伊贝沙坦联合培哚普利治疗对压力负荷性心肌肥厚大鼠心肌钙调神经磷酸酶及钙泵的影响

伊贝沙坦联合培哚普利治疗对压力负荷性心肌肥厚大鼠心肌钙调神经磷酸酶及钙泵的影响 伊贝沙坦联合培哚普利治疗对压力负荷性心肌肥厚大鼠心肌钙调神经磷酸酶及钙泵 的影响 ?650?高血压杂志2005年10月第13卷第1O期ChinJHypertension,Oct2005,Vo1.13No10 伊贝沙坦联合培哚普利治疗对压力负荷性 心肌肥厚大鼠心肌钙调神经磷酸酶及钙泵的 影响 姜庆军,徐耕,朱有法 【摘要】目的初步探讨钙调神经磷酸酶,钙泵和血管紧张?素在大鼠压力负荷性心肌肥厚中的变 化及伊贝沙坦和培哚普利联合应用对它们的影响.方法4O只雄性SD大鼠随机分为5组,每组8只. 除假手术组外,其余4组大鼠采用腹主动脉部分结扎法造成压力负荷性心肌肥厚模型,术后1周分别用下 列药物开始灌胃:假手术组生理盐水2mL/kg?d,对照组生理盐水2mL/kg?d,伊贝沙坦组(20mg/kg? d),培哚普利组(2mg/kg?d)及联合用药组(培哚普利2mg/kg?d,伊贝沙坦20mg/kg?d).用药6周 后测量左室质量指数(LVMI),血浆和心肌AngII,心肌钙调神经磷酸酶及钙泵活性的变化.结果联合 用药组LVMI((214?0.12)显着低于对照组(2.99土0.16)及单用伊贝沙坦(236土013)或培哚普利组 (2.39?0.16)(P<O.05),伊贝沙坦组血浆AngII(伊贝沙坦:630土5O7比假手术:309土29.9,对照:310 土36.8,培哚普利:288?36.9,联合用药:327土46.1,P<O05)及心肌AngII(伊贝沙 坦:7.15土0.50比 假手术:3.11士0.93,对照:5.04土0.35,培哚普利:3.21土0.34,联合用药:3.31土0.36,P<O.05)显着高 于其他组,各用药组钙调神经磷酸酶活性显着低于对照组(假手术:0.44土0.04,培哚普利:0.51土0.05, 伊贝沙坦:0.51土0.03,联合用药:0.49?0.04比对照:0.61土0.03,P<O.05),对照组心肌肌浆网钙泵活 性显着降低(对照:36土069比假手术:6.85土088,培哚普利:451?o.58,伊贝沙坦:4.45土0.55,联 合用药:5.63土0.61,P<O.05),联合用药组可明显增加钙泵活性至正常.相关显示LVMI与CaN呈 显着正相关(r一0.80,P<O.01),与钙泵活性呈负相关(r=一0.726,P<O.01).结论伊贝沙坦升高心 肌AngII而培哚普利对其无影响,两者均能降低心肌钙调神经磷酸酶活性,升高心肌钙泵活性,联合应用 更有利于改善心肌肥厚. 【关键词】伊贝沙坦;培哚普利;压力;心肌肥厚;大鼠 EffectsofIrbesartanandPerindoprilonCalcineurinandSarcoplasmicReticulumCa2一ATPaseinPressureO— verload-inducedCadiacHypertrophyinRatsJIANGQing—jun,XUGeng,ZHUYou—fa.1.De— partmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospital,DepartmentofPathology;2.Medic alcol— lege,ZhejiangUniversity,Hangzhou310009,China [Abstract]ObjectiveTostudytheeffectsofirbesartanandperindoprilcombinationtreatment onthe changesofcalcineurin(CaN),sarcoplasmicreticulumCa-ATPase(SRCa一ATPase)andplasmaandmy— ocardiumangiotensinII(AngII)inpressureoverload—inducedcardiachypertrophyinrats.Methods FortymaleadultSpragueDawleyratsweredividedinto5groups:shamoperationgroupandao rticbanding groups.Oneweekafteroperation,ratsweregavagedwithnormalsaline,perindopril,irbesart anorcom- binationofperindoprilandirbesartan.LVMI,plasmaandtissueAngII.CaNandSRCa一ATPaseac— tivityweredeterminedattheendof6weektreatment.ResultsLVMI(control:2.99土0.16VScombina— tion:2.14土O.12,Irbesartan:2.36土0.13,Perindopril:2.39?0.16)mg/g(P<O.05),CaN(control:0.61土 0.03VSsham:0.44土0.04,Perindopril:0.51土0.05,Irbesartan:0.51_-k-0.03,combination:0.49?0.04) ? 论着? 收稿日期:2005—02—05 作者单位:1.浙江大学医学院附属第二医院心内科,2.浙江大学医学院病理学教研室,浙江杭州310009;通讯作者:姜庆军(现在宁波市 医疗中心李惠利医院心内科,浙江宁波315041) 高血压杂志2005年10月第13卷第1O期ChinJHypertension,Oct2005,Vo1.13No10.651. A4,onm/mg'pr(P<O.05)activitywereremarkablydecreasedafterdruginterventionwhic hwasmostre— markableinthecombinationgroup.ThelevelsofAng?inp1asma(Irbesartan:630~50.7vssham:309 ?29.9,control:310?36.8,Perindopril:288?36.9,combination:327?46.10)pg/mL(P<0.05)andmv— ocardium(Irbesartan:7.15?0.50VSsham:3.11?0.93,control:5.04?0.35,Perindopril:3.21?0.34, combination;3.31? O.36)pg/mL(P<0.05)wereremarkablyincreasedinirbesartangroup.SRCa一 ATPaseactivitywereincreasedafterdrugintervention(contro1:3.6?0.69VSsham:6.85? 0.88,Perindo— pri1:4.51?0.58,Irbesartan:4.45?0.55,combination:5.63? 0.61)mmo1Pi/gprotein?h(P<O.05),as— peciallyinthecombinationgroup.LVM1waspositivelycorrelatedwithCaN(r=0.80,P<O .01),nega— tivelycorrelatedwithSRCa一ATPase(r一一 0.726,P<0.01).ConclusionIrbesartanincreasedAng ? inmyocardiumwhileperindoprildidnot.BothirbesartanandperindoprildecreaseCaNactivi ty.in— creaseSRCa一 ATPaseactivity.IrbesartanandperindoprilcombinationtreatmentwasshowntOhave bettereffectsonregressionofventricularhypertrophy. [Keywords]Irbesartan;Perindopril;Pressure;Cardiachypertrophy;Rats 心肌肥厚是心肌细胞对不同刺激(如机械牵拉, 神经体液性因素)的一种适应性反应,除心肌细胞体 积增大外,伴随心肌细胞间结缔组织沉积.长时间 的刺激如压力负荷增加可导致心脏由最初的有益的 代偿发展为失代偿,心脏顺应性下降,舒张功能下 降,最后发生心律失常,心力衰竭甚至猝死.众多研 究表明左室肥厚是心血管病并发症的独立危险因 素,是心血管疾病发生率和死亡率强有力的预测因 子之一[1].血流动力学,神经,内分泌等众多因素 参与了心肌肥厚的发展过程,尽管人们在这方面做 了大量研究工作但目前对心肌肥厚发生的具体机制 仍不十分清楚.最近Molkentin[3等发现了钙调神 经磷酸酶(Calcineurin,CaN)介导的心肌肥厚通路: 多种原因引起胞浆内Ca浓度增高,激活CaN并通 过一系列中间环节导致心肌肥厚.但此后对于CaN 是否参与心肌肥厚过程有不同观点[4].我们通过 腹主动脉部分结扎造成大鼠压力负荷性心肌肥厚, 观察伊贝沙坦和培哚普利对左室质量指数(1eftven— tricularmassindex,LVMI),血浆Ang?,心肌 Ang1I,CaN及肌浆网钙泵(sarcoplasmicreticulum Ca抖一ATPase,SRCa抖一ATPase)活性的影响. 1材料和方法 1.1材料 成年雄性Sprague-Dawley大鼠,SPF级,体重 16O,180g,由中国科学院上海实验动物中心提供, 合格证号:中科动管第003号;培哚普利(perindo— pril),法国ServierIndustries生产,批号:lc0401;伊 贝沙坦(irbesartan),法国SanofiWinthropIndus— tries生产,批号:825;钙调素购自Sigma,牛血清白 蛋白,二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT),乙醇二乙 醚二氨基四乙酸[ethyleneglycolbis(2一aminoethyl— ether)tetraaceticacidEGTA],对硝基磷酸酚(p-Ni— trophenylphosphate,PNPP),苯甲基磺酰氟(phe— nylmethysulfonylfluoride,PMSF)等购自上海生物 工程公司,ATP酶测试盒及总蛋白定量测试盒购自 南京建成生物工程公司.其余试剂为市售分析纯 级. 1.2建立模型及分组 将4O只大鼠随机分为5组,每组各8只.按 [8]的方法行腹主动脉部分结扎术.即在 Doering等 肾动脉上方分离腹主动脉并部分结扎,使结扎处动 脉保留直径约0.7mm空隙,假手术组大鼠为游离 腹主动脉后不结扎.术后大鼠腹腔给予青霉素5万 单位,预防感染.术后1周分别用下列药物开始灌 胃:假手术组和对照组生理盐水2mL/kg?d,伊贝 沙坦组(20mg/kg?d),培哚普利组(2mg/kg?d) 及联合用药组(培哚普利2mg/kg?d,伊贝沙坦2O mg/kg?d).灌胃1次/d,持续6周. 1.3观测指标 灌胃6周后腹腔内注射戊巴比妥钠(20mg/kg) 麻醉大鼠,从腹主动脉取血3mL测定血浆Ang?. 迅速取出心脏用预冷的生理盐水灌洗,冲掉残留于 血管与心脏内的血液,分离左室心肌组织(包括左心 室游离壁和室间隔),滤纸吸干心肌表面水分,称重, 液氮冷冻后一7O?冰箱保存备用.(1)左室质量指 数(LVMI):LVMI一左室湿重/体重(mg/g).(2) 血浆Ang?测定:从腹主动脉取血3mL,立即注入 预冷的含0.3mmol/LNa2EDTA50L,0.34 ?652?高血压杂志2005年10月第13卷第1O期 ChinJHypertension,Oct2005,Vo1.13No10 retool/L8一羟基奎啉5OI和0.32mmol/L二巯基 丙醇25L的试管中,混匀后4?3500r/rain离心 5min,取血浆于一7O?保存待测,放免法测血浆 AngII活性.(3)心肌AngII测定:取冻存左室心 肌组织,剪碎,加入1mol/I乙酸1mL,煮沸1O min,冷却后冰水浴中匀浆,4?离心20min(3000 r/rain),取上清液一70.C保存待测,测定方法与血 浆AngII相同.(4)测定心肌组织钙调神经磷酸酶 活性:参考符民桂等方法.组织提取液的制备:取 心室肌约100mg,用冷生理盐水洗涤后,剪碎,迅速 置入预冷的匀浆液中,匀浆液含50mmol/LTris, pH7.5,0.1mmol/IEGTA,1mmol/IEDTA, 0.5mmol/IDTT,50ug/mLPMSF,50t~g/mI STI,5btg/mIleupeptin,5t~g/mLaprotinin.在 Polytron上匀浆(13500r/min,10S×2),4?离心 (12000g×10min),取上清蛋白定量后进行CaN 活性测定.(5)心肌肌浆网钙泵(SRca抖一ATPase) 活性测定:先参照Jones等的方法制备大鼠心肌 肌浆网膜:取左室心肌组织并称重,匀浆液为1O mmol/L的NaHCO.,pH7.4.以下各步均在4? 以下操作.将心肌组织放入5mI匀浆液中,剪碎, 用GF一1内切式组织匀浆器,于1/2最大转速下,匀 化3次,3Os/次,制成组织匀浆.应用GL一20C型 高速冷冻离心机,选用GI一2O转头,先以4000g (6000r/rain)离心组织匀浆20min;取上清液,再 以14000g(11000r/rain)离心20min;取上清液最 后以41000g(19000r/rain)离心60min.弃上清, 将沉积物悬浮于2mI提取液中.提取液的组成 (mmol/I)为:600kCL,30组氨酸;pH7.0.匀浆器 8 6 0 打散10S,以41000g离心60min.弃上清,将沉积 ,4?下贮存备 物重新悬浮于1mL贮存液中,于0 用.贮存液的组成(retool/L)为:250蔗糖,2O组氨 酸;pH7.0.钙泵活性测定按试剂盒说明进行.测 定结果以mmolPi/gprotein?h表示. 1.4统计学方法 采用SPSS11.0软件包进行统计学分析,计量 资料用均数?差(?s)表示,多组间比较采用 方差分析(ISD),部分资料采用直线相关(Pearson) 分析.P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1左室质量指数 经6周治疗后,培哚普利组,伊贝沙坦组和联合 用药组LVMI均显着低于对照组(P<0.05),尤以 联合用药组最为明显,其LVMI低于单用培哚普利 或伊贝沙坦组(P<0.05,表1,图1). 表1各组大鼠SRCa2-ATPase(mmolPi/gprotein?h), 心肌Ang?(pg/mg)及LVMI(mg/g)比较(i?s) SR:肌浆网;a:P<0.05,与对照组比较 假手术对照培垛普利伊贝沙坦联合用药 a:P<0.05.与对照组比较 图1各组大鼠SRCa一ATPase(mmolPi/gprotein?h),LVMI(mg/g)及心肌Ang?(p~/mg)比较 一西E『6丘l『IH懈鳋鼬目 一西『6E一,簌詈}删峰删 一u_uIIojddIoEE一,躲医妄妄 高血压杂志2005年1O月第13卷第1O期ChinJHypertension,Oct2005.Vo1.13No10?653. 2.2血浆及心肌Ang?水平 伊贝沙坦组血浆Ang?显着高于其余4组大 鼠(P<O.05,表2,图2).伊贝沙坦组心肌Ang? 显着高于对照组(P<O.05),培哚普利组和联合用 药组则显着低于对照组,(P<O.05,表2,图1). 表2各组大鼠心肌CaN(A4,onm/mg?pr)及血浆Ang?(pg/mL) 比较(士sl =jr E {l啊} 糍 懿 舢 400 200 O假手术对照培垛普利伊贝沙坦联合用药 a:P<O.05.与对照组比较 闰2各组大鼠血浆Ang?(pg/mL)比较 2.3心肌钙调神经磷酸酶活性 培哚普利组,伊贝沙坦组和联合用药组CaN活 性显着低于对照组(P<O.05,表2,图3). 杂毒 要主 O.7 O.6 O.1 O 假手术对照培垛普利伊贝沙坦联合用药 a:P<0.05.与对照组比较 闰3各组大鼠心肌CaN(A4lonm/mgpr)}E较 2.4心肌肌浆网钙泵活性 对照组心肌肌浆网钙泵(SRCa抖一ATPase)活 性最低,培哚普利组,伊贝沙坦组和联合用药组SR— Ca抖一ATPase活性显着高于对照组(P<0.05),其 中联合用药组钙泵活性高于单用培哚普利或伊贝沙 坦组(P<0.05,表1图1). 2.5LVMI与心肌CaN及SRCa.ATPase活性相 关性分析 LVMI与CaN呈显着正相关(r一0.80,P< 0.01),与钙泵活性呈负相关(r一一0.726,P< 0.01) 3讨论 压力负荷,神经,内分泌等因素长期作用于心脏 引起心肌肥厚,心室重构(Ventricularremodeling), 表现为心肌细胞数量,质量及排列方式上发生改变 伴心肌间质(成纤维细胞,胶原纤维等)增生.左室 肥厚是心血管病并发症的独立危险因素,但其发病 机制目前尚不十分明确.伊贝沙坦和培哚普利都具 有良好的降压效果并能改善心室肥厚,但各自的作 用机制不同:前者是血管紧张素?I型受体拮抗剂, 后者是血管紧张素转换酶抑制剂.本实验通过部分 结扎腹主动脉的方法造成大鼠压力负荷性心肌肥厚 模型,术后分别采用生理盐水,培哚普利,伊贝沙坦 及两药合用灌胃6周发现3个不同的药物治疗组 LVMI均显着低于对照组,尤其以联合用药组明显. 联合用药组LVMI显着低于单用培哚普利或伊贝 沙坦组,说明两药合用更有利于左室肥厚的改善. 肾素一血管紧张素一醛固酮系统(RAAS)在心肌 肥厚的过程中有十分重要的作用,尤其是组织 Ang?.长期用ACEI后血浆Ang?对肾素反馈 减弱,致使肾素,AngI升高,继而血浆Ang11升 高;另外,血浆Ang11除了经RAAS路径生成外, 还可经其它途径如糜蛋白酶(chymase)途径产生, 因而,长期应用ACEI后会出现血浆Ang11水平恢 复或升高.本实验中除伊贝沙坦组血浆Ang?显 着升高外,其余各组大鼠血浆Ang11水平无显着差 异.心肌组织中伊贝沙坦组Ang11水平显着高于 对照组,而培哚普利组和联合用药组则显着低于对 照组.有较高心肌Ang11水平的伊贝沙坦组是如 何改善心肌肥厚的,其可能原因如下:(1)Ang1I是 通过与AT受体作用促进心肌细胞肥厚的,伊贝沙 坦是特异性AT受体拮抗剂可以阻断此作用.(2) 增高的Ang11可与AT.作用而产生抗肥厚作用: Ang11可与AT.受体结合可引起内源性缓激肽 (bradykinin)增加从而保护心脏[1;研究表明,AT2 激动剂可减少参与心肌肥厚的丝裂素活化蛋白激酶 ? 654?高血压杂志2005年1O月第13卷第1O期 ChinJHypertension,Oct2005,Vo1.13No10 (mitogen—activatedproteinkinase,MAPK)活 性;AT受体还可介导凋亡_l3],抑制细胞增 殖. 钙调神经磷酸酶(CaN)是Ca抖依赖的磷酸酶, 晚近研究表明它介导的信号通路在心肌肥厚中起 着重要作用:各种刺激如机械牵拉及神经体液因子 (Ang1I,ET一1等)均可使细胞内Ca抖浓度升高, Ca抖与胞浆内CaN作用使其活化,继而使活化T 细胞核因子(nuclearfactorofactivatedTcell,NF— AT3)去磷酸化而转位人核,人核后的NF-AT.可与 心肌细胞核内转录因子GATA结合促使心肌肥厚 反应性基因AFP,BNP,a—MHC,B—MHC等表达,从 而产生心肌肥厚.陈雯等_1发现肾性高血压大鼠 心脏CaN活性显着增高,认为CaN可能在心肌重 构中发挥重要作用.另有研究发现抑制CaN活性 可逆转心肌肥厚?].本研究中3组接受药物治疗 的大鼠心肌CaN显着低于对照组,与Fu等_1发现 一 致.说明CaN参与了压力负荷性心肌肥厚的过 程,伊贝沙坦和培哚普利对CaN活性均有抑制作 用. 本研究中对照组心肌肥厚最显着,其心肌肌浆 网钙泵(SRCa抖一ATPase)活性显着低于其它各组, 经伊贝沙坦,培哚普利治疗后心肌肌浆网钙泵活性 上升,尤其是联合用药组几乎恢复正常.SRCa抖一 ATPase是调节心肌细胞内钙离子浓度的重要部 位.SRCa抖一ATPase活性降低使胞浆游离钙重新 摄取贮存于肌浆网减少,另一方面心肌肥厚时局部 Ang1I生成增加,Ang1I与心肌细胞膜AT受体结 合,激活钙通道使细胞外钙内流;两者共同作用 造成心肌细胞内钙超载,升高的Ca通过CaN介 导了心肌肥厚.伊贝沙坦可阻止Ang1I与心肌细 胞膜AT受体结合而减少细胞外钙内流,培哚普利 则可抑制转换酶减少心肌局部Ang1I生成且两者 均有提高肌浆网钙泵活性的作用,两药可通过上述 作用机制减轻或改善心肌肥厚. 4参考文献 1 2 LevyD,GarrisonRJ,SavageDD,eta1.Prognosticimplica— tionsofech0cardi0graphicaIlydeterminedleftventricularmass intheFraminghamHeartStudy[J].NEngJMed,1990,322: 1561-1566. DevereuxRB.Leftventriculargeometry,path0physi010gyand prognosis[J].JAmCoilCardiol,1995,25;885—887. 3MolkentinJD,LuJR,AntosCL,eta1.Aealeineurindepend— enttranscriptionalpathwayforcardiachypertrophy[J].Cell, 1998,93:215-228. 4LimHW.DeWindtLJ.SteinbergL,eta1.Calcineurinexpres— sion,activation,andfunctionincardiacpressure-overloadhy— pertrophy[J].Circulation,2000,23,101:2431—2437. 5ShimoyamaM,HayashiD,TakimotoE.Calcineurinplaysa criticalroleinpressureoverload-inducedcardiachypertrophy [J].Circulation,1999,100:2449—2454. 6ZhangW,KowalRC,RusnakF.Failureofcalcineurininhibi— torstopreventpressure-overloadleftventricularhypertrophyin rats[J].CircRes,1999,84:722—728. 7DingB,PriceRL,BorgTK.Pressureoverloadinducessevere hypertrophyinmicetreatedwithcyclosporine,aninhibitorof calcineurin[J].CircRes,1999,84:729—734. 8DoeringCW,JalilJE,JanickiJS.Collagennetworkremodel— linganddiastolicstiffnessoftheratleftventriclewithpressure overloadhypertr0phy[J].CardiovaseRes,1988,22;686—695. 9符民桂,王晓红,姜志胜,等.环孢素A对儿茶酚胺诱导的大鼠 心肌肥大的作用[J].中华心血管病杂志,2001,29;41—44. 10JonesLR,BeschHR,FlemingJW.Separationofvesiclesof cardiacsarcolemmafromvesiclesofcardiacsareoplasmiereticu— lum.Comparativebiochemicalanalysisofcomponentactivities [J].JBiolChem,1979,254:530—539. 11CampbellDJ,KladisA,ValentijnAJ.Effectsoflosartanon angiotensinandbradykininpeptidesandangiotensin-converting enzyme[J].JCardiovascPharmacol,1995,26:233—240. 12HiroiY,HiroiJ,KudohS,eta1.Twodistinctmechanismsof angiotensin1Iinducednegativeregulationofthemitogen-acti— vatedproteinkinasesinculturedcardiacmyoeytes[J].Hyper— tensRes,2001,24:385-394. 13YamadaT,HoriuchiM,DzauVJ.Angiotensin?type2re— ceptormediatesprogrammedcelldeath[J].ProcNatlAcadSci USA,1996,93:156—16O. 14NakajimaM,HutchinsonHG,FujinagaM.Theangiotensin? type2(AT2)receptorantagonizesthegrowtheffectsofthe ATIreceptor;gain-of-functionstudyusinggenetransfer[J]. ProcNatlAcadSciUSA,1995,92:10663—10667. 15陈雯,谢晓华,常连庆,等.肾性高血压大鼠重要脏器钙调神经 磷酸酶活性的变化[J].高血压杂志,2004,12;66—69. 16盛红专,张寄南,杨国平,等.钙调神经磷酸酶在肾性高血压大 鼠心肌肥厚中的作用口].高血压杂志,2003,11:363—366. 17FuM,XuS,ZhangJ,eta1.Involvementofcalcineurininan— giotensin?inducedcardiomyocytehypertrophyandcardiacfi— broblasthyperplasiaofrats[J].HeartVessels,1999,14:283— 288. 18BersDM,PerezReyesE.Cachannelsincardiacmyocytes: structureandfunctioninCainfluxandintracellularCarelease [J].CardiovascRes,1999,42:339—360.