【word】 眼镜蛇毒细胞毒素CTXn的致死毒性及药物依赖性研究

【word】 眼镜蛇毒细胞毒素CTXn的致死毒性及药物依赖性研究 眼镜蛇毒细胞毒素CTXn的致死毒性及药 物依赖性研究 蛇志JournalofSNAKE(Science&NAtureareKEytOhealth)2010年第22卷第2期Vo1.22No.2.2010 眼镜蛇毒细胞毒素CTXn的致死毒性及药物依赖性研究 崔超伟,李春霞.,董伟华,孔天翰?. * (I.广州医学院病理生理教研室,广东广州510182,2.南方医科大学珠江医院,广东广州510280) [摘要]目的研究眼镜蛇毒细胞毒素CTXn的致死毒性和药物依赖性,评价其安全性.方法检测CTXn 的LDs.和对肝细胞色素P450含量的影响,采用大鼠催促戒断模型,自然戒断模型及大鼠条件性位置偏爱模型 检测CTXn的药物依赖性.结果CTXn的LD5o为19.61mg/kg,长期给药对肝细胞色素P450含量无影响. 在催促戒断试验中,大鼠连续腹腔注射不同剂量CTXn(0.5,1.0,2.0mg/kg)10天后经纳洛酮催促,未出现戒 断症状及体重下降现象I在大鼠自然戒断试验中.CTXn连续给药21天.停药后大鼠没有出现戒断反应及体重 下降现象,在大鼠条件性位置偏爱试验中,CTXn不同剂量组分别连 续用药15天后,大鼠在伴药盒的逗留时间 均无明显延长,不形成条件性位置偏爱.蛄论CTXn毒性较小,长期给 药对肝脏药物代谢功能无影响.且 不具有身体依赖性及精神依赖性.有潜在的药物开发价值. [关键词]CTXn;戒断I身体依赖性l精神依赖性 [中圈分类号]R996.3[文献标识码]A[文章编 号]1001--5639(2010)02--0085—05 Studiesonlethaltoxicityanddrugdependenceof CTXnfromNajaatravenom CUIChao-wei,LIChun-xia.,DONGWei—hua,KONGTian—han (1.DepartmentofPathophysiol0gy,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou,Guangdong,510182,ChinaI 2.ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong,510280,China) Abstract:ObjectiveToinvestigatethelethaltoxicityanddrugdependenceofCTXnfrom Najaatravenomandevaluateitsdrugsafety.MethodsTheLD5oofCTXnandtheeffects ofCTXnoncytochromeP450weredetectedrespectively.Meanwhile,thenaloxoneprecipitated withdrawaltestinmorphinedependentrats,thespontaneouswithdrawaltestinratsandthe conditionedplacepreferencetestinratswereusedinthisstudytodetectthedependencesof CTXn.ResultsTheLD5oofCTXninmicewasabout19.61mg/kg.Prolongedadministra— tionwithCTXn(2.0mg/kg.i.P.)didnotaffectthelivercytochromeP450contents.Inthe naloxoneprecipitatedwithdrawaltests,afterintraperitoneallyCTXnat0.5,1.0,2.0mg/kgfor 10dayscontinuously,theratsdidntshowanywithdrawalsymptomsorthelossofbody weight.Inthespontaneouswithdrawalassay,withtheCTXncontinuouslygivenfor21days, thephysicalsignsofwithdrawalandthelossofbodyweightwerenotfoundinratsafterdrug withdrawa1.Intheconditionedplacepreferenceassay,thetimeofstayinginthedrug—paircom— partmentwasntsignificantlyextendedandplacepreferenceeffectwasntdevelopedinthe CTXntreatedrats.ConclusionCTXnhasthelowtoxicityandnoobviousinfluenceonthe functionofliver.CTXndoesn’tinducethephysicalorpsychologicaldependenceinratsinthis research,whichsuggeststhatCTXnmaybehasgreatpotentialvaluefordruge xploitation. Keywords:CTXn;Withdrawalsyndrome;Physicaldependence;Psycholog icaldependence *基金项目t广东省自然科学基金资助项目(No.204102537) **通讯作者 85 蛇志JournalofSNAKE(Science&NAtureareKEytohealth)2010年第22卷第2期Vo1.22No.2,2010 蛇毒是由蛋白质,多肽,酶类和其他小分子物质 组成的混合物.眼镜蛇毒细胞毒素在眼镜蛇毒中含 量极为丰富,约占粗毒的3O,5O.心脏毒素具 有心脏毒性?,细胞凋亡扪,抗肿瘤.和膜去极化’] 等广泛的生物活性.CTXn属蛇毒细胞毒素的一 种,是由6O个氨基酸组成的生物小分子多肽.本实 验对CTXn毒性及是否具有药物依赖性作了研究, 为进一步的药理研究提供实验依据. 1材料与方法 1.1动物Sprague-Dawley大鼠(180,200g, SPF级,动物合格证号:2004-0011)和昆明小鼠(18 , 22g,SPF级,动物合格证号:2004—0021),由中山 大学实验动物中心提供. 1.2药品眼镜蛇毒细胞毒素CTXn,纯度> 97%,由广州医学院病理生理教研室提供;盐酸吗 啡,购自青海制药厂;盐酸纳洛酮注射液,购自北京 四环医药科技股份有限公司. 1.3实验方法 1.3.1LD.测定依据文献[5]方法进行测定 CTXn的LD5..取小鼠5O只,随机分为5组,每组 l0只.通过预实验确定100致死量为2.56mg/ kg,o致死量为1.28mg/kg.由2.56mg/kg开 始,药物浓度依次稀释0.84倍,共5个浓度梯度. 每组小鼠对应一个浓度进行腹腔注射给药,给药后 观察48h,小鼠死亡时间和中毒症状.根据 Bliss法计算小鼠腹腔给药的LD.及95的可信 限. 1.3.2肝细胞色素P450检测将大鼠随机分为 蛇毒组和生理盐水对照组,蛇毒组大鼠于腹腔注射 CTXn(2.0mg/kg),每天2次,连续给药1O天.对 照组大鼠于腹腔注射等体积的生理盐水,给药时间 同蛇毒组.第10天给药后,将动物拉颈椎处死,取 出肝脏,立即置于冰冷的1.15KC1的磷酸盐缓冲 液(O.01mol/L,pH7.4)中清洗,剪碎,清洗至无血 色;用上述缓冲液洗2次,充分去除肝脏血液.按每 克肝加3ml缓冲液的比例加入1.15KCI的磷酸 缓冲液,用组织匀浆机在冰浴中制成匀浆.4?下 10000r离心20rain,上清液100000r离心6Orain, 沉淀用0.1mmol/LTris—HC1缓冲液(pH----7.4)悬 浮均匀,保存于一7O?.依据Omura和Sato方 法[6],将肝微粒体样品用Tris—HCl缓冲液稀释至 0.3,0.5mg/ml,对样品池加人少量Na2S2O,通 C0气体3Os,记录450D-In和490nm波长处的吸 收度,计算P450的含量. 86 1.3.3大鼠催促戒断实验将大鼠随机分为 CTXn低(0.5mg/kg),中(1.0mg/kg),高(2.0 mg/kg)剂量组,吗啡组和生理盐水对照组,每组lO 只大鼠.CTXn低,中,高剂量组按0.5,1.0,2.0 mg/kg的剂量分别于大鼠腹腔注射给药,每天2次 (8:00和20:o0各1次),连续给药1O天.吗啡组 采用递增给药法于大鼠腹腔注射盐酸吗啡,按剂量 递增原则给药,即吗啡的给药剂量从每次5mg/kg 开始,每天依次增加5mg/kg,增至第1O天剂量为 5Omg/kg.生理盐水组大鼠每天于大鼠腹腔注射 同等体积生理盐水.生理盐水组和吗啡组给药时间 及次数同CTXn组.第lO天于8:00给药1次,给 药后2h于大鼠腹腔注射纳洛酮3mg/kg催促.观 察记录各组大鼠的戒断症状并评分.戒断症状包括 可数和不可数症状.可数症状包括齿颤,吞咽,站 立,跳跃,湿狗样抖,伸展,清理皮毛,上眼睑下垂,记 录出现的次数.不可数症状包括流涎,腹泻.按照 Maldonado等[7]戒断症状评分评定,见表1. 表1各组大鼠催促戒断反应分值比较 戒断症状._i————望翥垡I一— 1.3.4大鼠自然戒断实验[8将大鼠随机分为 CTXn低,中,高剂量(O.5,1.0,2.0mg/kg)组,吗 啡组和生理盐水对照组,每组8只大鼠.各蛇毒组 于大鼠腹腔注射CTXn(0.5,1.0,2.0mg/kg),每天 2次,连续给药21天.吗啡组的给药起始剂量为5 mg/kg,每天递增5mg/kg.连续7天;从第8天开 始,剂量递增为10mg/kg,11mg/kg,12mg/kg,各 3天;最后4天剂量为16mg/kg.生理盐水对照组 每天给予等体积生理盐水,连续21天.第22天各 组大鼠停止给药,观察7天,每天称体重. 1.3.5条件性位置偏爱(CPP)实验参照文献[9 的方法,采用上海吉量软件科技有限公司开发的位 置偏爱箱及其吉量软件进行.取大鼠5O只,随机分 为生理盐水对照组,吗啡组(5.0mg/kg,腹腔注射) 蛇志JournalofSNAKE(Science&NAtureareKEytOhealth)2010年 第22卷第2期Vo1.22No.2.2010 及CTXn0.5,1.0,2.0mg/kg剂量组,每组10只大 鼠.各组大鼠每天给药2次,给药间隔8h.记录大 鼠在黑白箱的停留时间,活动距离及两箱之间的穿 梭次数,运动轨迹等,周期为15天. 测试方法:(1)训练前阶段.正式实验前2天及 实验第1天抽离中间隔板,将大鼠置于中间通道处, 自由活动15min.因大鼠天性偏爱黑箱,故选择白 箱为伴药箱.记录大鼠在黑白箱的停留时间.(2) 条件化训练阶段.第2,14天放置中间隔板,隔离 黑箱和白箱.每次训练大鼠45min,均在9:00, 17:O0之间完成.大鼠腹腔注射吗啡或CTXn后即 刻放人白箱,生理盐水组注射生理盐水后放人黑箱. (3)测试阶段.第l5天抽离中间隔板,每只动物放 于中间通道处,自由活动15min,记录大鼠在黑白 箱的停留时间.整个试验过程中保证箱内光线,色 调,气味等环境条件一致. 2结果 2.1LD?测定根据Bliss法测定结果,小鼠腹腔 注射CTXn的LD5.为19.61mg/kg,其95的可信 限为17.74,21.839mg/kg. 2.2肝细胞色素P450检测大鼠肝细胞色素 P450的含量测定,蛇毒组为(0.61?0.儿)nmol/ mg;生理盐水对照组为(O.54?0.07)nmol/mg,两 组比较无显着性差异.说明长期给予CTXn对动 物肝脏的药物代谢功能并无影响. 2.3大鼠催促戒断实验在大鼠催促戒断实验中, 经纳洛酮催促后,吗啡组大鼠的戒断症状分值和体 重下降百分率均明显高于生理盐水对照组,表明吗 啡组大鼠已经形成明显的身体依赖.而CTXn不 同剂量组的大鼠戒断症状分值及体重变化百分率与 生理盐水对照组相比均无明显差异(P>0.05).见 表2. 表2各组大鼠催促戒断反应分值比较(H=10.士s) 注:与生理盐水组比较,*:P<0.01. 2.4大鼠自然戒断实验吗啡组大鼠连续用药21 天,停药后戒断症状明显,体重显着下降.体重下降 百分率明显高于生理盐水对照组(P<O.01).不同 剂量CTXn(O.5,1.0,2.0mg/kg,腹腔注射)组的大 鼠停药后无明显戒断反应,体重无下降,与生理盐水 组相比无明显差异.见表3. 表3各组大鼠自然戒断时体重变化百分率(n--8.士s) 组别体重(g) 1天3天5天7天 CTXa低剂量组 CTXn中剂量组 CTXn高剂量组 吗啡组 生理盐水组 2.2士0.7 1.9士0.4 2.3士1.0 — 3.7士1.2. 2.1土0.6 3.6士0.6 3.9士0.9 4.1?1.3 — 6.1士2.3’ 3.8士1.1 5.7士1.2 6.5士1.4 6.8士1.7 — 4.6士1.1. 6.2士1.2 8.5士1.8 9.2士2.6 8.9土2.2 — 1.1土0.4’ 8.7?2.3 注:与生理盐水组比较.*:P<0.01. 2.5条件性位置偏爱(CPP)实验吗啡组大鼠用 药14天后在伴药箱的逗留时间明显较给药前延长 (P<O.01);与生理盐水组相比逗留时间也显着延 长(P<O.01).表明吗啡诱导大鼠产生了位置偏爱 效应.CTXn不同剂量(0.5,1.0,2.0mg/kg,腹腔 注射)组分别给药14天后,大鼠在伴药箱的逗留时 间与给药前比较均无明显延长(P>0.05);与生理 盐水组相比亦无显着性差异(P>0.05).表明大鼠 对CTXn没有产生位置偏爱效应.见表4. 表4各组大鼠条件性位置偏爱实验(n=10.士s) 组别大鼠在伴药箱(自箱)逗留时间(s) 注:与生理盐水组比较,*:P<O.Ol;与同组给药前比 较.?:P<0.01. 87 蛇志JournalofSNAKE(Science8LNAtureareKEytohealth)2010年第22 卷第2期Vo1.22No.2,2010 3讨论 蛇毒成分主要包括神经毒素,细胞毒素和 PLA2.神经毒素毒性大,LDs.为2.22mg/kg左 右[10],是蛇毒中的主要毒性成分.细胞毒素的毒性 相对较小,药用开发潜力较大,所以蛇毒研究的重点 渐转向细胞毒素. 蛇毒具有广泛的生物学活性,在抗肿瘤[1h挖],镇 痛,1G,止血及抗血栓等方面具有很大的药用 价值.在药物研究应用中,药物的毒性和药物依赖 性涉及到用药安全,是首要考虑的问题.本实验结 果显示,小鼠腹腔注射CTXn的LD5o为19.61mg/ kg,其毒性仅为眼镜蛇毒神经毒素的1/10..肝微粒 体细胞色素P450是药物代谢中最重要的酶系,参与 大量的外源性物质(药物,化学物质,致癌物质等)和 内源性物质(类固醇激素,维生素D,胆酸等)的代谢 过程].本实验中腹腔注射给予CTXn10天,肝细 胞色素P450的含量无明显变化,说明CTXn对肝脏 的药物代谢无不良影响. 药物依赖性是药物作用于机体而引起机体的精 神方面和躯体方面的改变,主要包括生理依赖(躯体 依赖性)和心理依赖(精神依赖性).本实验采用目 前较为常用的评价药物依赖性的动物实验方法—— 大鼠催促戒断,自然戒断模型和条件性位置偏爱实 验来评价CTXn的身体依赖性及精神依赖性.在大 鼠催促戒断试验中,纳洛酮的催促拮抗作用使吗啡 依赖大鼠出现明显的戒断症状,但CTXn组大鼠则 没有出现戒断反应.体重下降是阿片类药物成瘾及 戒断的一个重要指征.吗啡依赖大鼠在催促戒断及 自然戒断过程中均伴随有明显的体重下降,CTXn 组大鼠则未发现明显的体重下降.这些结果说明 CTXn不会导致身体依赖的产生.评价药物精神依 赖常用的是条件性位置偏爱试验(CPP),本实验条 件性位置偏爱试验结果表明,CTXn本身并无使大 鼠产生奖赏效应,大鼠对CTXn不产生位置偏爱效 应,提示CTXn无精神依赖性. 在药物研究中,药物的安全性是考虑的首要因 素.在蛇毒成分中,CTXn毒性相对较小,对肝脏的 药物代谢无明显影响,且长期应用不会产生药物依 赖性,是具有研究潜力的蛇毒多肽. 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