乳酸菌重组血红素加氧酶1对肠道的保护作用(可编辑)

乳酸菌重组血红素加氧酶1对肠道的保护作用(可编辑) 乳酸菌重组血红素加氧酶1对肠道的保护作用 南京医科大学 博士学位论文 乳酸菌重组血红素加氧酶-1对肠道的保护作用 姓名:庞庆丰 申请学位级别:博士 专业:药理学 指导教师:胡刚 20080501南京医科大学博士学位论文 英文缩略词表 英文缩写 英文全称 中文名称 中父名称 . 血红素加氧酶. 一 乳酸乳球菌谷氨酰胺 锌原卟啉 口 髓过氧化物酶 一仅 肿瘤坏死因子.仅 . . 白细胞介素. 全身炎症反应综合征 巧 多器官功能不全综合 征 磷酸盐缓冲液 十二烷基硫酸钠 光密度细菌移位 平均动脉压 南京医科大学博士学位论文 论文独创性声明 本论文塾堕董重组垒丝盍垄氢堕二壁堑道堡堑笠旦是我个人在 导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加 以标注和致谢的地方外,不包含其他人或机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均在论文中作了 明确的声明并表示了谢意。 作者签名: 专业:彗至鳗 日期: 竺星:』:仝 趁叁客 论文使用授权声明 本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定, 即:学校有权保留送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅;学 校可以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其它复 制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 导师签名: 作者签名:垄羔攫至南京医科大学博士学位论文 .主塞擅璺 乳酸菌重组血红素加氧睁对肠道保护作用 专业:药堡堂 研究生:庭廛主 导师:翅 刚熬援 临床上多种原因尤其是休克和内毒素血症可以导致肠粘膜屏障 功能下降,肠腔内大量细菌或内毒素向肠腔外迁移,即发生内毒素 和细菌移位 ,,继而导致多种炎症介质的 过度释放,成为系统性炎症反应综合征,和多器官功能不全综合征 ,的“发动机。所以,如何保护肠粘膜 屏障功能成为当前研究的一项重要课题。 益生茵是指能在生物体内存活,对生物体的健康有 益的一类微生物。近年研究表明,益生茵能够纠正肠道微生态失衡, 维持肠道屏障功能和减少内源性感染。然而,单一应用益生菌尚不 足以防止严重感染、创伤、休克等所致的肠粘膜屏障功能的破坏。 血红素加氧酶 是血红素分解代谢的限速酶,现已 发现种同工酶:.、一和.,其中只有.是诱导型 酶,而肠道.的诱导表达对于其屏障功能具有显著的保护作用。 因此,本研究克隆大鼠.基因;以人类肠道有益茵群乳酸乳 球菌为载体,构建能够表达具有生物活性.的重组乳酸乳球菌 ;然后观察重组乳酸乳球菌对失血性休克和内 毒素血症大鼠肠道屏障的保护效果,从而为保护肠粘膜屏障功能 提 供新思路。 第一部分大鼠血红素加氧酶一基因在乳酸乳球菌中的表达 目 的: 在乳酸乳球菌中表达大鼠血红素加氧酶一基因。 方法:采用?技术从大鼠脾总中分离扩增血红南京医科大学博士 学位论文 素加氧酶一基因,将该基因克隆进. 质粒中,转化 大肠杆菌提取质粒,鉴定.基因。酶切后与质粒连 接,经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌中,转化子 在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养。用乳链菌肽诱导.表 达,?、 鉴定表达产物,并采用分光光度法测 定一活性。 结 果:表达产物相对分子量约为 ,表达量约为. /, 活性为. //。 结论: 乳酸乳球菌能够表达具有生物活性的大鼠.。 第二部分灌胃后重组血红素加氧酶一在大鼠肠道的表达情 况 目 的:?.灌胃后重组.在大鼠肠道的表达情况。 方法:制备悬液和乳酸乳球菌悬液; 然后通过不同剂量和不同次数灌胃;在规定时间取回肠组织;采 用 酶联免疫吸附法和免疫组化法回肠组织的含量。 结 果:倍、倍?.组重组.含量比倍组高.; ?.连续灌胃天、天组重组一含量比天组高.。 结论:..在肠道原位分泌重组一的情况非常复杂。单 纯增加.一灌胃剂量和次数不能有效增加回肠中.的含量,反 而使回肠中.的含量降低。 第三部分乳酸乳球茵重组对失血性休克大鼠肠道屏障的保 护作用 目 的:重组.对失血性休克大鼠肠道屏障的保护效果。 方 法:将健康、清洁级、雄?大鼠随机分为组: 假手术组 :大鼠只进行右股动脉分离和插管; ..茵液 ..熏:连续每天一次灌注活菌数达.× 天.,然后复制失血性休克模型复制;组:连续每天一次灌注 活菌数达.× 菌液;,然后复制失血性休克模型; 南京医科大学博士学位论文 .? .一组:连续每天一次灌注活菌数达. 菌液天.;在复制失血性休克模型前小时皮下注射锌原卟啉 ,.‘;谷氨酰胺组,: 连续每天一次灌胃. 天。复制失血性休 .蚝~、溶解于的 克模型,在液体复苏据取材,比较各组动物的休克复苏过程中平 均 动脉压、细菌移位、回肠组织的髓过氧化酶活性及一、 肿瘤坏死因子一【和白介素.的含量,并行回肠组织病理学检查。 结 果:与组比较,..组的’评分、细菌移位发生 率、活性、肿瘤坏死因子一含量明显降低尸.;而一、 一含量和明显增加尸.。..对失血性休克肠黏膜 屏障的保护作用可以被一特异性拮抗剂锌原卟啉取消。 结 论:乳酸乳球菌重组.对失血性休克大鼠能够较好的保 护肠黏膜屏障,可以明显减轻肠道炎症反应和细菌移位的发生 率。 第四部分乳酸乳球菌重组血红素加氧酶一对内毒素血症大鼠 肠道的保护作用 目 的:观察乳酸乳球菌重组血红素加氧酶.对内毒素血症大 鼠肠道症反应及肠黏膜屏障的保护效应。 方 法:按随机数字表法将只健康清洁级雄性大鼠分为 组:.一组、组、、.一组。分别给予 携带一基因的乳酸乳球菌、乳酸乳球菌或谷氨酰胺,每日一次, 共四次。第四天腹腔内注射内毒素,其中锌原卟啉于腹腔内注射 内 毒素前静脉注射,小时后取末端回肠。比较各组动物的死亡率, 检查肠组织病理学变化,并检测肠组织髓过氧化物酶活性、肿瘤 坏 死因子.【、白细胞介素一和血红素加氧酶一的含量。另取只健 康清洁级雄性大鼠同样分为四组,经过相应的处理后,观察其 小时的生存率。 结 果:与。。组比较,..组和组的生 存率均明显升高.;与..组、组比较, .一组和组的’评分.和肠组织活性 南京医科大学博士学位论文 明显降低.,肠组织.【的含量明显减低., .的含量却显著的升高.,.的含量明显增加 尸.。 结论:乳酸乳球菌重组血红素加氧酶一能明显减轻肠道炎症 反应;有较好的肠粘膜保护作用。 结 论 、重组血红素加氧酶.乳酸乳球菌能够表达具有生物活性的重组 .. 、..在肠道原位分泌重组一的情况非常复杂。单纯增加 ?一灌胃剂量和次数不能有效增加回肠中.的含量,反而 使回肠中.的含量降低。 、乳酸乳球菌重组.对失血性休克大鼠能够较好的保护肠黏膜屏 障,可以明显减轻肠道炎症反应和细菌移位的发生率。 、乳酸乳球菌重组血红素加氧酶.能明显减轻肠道炎症反应;有较 好的肠粘膜保护作用。 关键词:血红素加氧酶一;乳酸乳球菌;回肠;内毒素血症;失血 性休克;细菌移位南京医科大学博士学位论文? :,,...............................................?. ..::,. ? .‘‘ ”. . .., , . . ? , 一,一 一, ., 一 ., ,南京医科大学博士学位论文一. . . 一 三 一 :. . : , . 一.. . 一. , ‘.:, ./. . //. 一 :.’.一 一 :。 . . 南京医科大学博士学位论文:. . 一 . :一 曲 ; 尸.. . : 一. 一: , , 一 . :.一一 . ,., , , ’, , ,. 盯一【 一 ?? : 南京医科大学博士学位论文 一一一。????????????????????????????????????????????一 一 ..吕.一, ?一 池. . . ., ,一仅 ’ , , . .一 . : ...一 : :.? ,?一 , , 一:。./..一,?/ ..‘ .~.,.. ., . , , , .,., . .~?一,, . , 南京医科大学博士学位论文 . . : 一 . ’ , ? 一 , . 一 , ?. : .. . ? .? . . . ??. ?? . .?? . . : 一; ; ; ;; ; .南京医科大学博士学位论文 乳酸菌重组血红素加氧睁对肠道的保护作用 前言 肠道功能障碍是导致全身炎性反应综合征 ,、多器官功能障碍综合征,甚至多器官功能衰竭 ,的一个重要因素【。近年来,肠道功能已成为判断危重 患者预后的一个重要指标。肠道不仅是的靶器官,更是 的启动者【。因此,对肠屏障功能衰竭的防治研究已成为前医学 领域研究的一个重要课题。 健康个体肠道中拥有数量极大的菌群,肠道菌群的平衡对机体起 到良好的保护作用。机体免疫系统可识别病原体和非病原体所表达的 独特分子结构。抗原提呈细胞如树突样细胞能将细菌和其他抗原提呈 至肠黏膜进行取样,激活原始细胞并诱导其分化,产生一系列细胞 因子,刺激分泌,进而决定免疫反应的程度及耐受性【】然而各 种病理因素如饥饿、营养不良、严重感染、烧伤、休克、严重创伤、 急性胰腺炎、梗阻性黄疽、长期全肠外营养、化疗及放疗等能破坏肠 道菌群平衡,诱发肠黏膜损伤【,】。 各种病理情况可以引起肠道菌群失调。具体表现为:正常肠道原 籍常住、优势、有益菌群如双歧杆菌、类杆菌、优杆菌和消化球菌、 乳酸杆菌等生长被抑制,特别是危重症患者,有时可丧失整个乳酸菌 群;而致病菌群如葡萄球菌、艰难梭菌、变形杆菌、绿脓杆菌、白色 念珠菌、大肠杆菌等大量生长,产生大量内毒素,形成体内最大的细 菌和内毒素贮藏库【】另外,危重症患者由于疾病和营养物质缺 乏, 其黏膜表面酸碱度、氧化状态、渗透压及各种激素水平发生急剧变化, 往往会反过来加重病情。因为结肠拥有很多神经末梢,在应激情况下, 肠腔内去甲’肾上腺素的增加可诱发肠腔细菌毒力增加【。一些正常情 况下的惰性定植菌,在应激条件下能改变其表型,可成为能释放各种 毒素的致病菌。南京医科大学博士学位论文 肠道屏障功能损伤后,肠黏膜通透性增高,大量的内毒素和细菌 , 持续泄漏,即可发生内毒素血症和细菌移位 。进入体内的内毒素和细菌可以广泛激活各种炎症细胞如肝脏 细胞。从而释放大量炎症细胞因子,其中.圾细胞间粘附 因子.在介导的病理过程中起关键性作用【。各种炎症介质 大量释放及补体旁路激活,致使机体的促炎介质和抗炎介质失去平 衡,从而产生一系列连锁级联反应或瀑布效应 ,广泛 地损伤重要脏器的微循环内皮细胞引起全身器官功能损害,最终结果 演变为。因而如何维持肠道菌群平衡、减少疾病状态下肠道致 病菌的生长和繁殖是治疗各种危重病的关键环节。 显然,及时补充含有多种肠道益生菌的微生态制剂是预防和治疗 肠道菌群失调的一个重要方法。益生菌,又称“益生素或 “益生剂,主要是指通过调整宿主肠道微生物群生态平衡而发挥生理 作用的微生物制剂。益生菌能通过宿主消化道屏障而存活下来,并能 定植在宿主消化道而发挥相当的生理作用。近年研究发现,补充益生 菌不仅能直接胃肠道中益生菌的数量,还能提高消化道内其他有益菌 的数量和活性。益生菌不仅具有广谱抗菌活性等【】研究还发现 益生菌可抑制肠道炎症反应而产生粘膜屏障的保护作用;而且可以阻 止条件致病菌多为。杆菌与球菌对肠粘膜的粘附和定植。因此,应 用益生菌活菌制剂是防止细菌或和内毒素移位进而发生肠源性感染 。。 的重要手段【 近年来,国内、外研制出多种益生菌活菌制剂。目前应用于人体 的有双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、蜡样芽孢 杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和酵母菌等【】。在围手术期给予重大 手术患者益生菌和纤维素能有效降低术后感染并发症的发生率【】。但 尽管益生菌活菌制剂是临床上治疗肠道菌群失调的一个重要方法,单 一应用益生菌尚不足以完全防止严重感染、创伤、休克等所致的细菌 移位。因此很有必要进一步提高益生茵活茵制剂的疗效【】。 随着分子生物技术的发展,益生菌尤其是乳酸茵蛋白表达技术的 成熟,益生菌相关研究重点已从单纯的功效研究逐步发展到了基因工 程益生菌株的构建和功能研究,即从不同种的生物胃肠道的不同部位 南京医科大学博士学位论文 分离乳酸菌,进行转化,筛选并改造成可作为分子克隆的受体 茵。从乳酸菌中提取拷贝数高、分子量小的质粒,作为复制子,构建 食品级高表达的分泌载体。用此克隆系统,把有益于人和动物的外源 基因,如某些营养物质各种必须氨基酸、维生素等、保健和治病的 药物如抗癌药物、防衰老药物、避孕药物、各种免疫源和有关的酶 类、生长发育的激素如促乳素、生长素等等基因导入这种茵中, 然后制成活菌制剂,需要时口服或饲喂,引入人体和动物体内定植或 短暂定植,产生机体所需的外源基因的产物【,。这种重组基因工 程菌,集菌体本身牙口有益基因于一体,既可加强营养,也可防病治病, 促进人体生长发育或禽畜生长增重。假定把必须氨基酸的基因在菌中 克隆,让其在体内产生相应的必需氧基酸,必需氨基酸有可能变成非 必需氨基酸。这样就使乳酸菌如虎添翼,发挥更大的作用。它的最大 优点在于:乳酸菌食品级基因表达系统中的载体、受体及诱导物均为 食品级,可直接制成口服制剂,免去一般基因菌所需的繁琐、复杂 的后提取工艺,为基因工程生产安全、廉价的生物制品开辟新途径。 所以,食品级的乳酸菌工程菌本身及其表达产物可直接应用于食品工 业、医药工业和保健业等领域,有其巨大的应用前景和潜在的商业价 值【。】。 乳酸菌广泛应用于食品和工业发酵中,是人类及哺乳动物的益生 菌。最近十年来随着乳酸菌表达调控元件的分离,相继发展了一批适 用于乳酸菌的克隆载体、表达载体和整合载体,乳酸菌食品级高效表 达系统的构建及应用已成为研究的热点【。目前最有效的食品级诱导 . 表达系统是启动子控制的食品级基因表达系统 ,。。乳酸菌系统是在乳链菌肽诱导 下由启动子控制目的基因表达的、和的两组分调节 系统的高效诱导表达系统。该基因表达系统具有以下突出的优点:、 乳链菌肽是一个理想的食品级诱导分子,它高效安全无毒,能直接用 于食品中;、可使用染色体上 缺失并含 基因的乳酸球 菌菌株以及含有启动子控制之下目的基因和基因的质粒 【,用食品级选择标 替代抗生素抗性基因,以互补染色体上 的 缺失【。这样不仅构建了稳定的完全的食品级表达系统,而南京医科大学博士学位论文 且采用诱导型表达替代原来的组成型表达,使细菌生长与外源基因的 表达分为两阶段,减轻了宿主细胞的代谢负荷鲫;、由于生产乳链 菌肽的菌株的稀释的上清液即可用作诱导剂,所以生产乳链菌肽的菌 株可以包含在发酵液中,并可简单地加入小量的乳链菌肽来进行诱 导,而别的起始培养细菌不会遭受亚抑制量乳链菌肽的损害。随着一 些乳链菌肽突变体的构建成功,甚至可用比野生型菌株所需的更低浓 度的乳链菌肽作为诱导剂【跚;、工艺上具有可控性强,并可以达到 极高的蛋白表达水平。根据加入的乳链菌肽的量,最终蛋白质生产可 达到%细胞内蛋白质水平,表达水平可控制在,倍的动力范围 之内,在此范围内诱导浓度和蛋白质生产水平之间有线性剂量反应关 系【’;、目的基因的表达十分严谨,在未诱导状态时,目的基因表达 处于不可检测的蛋白水平;可以用于表达毒素蛋白【,;、目的蛋 白表达数量多,在加入诱导物.乳链菌肽烈后其诱导效率可达, 倍以上。因此,该系统是可控制的蛋白质生产的最理想的系统, 同时因其良好的安全性,在工业生产中具有很大的发展潜力【’。 自从年起,利用启动子和、基因构建的 一系列表达载体和相应的宿主茵始用于目的基因的表达以来,多种 高度复杂的食品级基因表达系统正在乳酸菌中建立起来表。同 时利用这些基因表达系统已经成功表达多种蛋白表。这些研究 成果显示了表达在今后的基因工程领域中的巨大潜力和优势。 在众多研究防治肠道损伤的药物靶标中,血红素加氧酶 ,的作用日益受到关注。是血红素分解代谢的限速 酶,能催化血红素在机体内氧化降解,生成胆绿素、和【‘。 哺乳动物体内的胆绿素还能在胆绿素还原酶的作用下还原为胆红素。 现已发现种同工酶:?、.、.。其中,只有.是诱 导型酶,并且人们对它的结构和功能研究得最多。最初认为.的 作用仅限于催化血红素氧化降解,保持体内血红素的平衡。近年的研 究发现,血红素分解产物中的胆绿素和等不只是作为废物排泄, 而且在生物体内还具有重要的生理作用:胆绿素、胆红素是体内 有效 的抗氧化剂, 是机体内源,生的主要来源,具有扩张血管和 抗血小板聚集的特性,可维持微循环【绷;亚铁能诱导铁蛋白的表 达, 南京医科大学博士学位论文 .描述 食品级载体菌移?属 参考文献 ?? ,竹、 叠一九.船‘‘卅‘埔 鞑,掣帅 ?‘四棚 曹“, ?‘’ 趣~“?口‘坤 ‘ 矾?.. ?翻四’’枷‘,佃?‘ ??’口由”月? 岍.小’ ?瑚‘?嶂 ’ . ?“??. 硼 ‘‘?,’口四?‘抽 ,‘啉?“? .’ ?‘??甜雌 ?峙~’、?‘ 冉.:“ ’?” “口甜““恤 ““科.. ‘,埔哪.’ ~?‘“蜘’ 刮建 抽如碰叼州口一 , 蠊般‘ ‘““.. 托,‘。口 ‘。删??? 耐亡.’‘’?, ??齄一打??“,埘 ...御‘.‘??‘’鲥府”轴,坩’如?, 删州廿? ., 。“茹裂。一一黧舞冀箸 ?蝴,四 ~. 一口啦”钿,忆 ‘州’什如甜,.啦.附 ,.“? 拶??枷以执笮,用?,埘, 懒? .: 却毋‘鲥 舶,”“?浅“’?‘?岫呻嶂四钾刊“? ?‘一.?埘 ?咖?舯一? ,‘“?融?口 . ?“ ??洲竹札呻憎删’吖抽砷嚏?鼬嘲鲫捌时尊 删埘. 戤四% 怖,.”似甲 描帅’,“叫.. ‘, : ““ ‘,‘灌~ 饿“愀抽 ?栅 ?螂, 忡?“? “口??’咐”』?“咖,‘,,付删?雌 ‘”? 凡?’’?‘?’~?‘埘.一,以一打妇“~甜 丑.四’?,,,,,. ??‘?’‘埘~州岬 ‘?《自呲,柚”? ,,“矗” ,;口‘州 删.‘?四 口枘 ‘口‘‘, 喇嚏日口一?哪 ??’ 厶“目岬托 ,州 ‘:啊.. ?“?? 钮删 ,?埘,“州枷:删 ?, . ’?‘嘲如“,. 撕‘畸“ 时静舶 眦?时 墨删知刊蛔?错 ‘‘叩一一 一,“..;口,“口 ?譬?硼?,嘲”“,婚 .‘,:?~’删?.: 俐埘靳龇‘抑. :??蛔“ ‘对啪?’?吣 四?‘..,堪“ ‘ “四“ 日 ‘? ?““..”?“,‘?~ .’ 棚埔岫?蚺 犍’ ‘,枷,? ?巾” ??廿, 弗川 ?四啊??卅 口 ’??,??“.. ,船., 、, ”’“’ .‘’ 栅 ’“??..” 舳捌瞄“喇饼? 籼?埘..甜’ 一?’“帅冉删州‘ ? ‘:?. 砷协“ ??时‘并口 州 ??‘,女 ‘札. , ‘ 口自?? ’ 四?‘?’‘?虮啊“一 ?? ,日?‘咖,期憎博,荆‘埘 ?口?.., 驴扣岬 ‘、?坤口一?喇,扣,,,丘,? ‘?,“???帆?。, 竺竺苎芝竺::兰型坐墅竺些丝生竺垫 苎兰竺竺登苎竺竺:墨兰 兰 ~一一一一一 摘自, , . .; :?. 南京医科大学博士学位论文 后者可减少活性氧的产生【。。由此可见,.在抗氧化应激损伤、 调节微循环等方面具有重要的作用。一系列研究则表明:.的诱 导表达对于肠粘膜屏障具有显著的保护作用。 因此,本研究拟利用基因工程技术构建大鼠.乳酸乳球菌 表达系统,通过组织学、免疫组化、?、等 方法观察乳酸乳球菌重组.对大鼠肠道屏障的保护作用,为保 护肠粘膜屏障功能提供新的方法。南京医科大学博士学位论文 第一部分大鼠血红素加氧酶一基因在 乳酸乳球茵中的表达 血红素加氧酶 ,是血红素分解代谢的限 速酶,可催化血红素在机体内氧化分解,生成胆绿素、和。 哺乳动物体内的胆绿素还能在胆绿素还原酶的作用下还原为胆 红素。 现已发现血红素加氧酶存在种同工酶:、和,其中 只有是诱导型酶。最初刈门认为的作用仅限于催化血红素氧 化降解,维持体内血红素的平衡。近年的研究发现,在抗氧化应 激损伤、调节微循环等方面具有重要的作用邛们。 分布范围很广,全身的各个脏器和组织均在应激情况下表达 。研究证实不仅可以在真核细胞中重组表达饰“日;也可以在 原核细胞中表达拍。已经证实重组端和端的部分氨基酸缺失 后,仍可在大肠杆菌中呈稳定可溶性表达,且不影响其催化活性?。 乳酸乳球菌是一类长期应用于食品发酵业的有益微生物,这种食 品级微生物能经受胃肠液考验并在人体内存活天,其本身不攻 击肠黏膜并且不引起强的免疫反应拍。近年来随着乳酸乳球菌分子生 物学迅速发展,一系列乳酸乳球菌基因表达载体和受体系统逐步建 立。本研究观察大鼠基因在食品级微生物乳酸乳球菌中的表达 情况,为应用研究提供依据。 材料和方法 一、药品、试剂与主要仪器 和.质粒为法国农业科学院教授赠 送;大肠杆菌为本实验室保存;. 载体购自美国 公司。其中大肠杆菌用于质粒.、. 及其衍生质粒保存或扩增的菌株。乳酸乳球菌用 作.基因重组表达质粒..的表达菌株。大肠杆菌用南京医科大学博士学位论文 培养基、乳酸乳球菌及其电穿孔转化子用脑心浸液培养基培养。 氨苄青霉素使用浓度为/;氯霉素使用浓度大肠杆菌为 /、乳酸乳球菌为/。 二、酶和试剂 总提取试剂盒、? 载体试剂盒、质粒提取试剂 盒、内切酶及 连接酶均为美訇公司产品; 聚合酶和逆转录酶购自美匡公司;?、异丙基 一?一硫代半乳糖苷和琼脂糖购自上海生工生物工程公 司;相对分子量标志物购自大连公司; 试 剂.兔抗鼠一抗购自美国公司,羊抗兔二抗等 均购自美国 公司;其它试剂为国产分析纯。电穿孔仪为美 国?公司。 三、大鼠脾总制备及.扩增 大鼠脾总采用异硫氰酸胍/酚/氯仿方法制备。引物按 大鼠. 两端序列,其中’端引物: ’引入了 位点, 端引物: 鱼笪?盯 ’引入了 锻位点。经逆转录酶作用获得用作 ,? 模板。个热循环按? ,?进行。 将?扩增获得的大鼠. 纯化后克隆至? 载体,获得?.质粒送上海基康公司测序验证。 四重组质粒的构建及转化 有关分子克隆、大肠杆菌感受态制备及转化按文献操作;乳酸 乳球菌转化采用电穿孔转化法,电穿孔仪为美国.公司,脉冲 和 参数为. /,心和?。重组质粒构建如下:用胍 双酶切..质粒后,与经同样酶切的含有启 动子的.质粒连接,从而构建成..质粒, 南京医科大学博士学位论文 .一质粒含有信号肽。重组质粒经电击转化乳酸乳球 菌,转化子在含有氯霉素的脑心浸液琼脂糖平板上生长。再 从重组乳酸乳球菌中提取质粒?,进行酶切鉴定。 五、大鼠.基因在乳酸乳球菌中的诱导表达 含重组质粒.的乳酸乳球菌在脑心浸液培 养基中。静置培养过夜用新鲜培养基:稀释,培养至 .~.时,加入诱导物至终浓度 /,继续培养小 时。终止培养后,取培养菌液,?、, /心分钟, 上清液浓缩倍后经%.电泳分离后,通过.印 迹仪转移至硝酸纤维素膜上作.。以空载体 为对照。 六、大鼠.活性分析 诱导表达后的培养茵液,、/离心分钟,收 集上清,而后用过硫酸铵分级盐析,取%~%饱和度的盐析组 分,最后通过.柱层析分析分离。取原位灌注的大鼠肝约 /离心 , 后于?、, ,匀浆后超声破碎 收集上清液。将收集的上清再次于?、, /超速离心小时, 水相为胆绿素还原酶,置一?保存备.蛋白酶活性测定用。 一蛋白酶活性测定参 等方法【】,胆绿素还原酶、.柱 层析产物采用法蛋白定量。经测定值,以单位时间内 生成的胆绿素量计算大鼠.蛋白的酶活力。 结 果 一、 ?扩增结果 通过方法利用设计合成的一对上、下游特异性引物,从 大鼠脾组织成功扩增出一条约 单一条带,与预计的 南京医科大学博士学位论文 片段长度一致;而反应体系中无模板的阴性对照仅见引物二聚 体;阳性对照采用试剂盒提供的牛胰蛋白酶抑制剂基因模板和引 物成功扩增出一条约 单一条带.。 二、. 克隆序列测定 产物回收后构建的.一经转化扩增,测序鉴定 .。序列包含起始密码子和终止密码子从, 长度为 ,核苷酸序列与‘公布的.的 序列编码区相同。 、 卜 . 一 卜 . ? .一 : ;: ;:;: :. :,:: 争:::: :? . 一 三、重组质粒的构建 将大鼠一 研怆插入质粒,重组质粒电击转化乳酸乳 球菌,转化后提取重组质粒进行 和 双酶切鉴 南京医科大学博士学位论文 定,结果证明重组质粒的构建正确.,。 . : ;:?一 ;:?一 . ?一 四、大鼠.基因在乳酸乳球菌中的表达情况 经%?鉴定, 一表达量初步确定约为. / .。?证实大鼠 一基因在乳酸乳球菌中能够正确 表达.。??”。甜 。~。一’ 一爨黪 矗 .魄。巍. ? 一 . :/?一;: 南京医科大学博士学位论文 瓦一 . :/?一;: 五、乳酸乳球菌重组.蛋白活性测定 以作为电子供体测定大鼠一蛋白活性约为. //。 讨论 乳酸菌存在数种食品级基因表达系统,如依赖操纵予控制的 食品级表达系统【、启动子控制的食品级基因表达系统【,和 嘌呤调节的食品级基因表达系统【】等。本研究所采用的乳酸菌 表达系 统是一种目前国际上高度通用系统 ,。乳酸菌系统是在乳链菌肽诱导下由启动 子控制目的基因表达的,钿和的两组分调节系统的高效诱 导表达系统。与其他的基因表达系统相比较,乳酸菌系统具有 以下独特地优点: 由于系统的宿主菌和载体都是食品级 的;诱导剂乳链菌肽是一个理想的食品级诱导分子,它高效安全 无毒, 能直接用于食品中; 可使用染色体上缺失并含基因 的乳酸球菌菌株以及含有启动子控制之下目的基因和基因 的质粒【.】,用食品级选择标己替代抗生素抗性基因,以互补染 色体上的缺失【】。这样不仅构建了稳定的完全的食品级表达系 统,而且采用诱导型表达替代原来的组成型表达,使细菌生长与外源 基因的表达分为两阶段,有利与基因工程菌的生长四; 诱导剂南京医科大学博士学位论文 吏用方便。由于生产乳链茵肽的菌株的稀释的上清液即可用作诱 导剂,所以生产乳链菌肽的菌株可以包含在发酵液中,并可简单地加 入小量的乳链菌肽来进行诱导,而其他起始培养细菌不会遭受亚抑制 量乳链菌肽的损害。随着一些乳链菌肽突变体的构建成功,甚至可用 可以 比野生型菌株所需的更低浓度的乳链菌肽作为诱导剂; 有效控制的蛋白表达水平。根据加入的乳链菌肽的量,最终蛋白质生 产可达到%细胞内蛋白质水平,表达水平可控制在,倍的动力 范围之内,在此范围内诱导浓度和蛋白质生产水平之间有线性剂量反 应关系【, ;能十分严谨地调控目的基因的表达。在未诱导 状态时,使目的基因表达处于不可检测的蛋白水平。这样可以获 得严 谨调节的启动子系统,并可表达毒素基因产物 因为系统中具有很多优点,许多学者利用启动子和 、基因构建的一系列表达载体和相应的宿主茵,已于年 起开始用于目的基因的表达研究【。本实验采用的是目前被 广泛使用的乳酸工程菌。有研究发现,是最敏感的诱导菌株。 在诱导小时之后,目的蛋白的生产达到最高约%细胞可溶蛋 白水平【】。本研究利用表达系统及含有言号肽表达 载体在乳酸乳球菌中实现了大鼠.活性表达。 本实验成功重组了能够表达具有生物活性的乳酸乳球菌重组 .。若将此重组蛋白应用于危重病机体的消化道,不仅能够增加 肠道.含量,还可改善菌群失衡、发挥益生菌的粘膜保护作用, 因而有可能成为保护危重病机体肠粘膜屏障功能的一种新的有 效措 施。 结 论 乳酸菌系统能够表达具有生物活性的大鼠重组.蛋白。南京医科 大学博士学位论文 第二部分血红素加氧酶一乳酸乳球菌灌胃后重组血红素 加氧睁大鼠肠道的表达情况 近年来,.基因治疗取得可喜的进步。有研究发现利用腺病 毒载体介导.后,可以有效减轻心脏【、肺组织【等重要器官的 损伤。然而由于肠道解剖结构的复杂性,利用目前常用的病毒载体无 法特异性的对肠道进行基因治疗。以减毒活菌为载体构建的基因治疗 载体可以避免消化液的破坏作用,可通过口服到达胃肠道中,对胃肠 道损伤进行器官特异性基因治疗,但是这些弱毒微生物存在着毒力返 强的危险,严重制约着它们的广泛使用。而乳酸乳球菌基因表达 系统的建立为肠道基因治疗提供了新的契机。 ,是一类长期应用于食品发酵 乳酸乳球菌 业的有益微生物,这种食品级微生物能经受胃肠液考验并在肠道内存 活?天,其本身不攻击肠黏膜并且不引起强的免疫反应【。在第一 部分实验中我们发现大鼠.能在中的表达;并且生物活性较高 】。但如何在胃肠道中分布和运动进入胃肠道中的分泌重组 一的数量和持续时间分泌的重组一是否可进入小肠固有 层和肠系膜淋巴结等问题一直不清楚。本研究拟观察重组.灌 胃后在大鼠肠道的重组.数量和分布情况,为乳酸乳球菌重组 一临床治疗奠定基础。 材料与方法 一、大鼠灌胃菌液制备 含重组质粒..的乳酸乳球菌.在 脑、心浸液培养基中。,培养至.~.时,加入诱导 物至终浓度 。终止培养后,菌落计 /,继续培养 / 数达 、重悬 /;然后?离心, 后制备成倍、倍、倍浓缩的菌液。在同样条件下培养未南京医科 大学博士学位论文 转染乳酸乳球菌,收集菌落做对照。 二、试验动物及分组 、试验动物体重.的大鼠;由徐州医学院实验动物中 心提供; 、 研究不同..灌注量对肠道的中.含量影响动物分组 大鼠,共分为组,每组只:倍.. 天组;?倍 .? 天组;?倍?? 天组;?倍.?天组;? 倍?.天组;?倍..天组;?倍?.天;? 倍?.天.组;?倍??天组; 组;天组; 旧天组。组用 含。/,活野生型乳酸乳球菌悬液 灌胃,而..各组相应的时间点给予等量的活重组乳酸乳球菌悬 液灌胃。每天灌胃次。 、 研究不同灌胃次数对肠道的中一含量影响动物分组鉴于试 验中我们观察到浓缩倍的..组肠道中.的含量倍 多。因此本部分研究采浓缩倍的?.灌胃。大鼠只,共分 为组,每组:??. .组;??一 天组;?.. 灌胃天组;影;组;?组。灌胃剂量与方 法同上。 三、检测指标 、组织学检查 各时间点用%戊巴比妥钠./腹腔麻醉, 取回肠组织于含%的多聚甲醛中固定,常规脱水、包蜡、切片、行 染色,光镜下观察肠组织的变化。 、酶联免疫吸附法测定肠组织.含量取回肠组织用锡纸包裹, 置于液氮中速冻。采用酶联免疫吸附试剂盒公司测定 .含量。具体操作按照说明书进行。、免疫组化法分析肠组织. 的含量免疫组化采用链酶亲和素.过氧化物酶法,染色程序按法 操作常规进行。.一抗为公司产品,.二抗试剂氩武 汉博士德公司。用 软件分析肠组织.的相对含量。南京医科大学 博士学位论文 四、统计学处理 采用.统计软件包进行分析;计量资料以均数士标准差表 示,采用单因素方差分析和最小显著差法分析。 结 果 一、组织学检查结果 各组肠组织的形态学无明显改变。说明..对肠道无损 害作用。 二、不同剂量灌胃组、不同灌胃天数回肠中的.含量 、酶联免疫吸附法测定结果发现:..各组灌胃一天一 含量无明显差异,而灌胃两天、天组倍、倍组比倍组、对照组 含量要高.,.。说明用小剂量的..灌胃能有效增加 .在回肠中的含量。 . ..?; ?一 幸:.坩. ?一 . ;“一’’: ;拌:。 、..连续灌胃天、天组比天组含量明显增高. ,.说明..连续灌胃天、天,尤其是天,能使 回肠中.的含量明显增高,但延长灌注次数反而使回肠中一 的含量降低。南京医科大学博士学位论文 ?昌\?嘟如。 ..?一 苫. ?;/;番:. ;群:. 三、免疫组化法分析肠组织.的含量 免疫组化法及灰度分析结果与酶联免疫吸附法测定结果基本一 致.,.。即:单纯增加..灌胃剂量和次数不能有效 增加回肠中一的含量,反而可能使回肠中一的含量降低。 ?.?; ?一 事:.’酱. ;存:.’峪。、 . 南京医科大学博士学位论文 . 一 .? ?一;木:. 、? 讨论 乳酸菌诱导表达系统是目前国际上最新发展的一种常用、 食品级的诱导表达系统。该诱导表达系统具有以下优点:食品级 的诱 导物和宿主菌;严谨性高;本底表达水平低;诱导效率高,表达产量 高。它包括三种必要的组成成分:能表达基因到一定水平的 革兰氏阳性细菌;含启动子片段的质粒载体; 诱导物【】。当带有启动子及.基因的质粒:. 导入不能产、但含有和蛋白的乳酸菌菌株后, .基因以很低的水平表达。这种表达水平检测不到。当细菌达到 对数生长期时向培养基中口/.后,位于启动子下游的 .基因被激活转录,持续表达一定数量的蛋白。当李诱导后 的?.灌注进入肠组织中后,?.可以紧密在肠上皮细胞上, 分泌.,使肠道中一含量增加。 研究?.灌胃后重组血红素加氧酶.在大鼠肠道的含量是 一个非常复杂的、而又十分重要的工作。当..进入胃中,大量南京医科大学博士学位论文 的乳酸菌可以被胃酸及其消化酶破坏,只有一部分乳酸菌能进入肠道 中。进入肠道以后,肠道中的环境非常复杂,它含有许多的消化酶和 细菌均可以对灌胃后进入肠道中的.一功能产生影响【。 一般情况下,通过增加给药剂量扣次数可以有效增加组织和器 官中的有效药物浓度,从而达到理想治疗效果。但本实验中,我们 发现单纯增加.?灌胃剂量和次数不能有效增加回肠中. 的含量,反而可能使回肠中一的含量降低。其可能的原因是: 当菌液高度浓缩时会导致菌液紧密粘连,不容易分散为单个菌株。 灌胃后进入肠道中可能仍然已菌块的形式存在;无法有效分泌 .。因此,仅仅依靠增加增加..灌胃剂量不能有效增加回 肠中.的含量。在正常情况下,一在肠组织中不表达。 只有当肠道受各种有害刺激因子的损伤如缺血、炎症等情况下大量 表达。发挥重要的抗炎、抗氧化等保护作用。而本实验我们使用的 是正常大鼠,.含量增加后可能会激活.内源性清除。 从而增加..灌胃次数不能有效增加回肠中.的含量,反 而可能激活.内源性清除机制,使回肠中.的含量降低。 本研究结果可能有一定的理论指导意义。与化学药品不同,乳 酸工程菌进入体内后,其分泌的重组蛋白量与灌胃的菌液量可能不 存在严格意义上的量效关系。如果要提高乳酸工程菌体内分泌重组 蛋白的含量,需要从改善乳酸工程菌的性状及其改变动物胃肠道微 环境等方面进行研究,才能使乳酸工程菌的基因治疗达到一个理想 的效果。 结论 、.一对肠道无损害作用; 、?.在肠道原位分泌重组.的情况非常复杂。单纯 增加?。灌胃剂量和次数不能有效增加回肠中.的含量, 反而可能使回肠中.的含量降低。南京医科大学博士学位论文 第三部分乳酸乳球菌重组对失血性休克大鼠肠道屏 障的保护作用 失血性休克是临床上常见的急症危重病,其并发症和死亡率很 高【】。治疗失血性休克需要及时采取外科止血和液体复苏等综合措 施,治疗时人们往往注意保护重要脏器如心、肺、肾的功能, 而忽略肠道功能的改变【】。实际上,肠道功能在休克的早期首先受 到伤害【,发生细菌移位和释放炎症介质等肠黏膜屏障功能减退的 表现,对全身炎症反应综合征,和多器官功能不全综合征,的发生起到关键和核心的作用。 许多证据表明,在失血性休克期,正常不分泌.的肠道由于 缺血缺氧等刺激开始分泌.【,发挥重要的细胞保护作用【。本 实验拟观察?一对失血性休克大鼠肠黏膜屏障的保护效果。 材料和方法 一、仪器和试剂 .%氯 脑、心浸液培养基 ,,; 化钠溶液,江苏省徐州远恒药业有限公司;旺.伐肿瘤坏 死因子.【和.白介素一试剂盒晶美生物试剂有限公司;. 试剂盒,,; 监护仪 ,,.;髓过 氧化酶活性试剂盒南京建成生物试剂公司;其余试剂为市售。 二、动物分组及灌胃剂量 健康、清洁级标准的雄性大鼠只,体重在~之间, 由江苏省徐州医学院实验动物中心提供。随机分为组 :假南京医 科大学博士学位论文 手术组 :大鼠只进行右股动脉分离和插管;.. 组:连续每天一次灌注活菌数达.× ..茵液天.,然 后复制失血性休克模型复制;组:连续每天一次灌注活菌数达 . 茵液天.,然后复制失血性休克模型;.. 组:连续每天一次灌注活菌数达.× ..茵液 天;在复制失血性休克模型前小时皮下注射锌原卟啉 ,.蚝;谷氨酰胺组,: 连续每天一次灌胃. 天,然后复制失血 .、溶解于的 性休克模型。所有动物均在实验前适应饲养环境天,实验前禁食 以上但不禁饮,实验后自由饮食,单独饲养。饲养环境和实验室环 境温度保持在。.?之间。 三、失血性休克模型和液体复苏方案 参照文献复制失血性休克动物模型】。 具体步骤为:大鼠麻 醉后,剪去术区被毛,无菌条件下分离右股动脉,用套管针行 股动脉穿刺,成功后与血压换能器所有管道内预充./的肝 素液和 监护仪 ,, .连接,用于记录血压和脉率。待血压稳定后,在内间断 放血,使大鼠的平均动脉压降至 以下,通过放 血或者回输血液维持在~ 之间,时间为 。休克结束后立即进行液体复苏,将回抽的血液及倍于放血 量的生理盐水经股动脉缓慢逆行输入,内输完,以血压恢复 到放血前的%或者以上为复苏成功。整个实验过程中保持大鼠自 主呼吸空气,并注意保暖。 四、组织标本的收集 取所有存活动物列入实验对象。分别在液体复苏后,无菌条 件下打开腹腔,从大鼠的右心室抽取.的血液注入血培养瓶 中。另外距回肠末端取下~长度的一段小肠,其中用 %甲醛溶液浸泡,余下的回肠立即保存在一。冰箱内。南京医科大 学博士学位论文 五、检测指标 、肠组织活性 采用南京建成生物试剂公司生产的检测试剂盒,用比色法 测量肠组织内的活性。具体操作按照说明书进行。 、 细菌移位 利用全自动血培养仪美国和 软件发现有细菌生长的血培养瓶,然后再利用生物梅里 埃鉴定系统鉴定细菌种类。 、 酶联免疫吸附法检测肠组织.【和.的含量 采用晶美生物试剂有限公司生产的.【和.试剂 盒检测肠组织.和.的含量。基本原理:采用双抗体夹心 法。抗大鼠.【单抗包被于酶标板上,标本和标准品中的 .【会与单抗结合,游离的成分被洗去。加入生物素化的抗大鼠 .【抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素和亲和素特异 性结合,抗大鼠.伐抗体与结合在单抗上的大鼠.【结合而形 成免疫复合物,游离的成分被洗去,加入显色剂显色。在处 测吸光度值,.【浓度与值成正比,通过绘制标准曲 线求出标本中的.浓度。 、 法检测肠组织.含量 用加拿大公司生产的一试剂盒检测肠组织 的.含量。具体操作按说明书进行。 、组织学检查 级评分法评价 光镜倍下观察肠黏膜形态,采用’ 肠黏膜损伤程度刚:分为正常;分为绒毛顶端上皮下间隙增大; 分为上皮层和固有层中度分离;分为绒毛两侧有大量分离伴有部 分 绒毛顶端破损;分为绒毛破损伴有固有层毛细血管大量暴露;分 为 固有层破坏、出血及溃疡。 六、统计学处理 所有数据采用均数土标准差,组内比较用检验,组间比较用 检验。用.软件进行统计分析,尸.认为有统计学意义。南京医科 大学博士学位论文 结果 组织学检查结果 组比较,.?组和组肠组织氏级评分明显 降低,差异有显著性尸.;说明..组在维持肠黏膜形 态方面明显较好,肠黏膜屏障受损明显减轻.。但这种保护 作用可以被.特异性阻断剂取消;说明..对肠黏 膜屏障的保护作用是.特异性的。 . ? 蓉. 们 量. .?? ? . ..一 ’. . .. ’ 仞 . . ... . 口尸. . .. .. ..慢 . 二、肠组织活性结果 主要存在于中性粒细胞中,而在单核细胞和巨噬细胞中分 布较少。活性大小与中性粒细胞的数量相关,可以反映组织内 中性粒细胞的数量【。与组比较,.一组肠组织活性 明显减低.,说明携带一基因的乳酸乳球菌灌胃后,可以 减少失血性休克导致的中性粒细胞激活牙口肠组织中的浸润数 量。因 此,由活化的中性粒细胞介导的炎症反应也就明显降低。但这种 保 护作用可以被.特异性阻断剂取消;说明?.降低 南京医科大学博士学位论文 低活性的保护作用是.特异性的.。仅晚仇基吕。芎口召苫岜?口?卜 ?? / . . .?. . . .. .中.倦... . 三、细菌移位检测结果 假手术组、..组、组组和..组血液 、%/、%/ 中细菌培养阳性率分别为:、%/ 和%/.。与组比较,..组细菌移位发生 率明显降低尸.。说明携带.基因的乳酸乳球菌灌胃后, 能够较好的保护肠粘膜屏障,明显减少肠道内细菌通过受损的肠壁 转移到肠道外器官的发生率。然而这种保护作用可被所取消, 说明这种保护作用是.特异性的。移位的细菌按出现次数依次 为:大肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、类白喉棒状菌、鲁氏不 动杆菌等。证明移位的细菌主要是肠道内的革兰阴,生菌,它们可 以 通过释放内毒素,引起内毒素血症、脓毒血症乖等并发症。 四、肠组织一伐和一的含量检测结果 与组和..组比较,..组和组的肠 组织.伐的含量明显减低尹均.,而..组和 组的肠组织.的含量却显著的升高尸均.,说明.一 或谷氨酰胺灌胃能明显的降低失血性休克大鼠肠道炎症介质.南 京医科大学博士学位论文 的分泌;促进.的分泌,从而抑制肠道的炎症反应,发挥抗炎 。 效应.. 塾皇里竺望尘垒鱼堡兰堕里堑旦里 %.惟,.. . 毒~讨?矗鼻墨 日一,【 【?帕一 曩 . ..... ? .?. ..,, . ? . .. , .. 巾 五、失血性休克复苏后检测结果 与组比较,..组在复苏期各个时间点上,均明显增 高..,说明..组大鼠有足够的血液组织灌注, 能有效增加肠组织内的血液和血氧供应。然而这种保护作用可被 所取消,说明这种保护作用是.特异性的。 南京医科大学博士学位论文 画 言 室 . 一. . .尸. . .一. 讨论 在失血性休克的早期,由于腹腔内血液灌注减少和血流再分布的 原因,肠道内的血液灌注量明显减少,肠黏膜水肿,发生肠黏膜屏 障 功能减退。肠黏膜水肿,被认为与细菌移位和的发生有关【,。 因此,通过’评分可以判断出肠黏膜受损情况,是反映其功能改 变的形态学指标。 在失血性休克期,肠道内的正常茵群依赖肠道内的营养物质大 量繁殖,细菌和或其释放的内毒素通过受损的肠黏膜屏障转移 到肠道外,这个过程称之为细菌移位。细菌移位导致的炎症介质 释 放,明显比肠道因缺血缺氧刺激引起的炎症介质释放要多【】。目 前 对于发生的病理机制不完全清楚,有的学者认为细菌移位引起 的炎症介质释放起到关键作用【,但也有学者怀疑这种观点【,。 实际上,肠道释放的各种炎症介质,通过激活各种信号通路如激 活 .信号通路,导致各脏器的病理变化,才是导致发生的 真正和主要的原因。本实验通过血液培养证明发生细菌移位, ?.组细菌移位的发生率最低,可以释放较少的肠源性炎症介 质。南京医科大学博士学位论文 在各种炎症介质中,师.被认为是诱导和发生的中 心介质和早期介质,是引起和发生的始动因素【,而 肠道是失血性休克期释放吓.的主要器官和主要来源【,。中性 粒细胞在激发炎症因子的释放如师一,以及随之导致的 的病理变化中有着重要的作用。.是重要的抗炎因子,可以减轻 局部和远方器官的炎症反应,对?有潜在的抑制作用。它的抗炎 作用是通过一发挥的【】。因此通过测量肠道内的活性、.【 和一的数量,可以较准确地反映肠道内炎症介质的释放情况以及 炎症反应的程度。 在失血性休克期,正常不分泌.的肠道,由于缺血缺氧的刺 激开始分泌.,并且在复苏后~达到高峰【。许多证据表明 .在失血性休克期有重要的细胞保护作用,可以改善受损器官的 功能;而阻断.的表达,则可以加重受损器官的损害【。。它是 通过分解血红素使其不能参与氧化作用和或它的三个代谢产 物的作用来完成的。具体保护作用有:?抗氧化作用;?维持微循 环 稳定;?调节细胞生长周期;?抗炎症作用】。 通过携带.基因的乳酸乳球菌对大鼠灌胃,在失血性休克应激 情况下,乳酸乳球菌重组.对回肠有较好的保护作用。表现在:、 ..组有较低的’评分和细菌移位发生率;、?.组回 肠肠组织内的.含量较低;而.含量较高;、..组 活性较低;、.一组休克复苏过程中可维持较高的。这些 结果说明乳酸乳球菌重组.能发挥一定的抗炎作用,从而减轻失