红旱莲总黄酮的含量分析

红旱莲总黄酮的含量分析 ? 1494?安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2009Dec;13(12) 红旱莲总黄酮的含量分析 周丽,张睿,马燕,高家荣,夏伦祝 (安徽中医学院第一附属医院药学部,安徽合肥230031) 摘要:目的测定红旱莲中总黄酮的含量.方法以芦丁为对照品,用分光光度法于 410m处测定红旱莲中总黄酮的含量.结 果红旱莲总黄酮含量为2.75%,芦丁在12.688,76.128mg?L(r=0.9999)范围内线性 关系良好,平均回收率为97.38%. 结论该测定方法简便易行,准确可靠,可作为红旱莲总黄酮质量控制的方法. 关键词:红旱莲;总黄酮;含量测定 DeterminationoftotalflavonoidsinHypericumascyronL. ZHOULi,ZHANGRui,MAYan.GAOJia.rong.XIALun.zhu (DeptofPharmacy,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiCollegeofTraditionalChineseMedicine,Hefei230031) Abstract:AimTodeterminethecontentoftotalflavonoidsinHypericumascyronL.MethodsRutinwasusedasastandardeom— pound.thetotalflavonoidsinHypericumascyronL.wasquantitatedbymeasurementofabsorbanceat410nm.ResultsThecontentof totalflavonoidsinHypericumascyronL.was2.75%.Thelinearitywasobtainedovertherangebetween12.688and76.128mR?Lfr =0.9999).Theaveragerecoverywas97.38%.ConclusionThemethodisconvenientandreliable.Itcanbeusedasaqualitycon— trolmethodoftotalflavonoidsinHypericumascyronL. Keywords:HyperieumascyronL.;totalflavonoids;determination 红旱莲别名湖南连翘,黄花刘寄奴,旱莲草等0J,为藤黄 科金丝桃属植物黄海棠HypericumascyronL.的全草,始载于 《江苏植物药志》.该植物主产于浙江,江苏,安徽,湖南等地, 其味微苦,性寒,归肝经,具有解毒消肿,凉血止血之功效.红 旱莲中含有多种黄酮成分,主要为芦丁,金丝桃苷,槲皮素, 山奈酚,异槲皮苷等,现代药理研究报道刮该黄酮成分对脑缺 血损伤,心肌缺血,肝损伤具有保护作用.为了研究红旱莲中 的黄酮成分,我们以A1C1比色法测定红旱莲总黄酮含量. 1仪器与试药 1.1仪器安捷伦6010型紫外可见分光光度计,安捷伦科 技上海分析仪器有限公司;赛多利斯BT25S电子分析天平, 北京赛多利斯仪器系统有限公司;CQ250超声波清洗器,上海 超声波仪器厂;梅特勒百万分之一天平. 1.2试药红旱莲购自合肥市和义堂中药材饮片公司,产地 为巢湖,由安徽中医学院药学院鉴定教研室潘鲁敏副教授鉴 定,为藤黄科金丝桃属植物黄海棠的全草.芦丁对照品,购自 中国药品生物制品检定所,批号10080—200306,其余试剂均 为分析纯. 同培养基,于两管中分别接人小于100cfu的试验菌,前者作 为阳性对照管,后者作为试验管.再取硫乙醇酸盐培养基及 改良马丁液体培养基分别泵入另两管集菌器中,作为阴性对 照管.各试验菌同法操作,培养3,5d.结果见表2. 表2方法验证试验 …菌……照,q:饲『柔.邑HW:l置l月H廿球菌胞菌杆菌…一一珠菌"………… 试验对照试验对照试验对照试验对照试验对照试验对照硫改 注:对照:菌+培养基;试验:样品+菌+培养基;阴性对照:硫乙醇 酸盐及改良马丁培养基 经pH7.0氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗后,金黄色葡萄球 菌,铜绿假单胞菌,枯草芽孢杆菌,生孢梭菌和白色念珠菌,黑 曲霉48h后均能生长.可消除其抑菌作用. 3.2样品检查取本品3瓶吸取6ml溶于100mlpH7.0氯 化钠一蛋白胨溶液中,按薄膜过滤法滤至全封闭集菌器中,经 冲洗(细菌300ml,真菌100m1),2管中加入硫乙醇酸盐培养 基,其中1管接入金黄色葡萄球菌作为阳性对照,另1管加入 改良马丁培养基,培养7d,逐日观察,供试品管均澄清,阳性 管菌生长良好,判定供试品符合规定. 4讨论 阿奇霉素对革兰阳性需氧微生物如金黄色葡萄球菌,肺 炎链球菌等有抑菌作用;对大多数革兰阳性菌,部分革兰阴性 菌及一些非典型致病菌均有效.眼用液体制剂为特殊品 种,为了保证其疗效,稳定性及避免对使用者的潜在危害 性,制定更严格的微生物限度标准,按无菌产品的要求进行控 制. 本品对霉菌和酵母菌弱抑菌作用,但改良马丁培养基可 以检出硫乙醇酸盐流体培养基不能检出的一些需气菌,所以, 真菌检查管和细菌检查管条件应该一致.因此,阿奇霉素滴 眼液微生物限度检查方法为:至少取2瓶,吸取供试液6ml, 用pH7.0氯化钠一蛋白胨100ml溶解,采用薄膜过滤法,冲洗 量为每个滤膜300ml,阳性对照菌为金黄色葡萄球菌. 参考文献: [1]国家药典委员会.中国药典(二部)[s].北京:化学工业出版 社,2005:附录6. 『2]PetersDH,FriedHA,Metwsl~D.Azithromycin:Areviewofitsan— timierobialactivity,pharmacokineticpropertiesandclinicaleffieien— cy[J].Drug,1992,44(5):750—99. [3]国家药典委员会.中国药典(一部)[s].北京:化学工业出版 社,2005:附录16. (收稿日期:2009—06—15) 安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2009Dec;13(12)?1495? 2方法与结果 2.1对照品溶液的制备精密称定芦丁对照品15.86mg,至 50ml量瓶中,加30ml乙醇使溶解,加水定容至50ml,即得 每1ml含芦丁0.3172mg的对照品溶液. 2.2供试品溶液的制备精密称取红旱莲粉末(40目)约 1.0g,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50ml,超声提取1h, 放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,即得 供试品溶液. 2.3测定波长的选择精密吸取对照品溶液和供试品溶液 各1m1分别置25m1量瓶中,加水至5ml,准确加入pH4.5的 醋酸一醋酸钠缓冲液5ml和0.1tool?L三氯化铝3ml,加 水稀释至刻度,摇匀,放置40min,以水5ml如上法操作得空 白溶液,于6010型紫外可见分光光度计上,在200—600nm 波长范围内进行扫描.结果对照品溶液和供试品溶液在4t0 nm波长处均有最大吸收,故确定测定波长为410nm. 2.4线性关系考察精密移取对照品溶液1.0,2.0,3.0,4. 0,5.0,6.0ml至25ml量瓶中,加乙醇稀释至刻度,摇匀,再 分别移取该溶液各1ml至25ml量瓶中,按2.3项下依法操 作并显色,照紫外可见分光光度法(中国药典2005版一部附 录V)试验,在410nm波长处测定吸光度.以吸光度为纵坐 标,芦丁浓度为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程为:Y= 0.O116X+0.0011,r=0.9999,结果表明,芦丁在12.688,76. 128mg?L范围内线性关系良好. 2.5精密度试验精密吸取对照品溶液3ml置25ml量瓶 中,依法操作并显色,测定吸光度,重复测定6次,结果RSD 为0.98%,说明仪器精密度良好. 2.6稳定性试验同一份样品,按供试品溶液制备方法制备 样品液,依法操作并显色,每隔1h测定其吸光度值,结果 RSD=1.37%,说明样品在4h内稳定. 2.7重复性试验取同一批红旱莲粉末6份,每份1.0g,按 供试品溶液制备方法制备样品液,取样品液1ml至25ml量 瓶中,按2.3项下依法操作并显色,测定吸光度,计算总黄酮 的含量,结果RSD=1.56%,表明该法重复性好. 2.8加样回收率试验精密称取已知含量的红旱莲粉末 (过40目筛)0.5g,6份,精密加入芦丁对照品适量,按供试品 溶液制备方法制备样品液,取样品液1ml至25ml量瓶中,按 2.3项下依法操作并显色,测定吸光度,计算回收率,结果见 表1,平均值97.38mg,RSD为1.27%. 表1加样回收率测定结果(/'t=6) 2.9样品测定取样品3份,按供试品溶液制备方法制备样 品液,取样品液1ml至25ml量瓶中,按2.3项下依法操作并 显色,测定吸光度,计算红旱莲药材中总黄酮的含量,结果总 黄酮含量分别为:26.958,27.543,27.945mg?g,,平均含量 为27.482mg?g,,RSD为1.81%. 3讨论 3.1红旱莲为常用药材其中黄酮部分有明显的生物活性, 其中芦丁是其主要活性成分,因此,以芦丁作为检测指标测定 红旱莲总黄酮的含量较为客观合理. 3.2总黄酮的分析方法较多如比色法,紫外分光光度法, 薄层扫描法,HPLC法等.由于红旱莲中除含有多种黄酮成 分外,还含有大量的具有邻二羟基黄烷类鞣质,采用NaNO:一 A1(NO)一NaOH比色法在510nm处测定总黄酮含量的方法 专属性不强,有局限性,准确性较差J.黄酮成分与 NaNO,A1(NO),NaOH试剂反应产生红色物质,文献认为其 反应原理是发生在黄酮母核B环的3,4一邻二酚羟基部位. 而有邻二酚羟基结构的非黄酮类成分原儿茶醛,原儿茶酸,绿 原酸,鞣质也可与NaNO:,A1(NO),NaOH试剂反应产生红色 物质,并在510nm有较强吸收.黄酮类成分黄芩素,山奈酚 由于无邻二酚羟基,在510nm几乎无吸收.由此可见该方法 专属性差,含量测定结果不准确.薄层扫描法测定红旱莲总 黄酮的影响因素太多,稳定性和精密度均不理想.总黄酮中 成分太多,采用HPLC法根据每个黄酮成分的含量测定总黄 酮的含量也并不适宜.此外,用紫外分光光度法波长扫描结 果显示,红旱莲药材在360nm处无最大吸收峰,可见在360 nm处测定总黄酮含量干扰成分太多,也不便采用.我们根据 红旱莲所含的黄酮类成分其黄酮母核多具有4一羰基,5一羟基 ,5一羟基发生络合而显色的原理,采 结构,利用Al与4一羰基 用A1C1比色法在410nm处测定红旱莲药材中总黄酮的含 量",此种方法能避开邻二酚羟基黄烷类鞣质的干扰,测 定结果较为科学,准确,可用于红旱莲总黄酮的含量测定. 3.3超声提取效率较高以甲醇为溶媒,分别将红旱莲药材 粉末于甲醇中超声提取0.5,1,1.5h进行比较,结果红旱莲 总黄酮的含量在1h后无明显增加,超声1h即可. 参考文献: [1]国家中医药管理局主编.中华本草[M].上海:上海科学技术 出版社,1999:2002—3. 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