing of ES ce lls on the 3D scaffo ld green; F ig 2 Imm un ocy tochem istry sta in in g of d ifferen t ia ted ( ) ( ) ce lls A: N ega tive con tro l; B: ALB sta in ing greenof d iffe ren tia ted ce lls on day 14; C: A FP sta in ing greenof d iffe ren tia ted ce lls on day 14 μ; Sca le ba r, 50 m 参考文献 [ 1 ] Fe rreira L S, Ge rech t S, Fu lle r J , e t a l. B ioac tive hyd roge l scaffo ld s fo r con tro llab le vascu la r d iffe ren tia tion of hum an em b ryon ic stem ce lls[ J ]. ( ) B iom ate rials, 2007 , 28 17 : 2706 22717. [ 2 ] Kofid is T, de B ru in JL , Hoyt G, e t a l. M yocard ia l re sto ra tion w ith em 2 b ryon ic stem ce ll b ioa rtific ia l tissue tran sp lan ta tion [ J ]. J H ea rt L ung ( ) Tran sp lan t, 2005 , 24 6 : 737 2744. 图 3 分化细胞的 m RNA 表达 [ 3 ] L im UM , Sidhu KS, Tuch B E. D e riva tion of mo to r neu ron s from th ree F ig 3 m RNA expre ss ion s of d ifferen t ia ted ce lls c lonal hum an em b ryon ic stem cell line s [ J ]. Cu rr N eu rova sc R e s, ( ) 2006 , 3 4 : 281 2288. 松 、H GF、FGF4、胰岛素等诱导剂对 ES细胞进行了肝 [ 4 ] L evenbe rg S, B u rd ick JA , Kraehenbueh l T, e t a l. N eu ro trop h in2in2 细胞分化 ,由肝细胞特征性细胞标志物 ALB、A FP的基 duced d iffe ren tiation of hum an em b ryon ic stem cells on th ree2d im en sion2 因和蛋白表达结果不难看出 , ES细胞在三维培养过程 ( ) al po lym e ric scaffo ld s[ J ]. Tissue Eng, 2005 , 11 3 24 : 506 2512. 中同时实现了肝细胞的分化 。在未用诱导剂的对照组[ 5 ] A ta la A. Tissue enginee ring, stem ce lls and c lon ing: cu rren t concep ts ( ) and changing trend s [ J ]. Exp e rt Op in B io l The r, 2005 , 5 7 : 细胞 , R T2PCR 也检出一定量的 A FP mRNA ,分析可能 TM 879 2892. 不使用由细胞因子作用下制备的 M a trige l有关 。此 [ 6 ] Ca i J , Zhao Y, L iu Y, e t a l. D irected d iffe ren tia tion of hum an em b ry2 外 ,不排除 ES细胞少量自发性肝细胞分化的可能 。 on ic stem cells in to func tional hep atic ce lls[ J ]. H ep a to logy, 2007 , 45 本研究证实了 ES细胞不仅可在聚合三维可降解 ( ) 5 : 1229 21239. 支架材料上培养 ,而且能在生长过程中向肝细胞分化 。 [ 7 ] O ng SY, D a i H , L eong KW. Induc ing hep a tic d iffe ren tia tion of hum an m e senchym a l stem ce lls in p e lle t cu ltu re [ J ]. B iom a te ria ls, 2006 , 27 支架材料上 ES细胞更有效培养 、更高效的特异性肝细 ( ) 22 : 4087 24097. 胞分化及功能性分化有待进一步进行 。