高效液相色谱法测定脊痛宁胶囊中葛根素的含量

高效液相色谱法测定脊痛宁胶囊中葛根素的含量 高效液相色谱法测定脊痛宁胶囊中葛根素 的含量 解放军药学2011年6月20日第27卷第3期Ph0mJChinPLA,:!!:!!! 高效液相色谱法测定脊痛宁胶囊中葛根素的含量 白林?, 王琪?,任耩? [摘要】目的建立脊痛宁胶囊中葛根素的含量测定方法.方法采用高效液相色谱法,十八烷基硅烷键合硅胶为 填充剂,甲醇一水(25:75)为流动相,检测波长:250am,柱温:4o?,进样量:10.结果葛根素在5—80范围内呈良好 线性关系,r=0.9999,平均回收率为97.4%,RSD为2.7%(/Z=6).结论该方法简便可行,重复性好,可用于该制剂中葛 根素的含量测定. [关键词]脊痛宁胶囊;葛根素;高效液相色谱法 [中图分类号]R927.2[文献标志码]A[文章编号]1008-9926(2011)03-0236-03 [DOI]10.3969/j.issn.1008-9926.2011.03.016 DeterminationofPuerarininJitongningCapsules byHighPerformanceLiquidChromatography BAILin? , WANGQi?,RENWei? ?DepartmentofDrugAnalysis ,MedicineSupplyCenter,GeneralHospitalofPLA,Beijing100853,China; ~ShenyangPharmceuticalUniversity , Shenyang110016,China [Abstract]ObjectiveToestablishaqualitymethodforJitongningCapsules.MethodsThecon centration ofpuerarininJitongningCapsuleswasdeterminedbyhighperformanceliquidchromatograp hy.ResultsTheav- erageconcen~ationofpuerarininJitongningCapsuleswas15.86mg/g.Puerarinshowedago odlinearrelation— shipintherangeof5— 80g/ml(r=0.9999)andtheaveragerecoverywas97.4%.RSDwas2.7%(n=6). ConclusionThismethodissimple,repeatableandsatisfactory.Itcanbeusedtocontrolthequal ityoftheprepa— rationeffectively.. [Keywords]JitongningCapsules;puerarln;highperformanceliquidchromatography 强直性脊柱炎被定义为以中轴关节慢性炎症为 主,也可累及内脏及其他组织的慢性进展性风湿性 疾病l1].目前病因未完全明确,传统治疗疗效不明 显J,对人们的生活造成了极大的影响和危害.脊 痛宁胶囊是解放军总医院优化筛选组方制成的具有 补肝益肾,祛风除湿,活血止痛功效,对强直性脊柱 炎有显着疗效,并已申报非标准制剂,该药由杜仲, 独活,葛根,甘草等7味药组成.葛根素的高效液相 色谱(highperformanceliquidchromatography,HPLC) 法含量测定已有文献[3,4]报道.本试验对脊痛宁 胶囊中葛根素的含量进行测定. 1仪器与试药 Agilent1200高效液相色谱仪,包括自动脱气 作者简介:白林,主任药师.研究方向:药品质量控制.Tel: (olo)66937436;Email:bailin301@126.conl 作者单位:?11300853北京,解放军总医院药品保障中心药检室; ?110016辽宁沈阳,沈阳药科大学 机,四元梯度泵,DAD检测器和化学工作站(美国 Agilent公司);葛根素对照品(中国药品生物制品检 定所);脊痛宁胶囊(规格:0.5粒,解放军总医院 制备,批号:20070116,20070122,20070125). 2方法与结果 2.1色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充 剂;以甲醇一水(25:75)作为流动相;检测波长: 250nm,柱温:40cC,进样量:10Ixl. 2.2溶液的制备(1)对照品溶液取葛根素对 照品约10mg,精密称定,置25ml量瓶中加30%乙 醇溶解并稀释至刻度,摇匀.精密量取2ml,置 10ml量瓶中,加30%乙醇至刻度,摇匀,即得(含葛 根素8Og/m1).(2)供试品溶液取本品20粒, 倾出内容物,混合均匀.取约0.5g,精密称定,置锥 形瓶中,精密加入30%乙醇5Om1,精密称定,加热 回流30rain,放冷,精密称定,用30%乙醇补足减失 的重量,摇匀,滤过,精密量取滤液2ml,置1Oml量 塾墨蕉堂堂!!苎望查箜塑P—ha—rmJChinPLA,Vo1.27,No.3,Jun20,2011 瓶中,加30%乙醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜 (0.22m)滤过,作为供试品溶液.(3)阴性样品 溶液按处方比例,取缺葛根的其他药材按脊痛宁 胶囊制法制备,再按2.2(2)项下供试品溶液的制备 方法制备,即得. 2.3系统适用性试验分别取葛根素对照品溶液,供 试品溶液,阴性样品溶液各1O按2.1项下色谱条件 进行测定.对照品峰形良好,葛根素保留时间约为 10min;供试品溶液中葛根素与其他组分分离完全,分 离度大于1.5.理论塔板数按葛根素计算不低于4000; 阴性样品对葛根素的测定无干扰,见图1. ,【皿jllJ A:对照品;B:阴性样品;C:供试品;1:葛根素 图1HPLC图 2.4线性关系考察精密量取对照品溶液适量,分 别置10ml量瓶中,用30%乙醇稀释至刻度,摇匀. 分别为5,1O,20,40,80g/ml的系列浓度溶液.按 2.1项下色谱条件测定峰面积值,以峰面积值(Y) 为纵坐标,浓度(X,g)为横坐标,绘制标准曲线,得 回归方程为: Y=40.651827X+4.4641827.r=0.9999 葛根素在5—8Og/ml浓度范围内呈良好线性 关系. 2.5精密度试验精密量取对照品溶液5ml置 10mI量瓶中,用30%乙醇稀释至刻度,摇匀,按2.1 项下色谱条件连续进样6次,峰面积平均值为 1641.77,RSD为0.12%. 2.6重复性试验精密称取本品(批号: 20070122)内容物6份,按2.2(2)项下方法制备供 试品溶液,按2.1项下的色谱条件分别进样,含量测 定平均值为16.10mg/g,RSD为0.8%. 2.7稳定性试验取样品(批号:20070122),按 2.2(2)项下供试品溶液的制备方法处理,分别在0, 1,2,4,8,24h测定,浓度平均值为16.196mg/g, RSD为3.72%,说明供试品溶液在24h内稳定性较 好. 2.8加样回收率试验取已知含量的样品(含量 为16.22291mg/g)6份,精密称定,置锥形瓶中,分 别精密加入葛根素对照品(2616g/m1)4ml,按2.2 (2)项下供试品溶液的制备方法制备,按2.1项下 色谱条件测定,计算回收率,结果见表1. RSD (%) 2.7 2.9样品含量测定取不同批次的脊痛宁胶囊, 按2.2(2)项下供试品溶液的制备方法制备,按2.1 项下色谱条件测定,每批样品测定3份,以3次测定 结果的平均值作为测定值,样品测定结果见表2. 表2葛根素含量测定结果(=3) 3讨论 葛根具有对心,脑血管,对平滑肌,对免疫功能 的药理作用.根据本制剂的工艺特点,选用 HPLC法测定葛根素含量作为本制剂质量控制的含 量测定指标,既可以较好地控制制剂成品的质量,也 可以作为提取工艺的控制指标. 供试品溶液制备采用加热回流提取的方法,有效 成分损失较少,稳定性良好,且操作简便,易于掌握. 据文献[6-9]报道葛根素的HPLC法测定多采 用甲醇一水,甲醇.水一冰醋酸,甲醇_().1%磷酸,乙腈 0.1%磷酸溶液等溶液配比作为流动相.本试验结 果显示,在甲醇一水(25:75)…,(下转240页) 一样,?面一卯 .一虮甜甜甜甜 , 髓姗姗取一mc; 解放军药学2011年6月20日第27卷第3期尸 m.,Chin,PLA,Vo1.27,No.3,Jun20,2011 (1:100)溶液提取测得样品中盐酸小檗碱的峰面积 最大.确定以盐酸一甲醇(1:100)溶液为提取溶媒. (2)提取方法的选择以盐酸一甲醇(1:100)溶液为 提取溶剂,分别采用超声30min和水浴回流30min 提取.结果说明样品回流提取比超声提取测得样品 中盐酸小檗碱峰面积大,回流提取效果好,确定采用 回流提取方法.(3)提取时间的选择分别称取相 同重量的样品,用盐酸一甲醇(1:100)溶液为提取溶 剂,水浴回流,分别选20,,30,60,90min提取测定, 结果表明样品分别在不同时间回流提取测得盐酸小 檗碱主峰的峰面积基本一致,为保证提取完全和考 虑到其他影响因素,最后确定提取时间为30min. (4)提取溶剂体积的选择分别称取相同重量的样 品,用盐酸一甲醇(1:100)溶液为提取溶剂,水浴回流 30min提取,分别用10,20,30ml比对.结果表明 不同体积测得样品中盐酸小檗碱主峰的峰面积基本 一 致,为保证提取效果,提取溶剂的体积确定为 20ml. 3.2波长的选择盐酸小檗碱的紫外吸收光谱有 4个最大吸收波长,分别为420,345,263,228nm. 本文分别测试了420,345,263nm波长的色谱结果. 选用420nm波长时,由于紫外吸收强度相对较弱, 反映出峰面积小,降低了主峰的检测灵敏度,且其他 无关成分也未能抑制;选263nm波长时,灵敏度高, 但主峰分离基线不好;选345nm波长时,灵敏度较 强,其他无关峰灵敏度相对较弱,能凸现出盐酸小檗 碱的主峰,分离能达到基线且平直.因此选择 345nm波长作为检测波长. 3.3流动相的选择中药和中成药中采用HPLC 法测定盐酸小檗碱含量的文献报道很多,笔者选择 了其中一些文献_l的流动相进行了测试,但均不 能满足本文的要求.在《中国药典》2005年版(一 部)收载的"黄连上清丸"含量测定采用的流动相 的基础上加以调整,确定以磷酸盐缓冲液 [0.05mol/L磷酸二氢钾和0.05mol/L庚烷磺酸钠 (1:1),含0.2%三乙胺,并用磷酸调节pH值至 3.0].乙腈(70:30)为流动相,能满足本品的分离要 求,达到分离效果好,峰形基本对称,结果能够重现, 耐用性好,阴性样品无干扰. 本文建立了HPLC法测定清心明目上清丸中盐 酸小檗碱的含量,操作简便,结果准确,能满足含量 测定要求,可作为药品质量控制手段,提高质量标 准,保证用药安全有效. [参考文献] [1]李文连,徐辉,明晓蜂.I-IPLE法澳4定黄连上清丸(水丸)盐酸 小檗碱含量[J].中国药品标准,2006,7(I):21-23 [2]刘芳,张浩,方清茂.黄连上清丸(片)中小檗型生物碱的 含量测定[J].中成药,2005,27(12):1393—1395 [3]林建阳,关军.高效液相色谱法测定黄连上清丸中盐酸小檗 碱的含量[J].中华中医药学刊,2002,20(4):544 [4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[s].北京:化 学工业出版社,2005.591-592 (收稿日期:2010-09-25;修回日期:201010-09) (本文编辑金杨红) (上接237页) 流速为1ml/min时阴性样品无干扰,且峰形尖锐,重 复性好,灵敏度高. 根据葛根素的紫外吸收图谱,葛根素在250nm 处有最大吸收,故选择250nlTl为检测波长_1.本 试验分别试用了0.8,1.0,1.2ml/min3种流速,综 合考虑分离度与时间,最终确定流速为 1.0ml/min [参考文献] [1]袁国华.强直性脊柱炎诊治进展[J].实用医院临床杂志, 2007,4(3):22-24 [2]张亚美,李晓兰,吴红丽,等.依那西普治疗强直性脊柱炎的短 期安全性分析[J].中国药物应用与检测,2009,6(1):4-5 [3]王艳,钟韶霞.高效液相色谱法测定玉液消渴颗粒中葛根素 的含量[J]_解放军药学,2008,24(5):453-455 [4]周欣,宋洪涛,游开仙.梯度洗脱HPLC法测定疏肝降脂胶 囊中葛根素,大豆苷及大豆苷元的含量[J].解放军药学, 2008,24(1):78-79 [5]郑皓,王晓静.葛根的药理作用研究概况[J].光明中医, 2006,21(3):49-51 [6]邱震,周正华,杜安全.HPLC法测定参苏感冒片中葛根素的 含量[J].安徽医药,2007,l1(1):29 [7]郭洁,卫吴,张晓双,等.HPLC法测定感冒清热泡腾片中 葛根素的含量[J].陕西中医学院,2007,30(3):42.43 [8]胡丹,暴瑞玲,曾妙甜,等.HPLC法测定清暑益气丸中葛根 素的含量fJ].解放军药学,2007,23(5):394.396 (9]魏彩霞,荣风英,杨静.HPLC法测定糖尿乐片中葛根素的含 量[J].陕西中医,2007,28(1O):1404—1405 [10]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[s].北京:化 学工业出版社,2005.233-234 (收稿日期:2010-07-02;修回日期:2010-.09-06) (本文编辑魏萍)