Red同源重组在大肠杆菌基因组修饰中的应用

Red同源重组在大肠杆菌基因组修饰中的应用 综述 doi: 10,3969 , j,issn,1009)0002,2011,06,030 Red 同源重组在大肠杆菌基因组修饰中的应用 ，1212孙旭 ，周长林 ，方宏清 1,中国药科大 学 生命科学与技术学院 ，江 苏 南 京 210009, 2,军事医学科 学 院 生物研究所 ，北 京 100071 ,摘要, Red 同源重组技术发展迅速，已广泛应用于大肠杆菌基因组修饰，在点突变、基因敲除、序列整合等方面发 挥着重要作用。 简要综述了 Red 同源重组的重组机制和操作策略等研究进展，并介绍了 Red 同源重组在大肠杆菌基 因组减小及多基因代谢途径优化方面的应用情况。 ,关键词, 同源重组,大肠杆菌,基因敲除,重组机制Red ,中图分类号, Q78,文献标识码, A,文章编号, 1009)0002(2011)06)0873)06 Application of Red Mediated Recombination in Escherichia coli Genome Modification 1,211 SUNXu,ZHOU Chang)Li,nFANG Hong)Qing 1,School ofLife Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009; 2,Beijin g Institute of Biotechnology, Beijing 100071;China ,Abstract, Red)based recombineeringis developing rapidly and has been widely in Escher usedich ia coli genome modification, such as single base substitutions, deletions , andIn this insertions article we reviewed the progressin the Red)recombination mechanism and the application R estrategiesd)based recombineering of , The application of including construction of a reducedE, )lico,genome optimization of multi )genesthe techniques was shown, metabolism pathway and on ,so ,Key words, lambda red recombination; ichEscheria coli; gene knockout; mechanism 。 由于这 种系够对大肠杆基因组进行精确的改造几十年来，大肠杆菌一直是分子生物学和基因2 组学的重要研究对象，在基因工程、代谢工程和合 统原理相似，故 Stewar将它t 们命名为 Red , ET 同源 成生物学等研究领域中应用广泛 ， 是生产重组 蛋 重组系统。 Red 同源重组系统由 λ 噬菌体 的 exo、 白、氨基酸、有机酸、能源和一些重要化工产品等的 bet、gam 等 3 个基因组成，它们分别编码 Exo、Beta、 主力微生物之一。 近年来，通过修饰大肠杆菌基因 Gam 蛋白。 Exo 蛋白是一种核酸外切酶，可结合在双 组，使其获得新的性状和生产能力，是国内外研究 链 DNA,dsDNA,的末端，从 DNA 双链的 5′端向 热点之一。 我们简要综述利用 Red 同源重组技术进 3′ 端降解 DNA，产生 3′突出端。 Beta蛋白是单链 结合 蛋白， 可自发地形成环状结构， 紧紧地结合在行大肠杆菌基因组修饰的原理、策略及应用现状。 单链 DNA,ssDNA,的 3′突出端，防止 DNA 被单链 核酸酶 降解，同时介导互补双链 DNA 的退火，退火 完成后，B eta 蛋白从 DNA 双链上解离下来。 Beta 蛋 同源重组的原理1Red 白在 Red 同源重组过程中起着决定性的作用。 Gam 蛋白可与 RecBCD核酸外切酶结 合，抑制其对外源 [4]同源重组系统的组成1,1 Red DNA 的降 解作用。 Red同源重 组是对大肠杆菌进行体内基因操作 1,2 Red 同源重组机制研究进展 的有效方法，使用 Red同源重组技 术，可精确地实 现基因敲除、基因敲入、基因克隆和各种突变体的 [1][2]引入。 Stewar等t 于 1998年发 现，大肠杆菌本身存 ,收稿日期, 2011)0301)[3] 在的 RecE , RecT 系统具有高效重组功能。Zhang 等 ,基金项目, 国家重点基础研究发展,,2011CBA00801 ,作者简介, 孙旭,,，男，硕士研究生1985) 在 2000 年又发现 λ 噬菌体的 Exo 和 Beta 蛋白同样 ,, ，,,,通信作者周长林E)mailchanglingzhou,yahoo,com具有高效的重组功能，使用仅 50 bp 的同源臂就能 方宏清，,,E)mailfanghonqging,yahoo,com,cn 目前， 对于 水解 使其产生 42?时， 阻遏蛋白失活，P启动子高效表达重组蛋 Exo dsDNA ssDNAL 这一功能的研究已比较透彻，主要问题集中在 Beta 白,由于 red 基因位于染色体上，表达更稳定，因此 蛋白如何介导外源 DNA 侵入基因 组 DNA 并 且 发 这种改进提高了 Red 同源重组效率。 2005 年 Ohara [15] [5]等对 red 基因进行一系列突变，最后发现突变的 生重组。 1997年 Kuzminov等 研究发现，Redβ 只具 redα,R137Q,和突变的 redβ,C118R,可分别提高重 有介导 DNA 单链退火的功能， 并不具有链侵入的 组效率 2,倍5 和 2 倍, 在 gam基因引 入 18 bp 的 5, 功能。 然而，Red 同源重组在没有 RecA 存在的情况 [6]非翻译末端,5,UTR,可以提高重组效率 25 倍,将 3 下同样能够发生，这使得链侵入的过程在当时成 [7]种突变结合可使重组效 率 提 高 145 倍 。 2006 年 ， 为一个谜题。 2001年 ，Ellis 等在链侵入的机制研究 [16]方面取得突破，他们在以单链寡核苷酸作为打靶片 Wang等 发现，在进行 Red 同源重组时共表达 re- 段进行点突变时，能够做为冈崎片段的单链打靶片 cA 基因可以提高重组效率，他们推测可能是由于表 段的重组效率比与其互补链的重组效率要高很多， 达 recA 基因提高了重组后菌株的存活率，进而提高 因此，Ellis 提出，Redβ 介导的同源重组的链侵入过 了重组效率,此外，该文献报道使用 pSC101为复 制 子的低拷贝质粒表达 exo、bet、gam 基因， 同样提高 程是借助 DNA 的复制完成的，Redβ 介导的单链退 火发生在复制叉处。基于 Ellis 的研究，2002 年 Court [8] 等提出了 Red 同源重组的 2 种模型,对于长度较 短的 dsDNA，其链侵入是以“鸡爪模式”的中间体 了重组效率。随着 同源重组机制研究的深入，Red 完 成 的 , 而 对 于 较 长 的 dsDNA， 链 侵 入 是 通 过 对 同源重组系统的改进将更合理、 更有针对Red “ 桥 模 式”完成的。 其过程为，首先 3,突出端与靶 性，相信会有更多通过改造 Red 同源重组系统提高 同源区在 复制叉处退火，因为之后是大段非同源重组效率的报道。 序列， 因此 复制停止，由于细菌染色体为双向复 制，复制过程 随后被另一方向的复制修复。 2008 年 [9] 应用 同源重组修饰大肠杆菌基因组 Red 2Poteete等 对 Court模型提出质 疑， 他们使用单向 复制的质粒，同 样完成了 Red 同源重组，因此他们 的策略 提出了“复制粒 侵入模型”，Exo 水解产生 3,突 出端与靶序列后随 链退火， 之后打靶序列代替前两步同源重组法2, 1 导链作为复制模板，一种核酸内切酶切割原有后随 两步同源重组法是报道最多 、 应用最广泛 的 [10][11] 链完成链替换。 2010 年 Maresca和 Mosberg等 [13]Red 同源重组操作策略，该方法由 Wanner等 首先 几乎同时发表文章，认 为 Poteete模 型虽然改进了 报道,图 1A, 。 其操作策略是,第一步，在 Red 同源 Court 模型，但该研究既 没有验证该核酸外切酶的重组介导下，将一段两端含有 FRT 位点的抗性基因 存在，也没有解释新的复 制叉如何形成，因此他们敲入基因组靶位置,第二步，在辅助质粒表达的 Flp 提出了 dsDNA 的“完全单 链重组模型”。 他们认重组酶介导下剔除抗性基因。 但是，该方法进行基 为 Exo 并非切割 dsDNA产 生 5, 突出端，而是完全切割其中一条单链而保留另外 因修饰后会在基因组上留下一个 位点的“FRT 疤一条链，保留的 ssDNA全部 与 Beta蛋白结 合，以类 痕”， 影响后续操作。 为了达到无痕修饰的目 的 ，[3] Zhang等 报道了两步正负筛选法 , 图 1B, ，该方法 通过两步同源重组过程完成基因敲除或基因敲入， 并且改造后不会产生任何多余的序列变化，可达到 并发生重组，似冈崎片段的方式侵入靶 之后DNA “无痕修饰”的目的。 其操作策略为,第一步同源对他们的假设进行了验证。 重 组是通过电转化的方法将打靶片段转入大肠1, 3提高重组效率的措施 杆菌 细胞中，在 同源重组酶的作用下发生同源重Red [12] 等于 年率先构建了表达噬菌体Stewart 1999 ，将正负筛选标记敲入基因组的特定位置 ， 使用组重组酶的质粒，之后有很多研究者在此基础上对质 正筛选标记筛选重组菌,第二步同源重组同样通过 [13]电转法将打靶片段导入细胞，在 Red 同源重组酶作 目前应用最广泛的是 等构。粒进行改进Datsenko 用下发生重组完成基因敲除或基因敲入，该步骤可 建的 ，该质粒含有受阿拉伯糖启动子调控的pKD46使用负筛选标记筛选重组子。 由于重组后筛选压力 exo、bet、gam 基因，其复制子为温敏型复制子，便于 很大，造成负筛选时假阳性比率较高，提高筛选标 [14]质粒的剔除。 2000 年 Court 等将 Red 系统整合到 记的选择能力能够降低假阳性，提高重组效率。 因 大肠杆菌 W3110染色 体上，使这 3 种蛋白的表达受 此， 目前对两步法的改造主要集中在筛选标记，尤 P启动子的调控，P启动子又受到 cI857 阻遏蛋白 L L 其是负筛选标记的选择上。 目前报道的负筛选标记 的抑制。 低温下,30:34?,表达被抑制,当温度达到 有 sacB、rpsL、galK、tolC、thyA 等，其原理及优缺点见 片段在 同源重组酶的作用下与基因组上DNA Red 的特定区域发生同源重组，完成目的基因的敲入或 表 1。敲除。 该方法的优点在于通过供体质粒引入打靶片 2,2 Gene gorging 法 段而非电转法， 因此每一个细胞中均产生打靶片 [21]该方法由 Herring等 于 2003年报 道，其主要 段， 提高了可能发生同源重组的大肠杆菌的基数， 原 理是使用双质粒系统完成同源重组 。 载 体 重组效率大大提高，在不使用任何筛选的条件下达 pACBSR含有阿拉伯糖启动 子控制下的 Red 同源重 到 1,:15，,故该方法省略了双向筛选的过程，只需 组酶基因和 )SecI 归巢内切酶基因,供体质粒含有 I一步就可完成,图 2, 。 用于同源重组的打靶序列和 I)SecI 识别位点 ,I) 2,3 Gene doctoring法 [23]SceI 归巢内切酶识别长达 18 bp 的特异序列， 这一 2009年 Lee等报道了该方法，其原理与 Gene 特异序列在人类、酵母、细菌或病毒基因组中都未gorging法类 似， 同样是通过供体质粒引入打靶片 [22]曾被发现, 。将载体 pACBSR和供体质粒共转化到 段, 不同点在于该方法在 Gene gorging法的基础 上 大肠杆菌细胞， 用阿拉伯糖诱导 pACBSR表 达 Red 增加了抗性筛选过程，并用位点特异性重组酶剔除同源重组酶和 )SecI 归巢内切酶，)SecI 归巢内切 II筛选标记。其操作策略是,供体质粒 pDOC包含两 端 酶 切割供体质粒产生线性 打 靶 片 段 ，线 性DNA 图 1 两步同源重组法示意图 表 1 常用的反向筛选标记 名称筛选原理特点文献 sacB 枯草芽孢杆 菌 sacB 基因编码蔗糖 6)果糖基转移酶， 该酶催化水解蔗糖并且 优点,可应用于所有基因型的大肠杆菌,无需昂贵 [3]合成高分子量的果糖聚合物，后者对大肠杆菌等有毒性。 因此，含有 sacB基 的特殊培养基，操作简单。 缺点,易突变，导致假阳 因的大肠杆菌将不能在蔗糖培养基中生长性产生 rpsL rpsL 编码核糖体 30S 亚基中的 S12 蛋白， 当 rpsL 基因发生突变后，S12 蛋白 优点,基因长度仅 539 bp，便于载体构建和同源重 [17] 与链霉素结合位点消失， 菌株表现链霉素抗性。 在 rpsL 突变株中， 若含有 组,无需使用特殊培养基，操作简单。 缺点,只适用,rpsL等位基因,显性基因,，链霉素可重新与核糖体结合，链霉素抗性消失 于 rpsL 突变株 galK 大肠杆菌 galK 基因编码半乳糖激酶， 催化半乳糖生成 1)磷酸半乳糖， 缺失 优点,既可作为正筛选标记又可作为负筛选标记, [18]galK 的大肠杆菌不能在以半乳糖为惟一碳源的培养基中生长,正向筛选, 。半 突变率较低， 降低了假阳性率。 缺点, 只适用于 2)),DOG,， 2) gak ,，脱氧半乳糖反应产物l缺失的大肠杆菌需要基本培养基菌株生长 乳糖激酶同样可以磷酸化半乳糖类似物 )半乳糖)1)磷酸对细胞有毒性， 因而含有 galK 基因的大肠杆菌不能在 缓慢,培养基较昂贵 脱氧 含有 DOG 的基本培养基平板上生长,反向筛选,tolC 大肠杆菌 tolC 基因编码外膜蛋白， 在大肠杆菌中，AcrB)TolC 外排系统可以 优点,既可作为正筛选标记又可作为负筛选标记, [19]排出多种的小分子，如新霉素、红霉素及 SDS。 因此，在 tolC 存在的条件下，大 假阳性降低,无需基本培养基 ， 减少了实验周期 。 肠杆菌对 SDS具有抗 性 ,正向筛选, ， 大肠杆菌素 E1 进入细胞需要 TolC 存 缺点,只适用于 tolC 缺失的大肠杆菌 在，其进入细胞后将破坏双分子层，杀死细胞。 因此，含有 tolC 基因的大肠杆 菌在含有大肠杆菌素 E1 的培养基中不能生长,反向筛选, 大肠杆菌 基因编码胸苷酸合成酶，催化 合成 ，缺失的菌 优点,既可作为正筛选标记又可作为负筛选标记, thyA tryA dUMP dTTPtryA 株在不含胸腺嘧啶的基本培养基中不能生长,正向筛选,，而含有 thyA 基因 突变率较低。 缺点,只适用于 tryA 缺失的大肠杆[20] 的菌株在含有胸腺嘧啶和甲氧苄啶的基本培养基中不能生长,反向筛选,菌,需要基本培养基，菌株生长缓慢 引入 I,SecI识别位点的打靶序 列，打靶序列包括左，快捷有效，报道敲除成功率达 70,:100。,时间 r 右同源臂和 Kan基因,其两端含有 Flp 识别位点,,2,5 双链断裂配合供体质粒法 [26]此外，pDOC 骨架中还包含 sacB基 因。 载体 pACB-该方法由 Kuhlman等 于 2010年报 道，分两步 进行。 第一步，通过电转化的方法将含有抗性标记SEC 在阿拉伯糖诱导下可表达 Red 同源重组酶和 的线性 DNA 导入大肠杆菌细胞， 抗性标记两端含 I,SecI归巢内 切酶，I,ecIS 归巢内切酶切割供体质 有 2 个 I,SecI识别位 点，在 Red 同源重组酶的作用 粒 pDOC 产生打靶片段，在 Red 同源重组酶的作用 下，将抗性标记敲入基因组特定位置，该步骤可通 过抗性筛选获得重组子。 第二步重组与 Gene gorg- 下， 打靶片段与基因组特定位置发生同源重组，将r ing 法类似, ?共转化工具质粒 pTKRED 和供体质 两端含有 Flp 识别位点的 Kan基因敲入基因组。 此 粒 pTKIP 到经第一步改造后的大肠杆菌细胞中，其 过程可通过卡那霉素,Kan,筛选重组菌，用蔗糖剔 中工具质粒 pTKRED 可在阿拉伯糖诱导下表达 I, 除由于 I,SecI切割不彻底而含有质 粒 pDOC 的假 SecI归巢内切 酶， 在 IPTG 诱导下可表达 Red 同源阳性菌株。 之后，在第二步重组中使用位点特异性 重组酶 Flp 剔除筛选标记。 使用该方法，他们成功地 重组酶,供体质粒 pTKIP 含有打靶 DNA 序列，且打 对包括肠出血性大肠杆菌 O157?H7,EHEC,在内的 等靶 DNA 序列两端各含有 1 个 I,SecI识别位 点,? 多种致病性大肠杆菌基因组进行了修饰。 阿拉伯糖诱导 pTKRED 表达 I,SecI归巢内切 酶，由2, 4Red 重 组 与 I,SecI切割诱导分子内重组相 结 合法 于此时基因组上和供体质粒上均含有 I,SecI识 别 [24]Kolisnychenko等 使用 I,SecI归巢 内切酶切割 位点，故供体质粒和基因组 同时被切割，供体DNA 基因组产生双链断裂,DSB,，诱导发生分子内重组， 达到“无痕修饰”的目的。 首先通过 Red 同源重 组，将一段精 心的打靶 DNA 片段整合到基因组 待 改造位置，打靶片段包括两端含有 I,SceI位 点的抗 质粒产生线性打靶 DNA 片段，基因组上的抗性基 性基因和左右同源臂，以及用于分子内重组的重复 因被切除, 之后用 IPTG 诱导 pTKRED 表达 Red 同 序列,之后辅助质粒表达 I,SecI归巢内切酶 切割基 源重组酶， 在其作用下线性打靶 DNA 片段与基因因组产生 DSB， 在分子内重组作用下剔除筛选标 [25]记，完成基因组修饰。2008 年，Yu 等在该方法基础 组断裂处发生同源重组，在将目的片段敲入基因组上构建了质粒 pREDI，这种质粒在阿拉伯糖诱导时的同时修复断裂缺口完成基因敲入，而未能发生重 组的菌株则由于基因组断裂死亡。 该方法巧妙地应 表达 Red 重组酶，在鼠李糖诱导下表达归巢内切酶 用 I,SecI的切割功 能，既达到了大量产生打靶片段 ，使用该质粒进行基因操作，可大大缩短实验I,ceSI 的目的，又达到了负筛选的目的，使用该方法，最长 可将 7 kb 的外源基因敲入大肠杆菌基因组， 该长 度为已有报道的最高值。 3 应用研究进展 3,1通过删除非必需序列提高系统的 稳 定 性 和 产 物水平 大肠杆菌属于紫细菌，是生理活性最丰富的一 类细菌， 可与多种物质代谢及能量代谢途径兼容， 因而成为主要的宿主细胞。 但其在动物肠道和环境 进化过程中所获取的部分基因组对某些用途是不 需要的，甚至可能是有害的，尤其是一些可移动元 [27]件的存在严重影响大肠杆菌的遗传稳定性。 因此， 删除非必需的基因片段和可移动元件，构建遗传稳 定的微生物底盘，是目前研究的热点之一。 Red 同源 重组技术是大肠杆菌基因组减小研究中应用最多 的方法，以下简单介绍大肠杆菌基因组减小的研究 [28] 进 展 。 2002 年 ，Kolisnychenko 等 以 大 肠 杆 菌 MG1655为基 础， 构建了基 因 组 减 小 8,1 ,的 菌 株 [22]。 年，等在 的基础上继MDS122006 Posfai MDS12 图 2 Geneg orging 法示意图 续构建菌株 和 ， 其基因组分别减小MDS42 MDS43 参考文献 14,3和, 15,3。, 其中，MDS42 与改造前相比，基因 组更加稳定，质粒突变率减小 21,，电转效率提高。 Datta S, Contstiano N, Court D L, A set of re combineering[1][29]plasmids for gram )negative bacteria [J], Gene, 2006,37 9:109 ) 2005年 ，Hashimoto 等将大肠杆菌 MG1655基因 组 115 ,减 小 29,7 ,， 改 造 为 菌 株 Δ16， 但 他 们 发 现 与 Zhang Y M, Buchholz F, Stewart A F, et al, A new l ogic for MG1655 相比，Δ16 生长缓慢， 存在 4 个以上拟核， [2]DNA engineering using recombination in Escherichia c oli [30]菌体形态膨大。 2007 年，Mizoguchi 等将大肠杆菌 [J],N at Genet,1 998,20(2):123 ,W3110基因组减小 了 22,，改造后的菌株对数生长 Zhang Y M, Murers J P, StewAa rt F, et al, DNA cloning by [3]期更长，最终菌浓是改造前的 1,倍5 ，使用该宿主生 homologous re combination in Escherichia c oli [J], Nat Biotech- nol, 2000,18(12):1314 ,产 L)苏氨酸， 其产量与改造前相比提高了 2,倍4 。 Sharan S , ThomasonL C, uznetsov S G, et la, Recombi- KK随着 Red 同源重组技术的发展，相信今后会有更多 neering: a homologousre combination based method goef netic [4]基因组减小的菌株被报道。 engineering[J], Nat Protocols,200 9,4(2):206)223 , Stahl M M, ThomasonL , Poteete A R, et al, Annealing vs in- vasion in phage lambda rec ombination [J], Genetics, 1997,147: [5] 3,2优化多基因代谢途径 961)977, 多基因代谢途径中，各个酶基因的表达水平协 Kuzminov A, Recombinationa repair of DNA damage in Es- l cherichia coli and batceriophage lambda[J], Microbiol Mol Biol 调程度是影响目的物产量的重要因素。 协调基因表Rev, 1999,63:751)813 , [6]达的常用方法主要是改变基因拷贝数 、 启动子 强 Ellis H M, Yu D, Court D L, et al, High efficiency mutagene- 度、核糖体结合位点,RBS,序列等。 Red 同源重组技 sis r epair and enigneering of chromosomal DNA using si ngle) 术可精确地实现序列改造，是优化多基因代谢途径 strandedo gonucleotdes[J], Proc Natl Acad Sc USA, 2001,98: liii [7][31]6742)6746 ,中较常用的手段。 2009 年，Wang 等使用 Red 同源 Court D L, Sawitzke AJ , Thomason L C,G e netic engineering 重组技术模拟自然进化过程，设计一系列人工合成 using homologous recombination[J], Annu Rev Genet, 2002,36: 的单链寡核苷酸作为打靶片段，通过计算机控制的 361)388 ,循环系统反复进行同源重组 ,多重自动基因操作， [8]Poteete A R, Involvement oDfNA replication in phage la mbda MAGE, ， 对番茄红素代谢途径中 24 个相关酶的基 Red )mediated homologous re combination [J], Mo Microbiol, l因的 RBS 同时进行突变， 循环 35 次后测定番茄红 2008,68:66)74 , 素产量。 仅用 3 d 时间就筛选出一株番茄红素产量 [9] 提高 5 倍的突变株，超过了有记录的最高产量。 异源代谢途径在基因组上整合进化3,3 [10] Maresca M , Erler E, F U J, et a l, Single)stranded heterodu-异源代谢途径的稳定性是一个重要的待解决 plex intermediates in lambda Red homologous 问题。 通过质粒载体引入异源代谢途径，质粒的不 recombination[J],BMC Mo Biol, 2010,11:54 ,l稳定性是引发代谢途径不稳定的重要因素之一。 染 [11] Mosberg J , Lajoe M J, Church G M, Lambda Red creombi- Ai色体是最稳定的基因载体，而且不需要抗性选择来 neering in Escherichia c oli occurs through fullya single ) 维持，具有无可比拟的优势。 染色体作为异源代谢 strandedi ntermediate[J], Genetics, 2010,186(3):719, 途径的载体的缺点主要是拷贝数低，极大地限制了 [12] Murers J P, ZhaYng M , Stewart F, et al, Rapid modification of bacteria artificia chromosomes by ET )recombination ll各酶基因的表达量， 严重影响产量。 2008 年，Keith [J],Nu cleic Acids Res, 1999,27(6):1555 ,[32]等结合使用 Red 同源重组系统和 RecA 同源重组 [13] DatsenkoK A, Wanner B L, One)step inactivation of c hromo- 系统，发明了染色体进化技术，解决了该问题。 染色 somal genes in Escherichiac oli K)12 using PCR products 体进化技术可使外源基因在基因组上的拷贝数自 [J],Pr oc Natl Acad Sci USA, 2000,97:6640 , [14] Yu D, Ellis H M, Court D L, et al, An efficient recombination 发、可控化地增加。 其主要原理是,首先使用 Red 同 system for chromosomein eeenrigng in Escherichiac oli[J], Proc 源重组技术，将一段融合有抗性基因的外源代谢途 Natl Acad Sci USA, 2000,97:5789, 径敲入大肠杆菌染色体,敲入序列包含重复序列,， [15] NakayamaM , Ohara O,Im provement roefc ombination efficien- 之后在 RecA 的作用下， 重复序列之间的片段在染 cy by mutation of red prteoins [J], Biotechniques, 2005,38 (6): 色体上发生同源重组，外源代谢途径拷贝数逐级增 917, 加，在不断增大抗性筛选压力的过程中，拷贝数高 [16] Wang J, Zhang Y M, Stewart A F,A n improve d recombineer- ng approach by adding RecA to lambda Red i的重组菌株被富集，最终外源基因从单拷贝增加到 recombination[J],M ol Biotechnol, 2006,32(1):43 , 40 个拷贝。[17] Russell C B, Dahlquist F W, Ex change of hr ocmosomal and plasmid alleles in Escherichia c oli by selection for loss of a dominant antibiotic sensitivmarker[J]ity , Bacteriology, 1989,171:640)647, 2614)2618 ,[25] Y u B J, Kang K H, Lee J H, et al, Rapid and efficient con - [18] Warming S, Costantino N, DC oL,urt et al, Simple andhigh ly struction omarkerf less deletions in the Escherichia coli genome[J]Nuc, leic Acids Res, 2008,36:84 ,efficient BAC recombineering using galK selecti[J]on, N ucleic Acids Res, 2005,33(4):e36 ,[26] Kuhlman T E, Cox E C,S it e)specific chromosointegratimal on [19] Devito AJ, R ec ombineering with tolC as a se lectabe l, counter) of large synthetic constructs[J] ,Nucleic Acids Res, 2010,3(6): 8 e92, selectable marker: remodelingrRN theA operons oEf scherichia coli[J] ,Nucleic Acids Res, 2008,36:e4 ,[27]方宏 清，陈惠鹏, 大肠杆菌基因组减小研究进展[J] ,生物技术 [20] Wong Q N, Vivian C W, Marie C M, et al, Efficient and 通讯, 2009,20(4):564)567 , seamlessD NA recombineering usingthymidy a late synthaseA [28] Posfai G, Plunkett G, Feher T, et a l, Emergent properties of selection system in Escherichia c oli [J],N ucleic Acids Res, reduced )genome Escherichia coli [J] ,Science, 2006,31 2 (5776): 2005,33:e59 ,1044)1046 , [21] Herring, C D, Glasner J D, Blattner F R, Gene rep acement l[29] Hashimoto M, chimura T, Mizoguchi H , et al, Cell size and I without selection: regulated suppression of amber mutations in nucleoid organization of engineered Escherichia coli cells with Escherichiac oli[J] ,Gene, 2003,311:153)163 ,a reduced gen ome[J]Mo,l Micr obiol, 2005,55(1):137)149 ,[22] Jamsai D, Orford M, Nefedov M, et al, Targeted mdificatioon of a human β) golbin ocus BAC clone using GET recombina- l tion and an I )SceI untersecolection cassette [J] ,G eno mics, [30] Mizoguchi H, Mori H, Fujio T,Escherichiac oli minimum2003,82:68)77 , genome factory[J]Biotechn, ol Appl Biochem, 2007,46:157)167,[23] Lee D J, Bingle E H, Heurlier K, et al, Gene doctoring: a [31] Wang H H, Isaacs F J, Carr P A, et al, Programming ce lls by method for recombineering in laboratryo and pathogenicEs - multiplex genome engineering and acceloeratedlution[J] e v, Na- cherichia coli strains[J], BMC Microbiol, 2009,9:252 ,ture, 2009,460:895)898 , [24] K olisnychenko V, Plunkett G, Herring C D, et al, Engineering [32] Tyo E J, Ajikumar P K, StephanopoulosG, Stabilized genea reduced Escherichia coli genome[J] ,Genome Res, 2002,1 2(4): duplication enabllesong )term selection)free heterlogoous path-way expression[J] ,Nat Biotechnol, 2009,27:760)765 ,