浅论互补式亲和层析纯化制备兔源性抗人精子多克隆抗体标准品

浅论互补式亲和层析纯化制备兔源性抗人精子多克隆抗体品 浅论互补式亲和层析纯化制备兔源性抗人精子多克隆抗体标准品 作者:夏玲芝 沈传来 唐秋莎 谢维 张建琼【摘要】 目的:纯 化制备兔源性抗人精子多克隆抗体标准品。方法:利用人精子抗原及 其他组织蛋白等分别制备亲和层析柱，经正反相互补式亲和层析从兔 抗血清中纯化IgG和IgA型抗人精子多克隆抗体，用SDS PAGE、 Western blot和ELISA等法检测其纯度、特异性和与精子抗原的线 性反应。结果:所得抗体与牛血清白蛋白、正常人全血清、正常人组 织细胞裂解液等在诊断试剂中常有的物质无可见交叉反应，在7.80, 0.488 2ng?ml-1或31.250,1.953ng?ml-1浓度范围内与精子抗原 的酶联吸附试验呈直线反应。结论:该纯化可用于抗精子抗体定 量检测中抗体标准品的制备。 【关键词】 抗精子抗体 定量酶联免 疫吸附试验 亲和层析 Abstract:Objective To prepare purified rabbit anti human sperm polyclonal antibody standard. Methods Three type of affinity chromatography column respectively made from human sperm antigen,normal serum and lysate of normal tissue cells were used to purify the anti sperm polyclonal antibody(IgG and IgA) from rabbit anti human sperm serum.The resulting antibody was further applied to SDS PAGE,western blot and enzyme linked immunoabsorbent assay(ELISA) for determining its purity,specificity and linear reaction with sperm antigen. Results The purified anti sperm antibody shows no detectable cross reaction in western blot with BSA,human serum,lysate of human normal tissue cells which usually existed in immunodiagnostic reagents.At the concentration range of 0.4882–7.80ng?ml,,(for IgG isotype) or 1.953–31.250ng?ml,, (for IgA isotype),the purified antibody reacted in ELISA with sperm antigen in a linear manner. Conclusion The purification schedule is feasible for preparation of antibody standard used in antibody quantitative detection. Key words:anti sperm antibody; quantitative enzyme labeled immunosorbent assay; affinity chromatography 我国不孕育症发生率占已婚夫妇的8%,15%，近20%为免疫性不孕育，其中抗精子抗体的重要致病作用已被大量实验和临床观察所证实,1 5,。存在于男女血清、精浆及宫颈分泌液中的抗精子抗体的浓度高低直接决定着其抗生育效应的强弱，也是疗效观察和预后判断的有效量化指标。因此，抗精子抗体的定量检测对诊断和治疗免疫性不孕育非常重要。然而，由于精子抗原种类繁多，抗精子抗体标准品不易获得，目前我国尚无厂家生产抗精子抗体定量检测试剂盒。大多数医院采用酶标法或金标法试剂盒进行抗精子抗体的定性检测，极少数医院采用昂贵的进口试剂盒进行定量,6 11,。但是这些进口定量试剂盒实际上仍属于半定量的性质，他们都只能以U?ml,1来表示所测抗精子抗体的浓度，而并不能准确说明一个U代表多少质量(ng或pg)的抗精子抗体，而且每家公司各自定义其标准品中抗精子抗体的单位数，互不可比。本研究首次利用高纯度人精子膜抗原等多种蛋白制剂制备互补式亲和层析柱，从经人精子免疫的兔血清中提取纯化出纯度高、与正常人血清蛋白和组织细胞裂解液无交叉反应的高特异性抗人精子多克隆抗体标准品，为进一步纯化人源性抗人精子多克隆抗体标准品奠定了基础，有利于我国抗精子抗体定量检测方法的建立。有关纯化方案已申请国家发明专利。 1 材料与方法 1.1 免疫接种及人精子膜抗原的提取纯化 取精液常规检查为正常的人精液标本(从南京金陵男科医院收集)200 ml，经0.01 mol?L-1 pH 7.4 PBS离心(1 200 r?min-1)洗涤3次，用生理盐水制成精子悬液后常规免疫家兔3次，皮下多点注射，每次1×106，每次接种间隔2周。末次免疫后2周心脏取血，分离兔血清，分装后置-70 ?冰箱保存备用。 人精子膜抗原采用超声波粉碎、NP 40萃取与3种互补式亲和层析柱(A、B、C柱)相结合的新提纯方案而得，经与两种市售ELISA试剂盒比较，阴阳性符合率达100%，且与正常人血清标本无反应，OD值?0.08,,。 1.2 主要试剂 CNBr活化的Sepharose CL 4B、HRP、TMB、DAB(Sigma公司)，DEAE52纤维素、Sephadex G200(Whatman公司)，BCA蛋白定量试剂盒(Bio Rad 公司)，PVDF膜(Millipore公司)，HRP标记的羊抗兔IgG和羊抗兔IgA(北京天坛生物制品股份有限公司)，牛血清白蛋白?(BSA ?)、小牛血清(FCS)(上海伯奥生物科技有限公司)。 1.3 兔血清中总IgG和总IgA的提取纯化,13, 总IgG提取纯化:取免疫兔血清,经常规33%硫酸铵盐析法粗提IgG型免疫球蛋白,透析除盐后再分批过DEAE52纤维素层析柱，用0.01 mol?L-1 pH 7.4 PBS洗脱，收集洗脱液，经聚乙二醇浓缩至2,4 mg?ml-1(BCA法蛋白定量)即为精制总IgG，分装置-70 ?保存备用。所有盐析、透析、层析及离心步骤均在4 ?进行，且下同。总IgA提取:取免疫兔血清加等量0.1 mol?L-1 ZnSO4液，调pH至7.0，搅拌1 h后离心去沉淀，上清中加等量饱和硫酸铵，混匀后4 ?过夜，离心去上清后溶沉淀于10% EDTA Na中，透析除盐后再分批过DEAE52纤维素层析柱，先用0.01 mol?L-1 pH7.4 PBS洗脱并弃洗脱液，再换用0.1 mol?L-1 pH 6.4 PBS洗脱，所收集蛋白峰即为IgA。聚乙二醇浓缩后再过Sephadex G200柱，经0.01 mol?L-1 pH 7.4 PBS洗脱,第一蛋白峰即为精制总IgA，BCA法蛋白定量后分装置-70 ?保存备用。 1.4 亲和层析柱的制备与抗精子抗体的纯化 以下纯化方案已申请国家发明专利(申请号200710190243.6;公告号CN101158681，公告日.04.09):将纯化的人精子抗原2 mg及其他两种组织蛋白各20 ml,分别与溴化氰活化的Sepharose CL 4B偶联成亲和层析D、E和F柱,14,。取从免疫兔血清中提取纯化的总IgG或总IgA，分批过D柱(每次5 mg)，按常规,14,层析，收集与层析柱相结合的蛋白，并立即调整酸性收集液的pH值至7.4。将多批层析所得的收集液合并浓缩后再过E柱，收集不与层析柱结合的蛋白,再过F柱，收集不与层析柱结合的蛋白。聚乙二醇浓缩后经0.01 mol?L-1 pH 7.4 PBS透析过夜即得精制的抗人精子抗体IgG标准品或IgA标准品。BCA法蛋白定量后加适量甘油，分装置-70 ?保存。 1.5 抗精子抗体的纯度鉴定(SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法) 常规制备10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶板。取BSA ?、人全血清、人组织细胞裂解液、纯化的人精子膜抗原和未加甘油的抗精子抗体IgG或IgA纯品,分别加入等量的2×样品缓冲液后煮沸10 min，离心后取上清20 μl上样。连接Bio RAD 200 型电泳仪后于80 V电泳1,2 h，经考马斯亮兰R250染色1 h后脱色过夜。 1.6 抗精子抗体的特异性分析(免疫印迹法) 将800 μg辣根过氧化物酶(HRP)溶于200 μl含200 μg抗精子抗体IgG或IgA纯品的PBS中,缓慢加入1%戊二醛溶液800 μl，室温反应后于4 ?经PBS透析48 h除去游离的戊二醛，置4 ?备用。取人组织细胞裂解液、BSA ?、未婚少女血清和纯化的人精子膜抗原进行10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，经Bio RAD Trans Blot SD型半干转移仪转于PVDF膜上(15 V，35 min)，用2%BSA 5%脱脂奶粉 PBS溶液于4 ? 封闭PVDF膜过夜。取HRP标记的抗精子抗体IgG或IgA溶液与膜杂交(室温反应1 h)，用含0.1%吐温 20的PBS充分洗膜后加DAB底物显色1 min。 1.7 定量酶联免疫吸附实验(定量ELISA) 在酶标条板中加入5 mmol?L-1戊二醛溶液每孔0.2 ml，37 ?反应4 h，用0.01 mol?L-1 pH 7.4 PBS洗涤4次后自然晾干。将纯化的精子膜抗原用pH 9.6的碳酸盐溶液稀释成1,8μg?ml-1，加入上述条板(每孔0.1 ml)，4 ?包被过夜。2%BSA PBS室温封闭条板2 h后用含0.05%吐温 20的PBS洗涤3次，加入倍比稀释于1%BSA PBS中的抗精子抗体IgG或IgA纯品，室温反应1h，同上洗涤后加入HRP标记的羊抗兔IgG或羊抗兔IgA(按厂家说明稀释)，室温30 min后洗涤3次，加TMB底物溶液显色10 min，0.2 mol?L-1硫酸终止显色后于450 nm处测吸光值。另外用少女全血清、人组织细胞裂解液和BSA等液分别包被酶标条板，同上封闭后与纯化的抗精子抗体反应，检测可能存在的非特异性结合或者说ELISA的背景噪音。