利用串联亲和纯化研究EHEC O157H7 III型分泌系统分子伴侣蛋白复合物（可编辑）

利用串联亲和纯化研究EHEC O157H7 III型分泌系统分子伴侣蛋白复合物（可编辑） 利用串联亲和纯化研究EHEC O157H7 III型分泌系统分 子伴侣蛋白复合物 分类号 S852.3学校代码 10129 U D C 619学号 2009301028 利用 串联 亲和 纯化 研究EHEC O157:H7 III 型 分泌 系统 分子 伴侣 蛋白 复合 物 Analysis of Type Three Secretion System Chaperone Protein Complexes of EHEC O157:H7 by Tandem Affinity Purification 申 请 人: 魏 波 学科 门类 : 农 学 学科 专业 : 预防 兽医 学 研究 方向 : 寄生 虫病 及防 治 指导 教师 : 呼和 巴特 尔 教 授 岳 俊 杰 副研 究员论文 提交 日期 :二 ?一 二年 六月 摘 要 肠出血型大肠杆菌 O157:H7 是重要的人类肠道致病菌,III 型分泌系统复合 物及其分泌的转运蛋白和效应蛋白在其致病过程中发挥着重要作用。本研究以 III 型分泌系统的分子伴侣蛋白 CesT 和 CesD为出发点,通过串联亲和纯化(TAP) 和非变性凝胶电泳(BN PAGE)为核心的复合物组学方法,分离靶蛋白参与形 成的复合物,利用质谱技术鉴定参与靶蛋白复合物形成的蛋白组分,最后构建以 靶蛋白为核心的蛋白相互作用网络。技术路线为:在 O157:H7 中达融合了 TAP 标签的毒力蛋白,以温和的方 式裂解细菌,制备蛋白复合物样品,通过串联亲和纯化技术捕获并富集靶蛋白参 与形成的复合物;经 BN PAGE分离为独立的复合物条带,质谱鉴定每个复合物 条带的蛋白成分,通过 GST pull-down验证复合物组成蛋白间的相互作用关系。 本课设计并构建了两个 TAP 表达载体 pNTAP 和 pCTAP,分别将 TAP 标 签融合于靶蛋白的 N 末端和 C 末端。首先以大肠杆菌中大量存在的分子伴侣 GroEL为前期试验对象,建立了成熟的串联亲和纯化技术,分离鉴定到由靶蛋白 形成的复合物,并且纯化产物中没有其它的蛋白复合物,表明串联亲和纯化的特 异性好。然后以 III型分泌系统的分子伴侣蛋白 CesT 和 CesD为靶蛋白,都分离 鉴定到了含靶蛋白的复合物,且没有非特异条带,进一步表明串联亲和纯化的特 异性较好。以 CesT 为靶蛋白捕获的复合物,其中的两个组成蛋白 EF-Tu 和 GK (甘油激酶)分别通过 GST pull-down实验证明了它们与靶蛋白 CesT 有直 接相 互作用。 本研究结果表明:建立了高效的以 TAP和 BN PAGE 为核心的复合物组学技 术,能够在大肠杆菌中比较特异地分离鉴定由靶蛋白参与形成的蛋白复合物, 并 分析组成蛋白间的相互作用关系;该技术不仅能用于大肠杆菌,还能应用于 痢疾 杆菌等其它病原菌。本研究的完成,对构建以 III 型分泌系统相关毒力蛋白 为核 心的蛋白相互作用网络,全面地研究 III 型分泌系统作用机理,提供了坚实 的理 论基础和技术保障。 关键词 :肠出血型大肠杆菌O157:H7;分子伴侣;串联亲和纯化;蛋白质复合 物 Analysis of Type Three Secretion System Chaperone Protein Complexes of EHEC O157:H7 by Tandem Affinity Purification Abstract Enterohemorrhagic Escherichia coli EHEC O157:H7 is an important causive agent of human intesinal disease which expresses a Type Three Secretion System TTSS playing a significant role in colonisation and responsible for its pathogenesis for human and animal host. TTSS is composed of structural proteins, secreted tranlocator proteins, secreted effector proteins and chaperones, all of which contributed to the virulence of EHEC. In the present study, a complexomics approach composed of tandem affinity purification TAP and blue native PAGE BN PAGE is developed. Subsequently, separation and purification of protein complexes containing target virulence protein CesT or CesD and identification of novel virulence proteins were conducted with the developed approach The experimental scheme of this study can be detailed as followed: Firstly, TAP-tagged virulence proteins were expressed in O157:H7and bacteria were then mildly lysed for the preparation of protein complexes sample. Secondly, complexes containing TAP-tagged virulence proteins were purified and enriched by tandem affinity purification and separated by BN PAGE and then protein components were identified by LC-MS/MS. At last, the interactions between identified protein components of the complexes were analyzed and comfirmed by GST pull-down Two vectors, pNTAP and pCTAP were designed and constructed, both expressing target proteins, with TAP tag in N-terminus and C-terminus respectively. Then TAP and BN PAGE technologies were successfully established based on the preliminary experiment. Complexes containing target protein GroEL were subsequently purified and identified by employing the established technologies without non-specific complexe contamination, demonstrating high specificity of the constructed technologies. Type Three Secretion System chaperone protein CesT and CesD were then fused with TAP tags to purify protein complexes. Further analysis showed complexes containing target protein without non-specific contamination. EF-Tu and GK glycerol kinase, as protein components of complex containing CesT, were analyzed by GST pull-down and confirmed being able to interact directly with CesT in vivoResults of this study demonstrated: Highly efficient complexomics technologies have been developed, which could purify protein complexes containg tagged target protein from E.coli with high specificity and analyze protein interaction between components of complex. These techonologies could be used in not only E.coli, but also other pathogens like shigella. This study provided fundamental theoretical and experimental bases for further studies, such as constructing protein intercation network of TTSS relevant virulence proteins and overall studies of mechanisms of TTSSKey Words: Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7; Chaperones; Tandem Affinity Purification; Protein Complexes Directed by: Prof. Huhebateer and Yue Junjie Applicant for Doctor degree: Wei Bo Parasitic diseases and prevention College of Veterinary Medicine. Inner Mongolia Agricultural University. Hohhot 010018. China 目 录 1 引言1 1.1 肠出血型大肠杆菌O157:H71 1.1.1 EHEC与EPEC致病性的比较 1 1.1.2 肠出血型大肠杆菌2 1.1.3 III型分泌系统. 6 1.2 蛋白质复合物的研究. 13 1.2.1 研究蛋白质复合物的意义. 13 1.2.2 蛋白质相互作用的经典研究方法. 13 1.2.3 串联亲和纯化16 1.2.4 蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳Blue Native PAGE,BN PAGE. 18 1.2.5 质谱技术 18 1.3 本课题的研究目的与意义 20 2 串联亲和纯化原核表达载体的构建及表达鉴定. 21 2.1 实验材料21 2.1.1 菌株和质粒. 21 2.1.2 试剂与耗材. 21 2.1.3 主要仪器 21 2.1.4 主要溶液的配制 22 2.2 实验方法25 2.2.1 pCTAP与pNTAP串联亲和纯化表达载体的设计策略 25 2.2.2 pCTAP与pNTAP串联亲和纯化原核表达载体的构建 26 2.2.3 pNTAP与pCTAP表达载体标签蛋白在E.coli BL21DE3中的表达 30 2.2.4 pNTAP与pCTAP 在E.coli O157:H7 EDL933感受态细胞中的表达 32 2.3 实验结果33 2.3.1 pCTAP与pNTAP合成序列的密码子优化. 33 2.3.2 拼接全长的PCA结果与PCR扩增结果33 2.3.3 载体pUC18质粒双酶切及阳性转化子PCR鉴定. 34 2.3.4 基因序列测定结果. 35 2.3.5 pCTAP与pNTAP载体在大肠杆菌BL21DE3细菌中的表达鉴定 35 2.3.6 pCTAP与pNTAP载体在大肠杆菌O157:H7菌株中的表达鉴定. 37 2.4 讨论 38 2.4.1 串联亲和纯化表达载体的设计 38 2.4.2 串联亲和纯化表达载体pNTAP与pCTAP的构建. 39 2.4.3 串联亲和纯化表达载体pNTAP与pCTAP的表达鉴定 39 3 利用串联亲和纯化技术分离大肠杆菌O157:H7伴侣蛋白GroEL复合物41 3.1 实验材料41 3.1.1 菌株和质粒. 41 3.1.2 试剂与耗材. 41 3.1.3 主要仪器 41 3.1.4 主要溶液的配制 41 3.2 实验方法44 3.2.1 构建重组表达载体pGroEL-TAP44 3.2.2 GroEL-TAP串联亲和纯化. 46 3.2.3 SDS-PAGE分离蛋白复合物组分48 3.2.4 BN-PAGE分离蛋白复合物组分 49 3.2.5 胶内酶切和质谱鉴定49 3.3 实验结果50 3.3.1 构建pGroEL-TAP表达载体 50 3.3.2 pGroEL-TAP载体在大肠杆菌O157:H7 菌中的表达鉴定 51 3.3.3 串联亲和纯化条件的优化. 52 3.3.4 伴侣素GroEL蛋白的串联亲和纯化54 3.4 讨论 56 3.4.1 pGroEL-TAP表达载体的构建及在O157:H7菌株中表达形式的鉴定57 3.4.2 串联亲和纯化条件的优化. 57 3.4.3 GroEL-TAP利用串联亲和纯化技术捕获蛋白复合物 58 4 利用串联亲和纯化方法寻找分子伴侣 CesT 和 CesD 在 O157:H7 中相 互作用复 合物. 60 4.1 实验材料60 4.1.1 菌株和质粒. 60 4.1.2 试剂与仪器. 60 4.2 实验方法60 4.2.1 构建重组表达载体pCesT-TAP 和pCesD-TAP 60 4.2.2 融合蛋白CesT-TAP的串联亲和纯化. 62 4.2.3 融合蛋白CesD-TAP的串联亲和纯化. 62 4.2.4 SDS-PAGE和BN-PAGE分离蛋白复合物组分. 63 4.2.5 胶内酶切和质谱鉴定63 4.3 实验结果63 4.3.1 构建pCesT-TAP和pCesD-TAP表达载体. 63 4.3.2 pCesT-TAP和pCesD-TAP载体在大肠杆菌O157:H7菌中的表达鉴定 64 4.3.3 融合蛋白CesT-TAP的串联亲和纯化. 65 4.3.4 融合蛋白CesD-TAP的串联亲和纯化. 68 4.4 讨论 70 4.4.1 分子伴侣CesT的蛋白复合物的捕获. 70 4.4.2 分子伴侣CesD的蛋白复合物的捕获. 71 5 分子伴侣CesT和CesD蛋白复合物功能的初步探究 72 5.1 实验材料72 5.1.1 主要质粒 72 5.1.2 主要试剂与仪器 72 5.1.3 溶液配制 72 5.1.4 蛋白质相互作用网络的构建72 5.2 实验方法72 5.2.1 蛋白质相互作用网络的构建72 5.2.2 融合蛋白CesT-GST、His-EF-Tu和His-GK的表达. 72 5.2.3 GST-pull down验证CesT与捕获蛋白His-EF-Tu、His-GK之间的相 互 作用73 5.3 实验结果75 5.3.1 CesT捕获蛋白质组分之间相互作用网络构建75 5.3.2 利用GST pull-down证实CesT与捕获蛋白延伸因子、甘油激酶之间 存 在相互作用关系. 78 5.3.3 CesD蛋白质相互作用网络构建80 5.4 讨论 82 5.4.1 String数据库分析CesT捕获29种蛋白质之间相互作用网络 82 5.4.2 String数据库分析CesD捕获15个蛋白质之间相互作用网络 82 5.4.3 CesT捕获29种蛋白的功能分类. 83 6 讨论. 88 7 结论. 91 8 展望. 91 9 本课题主要创新之处91 致 谢 92 参 考 文 献 93 作 者 简 介102 插图和附 表清单 [21] 1图 1 肠出血型大肠杆菌 O157:H7 LEE 基因组成4 [21] 2图 2 EPEC 与 EHEC 效应蛋白的转移及 A/E损伤过程4 [41] 3图 3 LEE 编码的 III型分泌系统示意图 9 [42] 4图 4 效应蛋白通过 TTSS注入宿主细胞过程. 10 [72] 5图 5 CesT 介导效应蛋白通过 TTSS转运过程示意图. 12 6图 6 GST pull-down 示意图15 [81] 7图 7 常见的串联亲和纯化标签组合17 8图 8 双向BN PAGE/SDS PAGE 与SDS-PAGE比较示意图 18 9图 9 TAP 表达载体串联标签设计及载体构建图; NTAP 与 CTAP 标签的 设计图; pNTAP 与 pCTAP 中的合成序列;载体 pNTAP 与pCTAP 的构建示意图 25 10. 图 10 拼接模板全长的 PCA 反应电泳图和合成目的序列的 PCR 反应 电泳图. 34 11. 图 11 质粒 pUC18 的双酶切电泳图34 12. 图 12 重组质粒pCTAP与pNTAP 阳性转化子全菌 PCR 电泳图. 35 13. 图13 pNTAP及pCTAP质粒中GFPuv在大肠杆菌BL21DE3菌株中表达的 荧光观察. 36 14. 图 14 SDS-PAGE pNTAP 及pCTAP 标签蛋白中在 BL21DE3菌株中的表达36 15. 图 15 pNTAP 及pCTAP 质粒中 GFPuv 在 BL21DE3菌株中表达的免疫印迹分析 37 16. 图 16 pNTAP 及 pCTAP 质粒中 GFPuv 在大肠杆菌 O157:H7 菌株中表达的荧光观察. 37 17. 图 17 pNTAP 及pCTAP 质粒中 GFPuv 在 O157:H7菌株中表达的免疫印迹分析 38 18. 图 18 pGroEL-TAP 表达载体构建示意图. 44 19. 图 19 串联亲和纯化流程图与示意图 46 20. 图 20 groEL 基因 PCR扩增电泳图及 pNTAP质粒双酶切电泳图 51 21. 图 21 pGroEL-TAP 质粒中 GFPuv在大肠杆菌 O157:H7 菌株中表达的荧光观察51 22. 图 22 pGroEL-TAP 质粒中 GFPuv在 O157:H7 菌株中表达的免疫印迹分析 52 23. 图 23 免疫印迹检测超速离心浓缩蛋白的效果和浓缩前后纯化效率的差异. 52 24. 图 24 免疫印迹检测 TEV酶切 4 小时和 10小时的差异 53 25. 图 25 免疫印迹与 SDS-PAGE 检测不同浓度生物素洗脱链亲和素琼脂糖珠效率 53 26. 图 26 GroEL-TAP 的串联亲和纯化产物的 SDS-PAGE 电泳图 54 27. 图 27 GroEL 蛋白的 MALDI-TOF质谱图55 28. 图 28 GroEL-TAP 的串联亲和纯化产物的 BN-PAGE 电泳图. 56 29. 图 29 GroEL 蛋白全序列中 LC-MS/MS 质谱鉴定出的肽段56 30. 图 30 pCesT-TAP 和pCesD-TAP表达载体构建示意图61 31. 图 31 cesT、cesD 基因PCR 扩增电泳图及 pCTAP、pNTAP 质粒双酶切电泳图 63 32. 图 32 pCesT-TAP、pCesD-TAP质粒中 GFPuv 在 O157:H7 菌株中表达的荧光观察 64 33. 图 33 pCesT-TAP、pCesD-TAP 质粒中 GFPuv 在 O157:H7 菌株中表达的免疫印迹分 析. 64 34. 图 34 CesT-TAP的串联亲和纯化产物的 BN-PAGE 电泳图65 35. 图 35 CesT-TAP的串联亲和纯化产物的 SDS-PAGE 电泳图. 67 36. 图 36 CesD-TAP的串联亲和纯化产物的 BN-PAGE 电泳图68 37. 图 37 CesD-TAP的串联亲和纯化产物的 SDS-PAGE 电泳图. 70 38. 图 38 CesD 蛋白全序列中 LC-MS/MS 质谱鉴定出的肽段 70 39. 图 39 String 数据库搜索已知实验验证的含 CesT 的 29 种蛋白质组分之间关系 77 40. 图 40 String 数据库预测和实验验证含 CesT 的29 种蛋白质组分相互作用关系 78 41. 图 41 His-GK 纯化后的 SDS-PAGE分析79 42. 图 42 GST pull-down 分析 CesT与 EF-Tu的相互作用. 79 43. 图 43 GST pull-down 分析 CesT与 GK 的相互作用. 80 44. 图 44 String 数据库搜索已知实验验证的含 CesD 的 15 个蛋白质组分之间关系 81 45. 图 45 String 数据库预测和实验验证含 CesD 的15 个蛋白质组分相互作用关系 81 46. 图 46 String 数据库分析的 CesT 29 个蛋白复合物组分之间全部关系及本研究验 证的相互作用关系82 47. 表 1 引物序列及所加入的酶切位点. 27 48. 表 2 引物序列及所加入的酶切位点. 61 49. 表 3 BN PAGE 分离的 CesT 串联亲和纯化产物的LC-MS/MS 质谱结果. 66 50. 表 4 SDS-PAGE分离的CesT 串联亲和纯化产物的 LC-MS/MS质谱结果 67 51. 表 5 BN-PAGE 分离的 CesD 串联亲和纯化产物的的 LC-MS/MS质谱结果69 52. 表 6 引物序列及所加入的酶切位点. 73 53. 表 7 含有CesT的 29种蛋白组分在 String数据库中对应的名称 76 54. 表 8 含有CesD的 15种蛋白组分在 String数据库中对应的名称 80 缩 略 词 表 E.coli Escherichia coli 大肠杆菌 ETEC Enterotoxigenic Escherichia coli 肠产毒素型大肠杆菌 EPEC Enteropathogenic Escherichia coli 肠致病型大肠杆菌 EHEC Enterohemorrhagic Escherichia coli 肠出血型大肠杆菌 EIEC Enteroinvasive Escherichia coli 肠侵袭型大肠杆菌 EAEC Enteroaggregative Escherichia coli 肠聚集型大肠杆菌 A/E lesion attaching and effacing lesion 黏附/抹去损伤 LA localized-adherence 局部性粘连 Bfp bundle-forming pilus 黏附菌毛 HUS hemolytic uremic syndrome 溶血性尿毒综合征 LEE Locus of enterocyte effacement 肠细胞消失位点 Tccp Tir-cytoskeletoncoupling Protein Tir-细胞骨架偶联蛋白 sec signal sequence 信号肽 TTSS type III secretion system III 型分泌系统 Ler LEE-encoded regulator LEE 岛编码调控蛋白 Ler Tir translocated intimin receptor 紧密素受体蛋白 Nles non-LEE-encoded effectors 非 LEE 岛编码效应蛋白 DNA-BD DNA binding domain DNA 结合功能域 DNA-AD activation domain 转录激活结构域 PDT Phage display techniques 噬菌体展示技术 SPR Surface plasmon resonance 表面等离子共振 TAP tandem affinity purification 串联亲和纯化 ProA Streptococcus Protein A 葡萄球菌蛋白 A CBP calmodulin binding peptide 钙调蛋白结合多肽 ProG Streptococcus Protein G 链球菌属蛋白 G SBP streptavidin-binding peptide 链亲和素结合肽 GFPuv Green fluorescent protein 绿色荧光蛋白 BN PAGE Blue Native PAGE 蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 PMF peptide mass fingerprinting 肽质量指纹图谱 MCS Multiple cloning sites 多克隆位点 EF-Tu elongation factor Tu 延伸因子 OmpA Outer membrane protein A 外膜蛋白 A OmpC Outer membrane protein C 外膜蛋白 C GK glycerol kinase 甘油激酶 LC-MS/MS liquid chromatography coupled tandem 液相色谱与串联质谱联用技术 mass spectrometrica analysis MALDI-TOF matrix-assistedlaser desorption 基质辅助激光解析离子化飞行时 MS /ionization time of flight mass 间质谱 spectrometry 内蒙古 农业大 学博 士学位论文 1 1 引言 埃希菌属(Escherichia)有 6个种,只有大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是 临床最常见、最重要的一个菌种,主要表现在:大肠杆菌是肠道中重要的正常菌群, 并能为宿主提供一些具有营养作用的合成代谢产物;在宿主免疫力下降或细菌侵入肠 道外组织器官后,即有可能成为致病菌,引起肠道外感染;有些血清型的大肠杆菌具 有致病性,能导致人类胃肠炎;另外,大肠杆菌在环境卫生和食品卫生学中,常被用 作粪便污染的卫生学检测指标。大肠杆菌有菌体(O )、鞭毛(H)和荚膜(K)三种 抗原,是血清型分型的基础。据抗原结构的不同,大肠杆菌有许多血清型。血清型可 以用 O:K:H 、O:H、O:K 表示。大肠杆菌的某些血清型可引起人类胃肠炎,与食入 污染的食品和饮水有关,为外源性感染。根据其致病机制不同,主要有五种类型:肠 产毒素型大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)、肠致病型大肠杆菌 (Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)、肠出血型大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)、肠侵袭型大肠杆菌(Enteroinvasive Escherichia coli,EIEC) 和肠聚集型大肠杆菌(Enteroaggregative Escherichia coli, EAEC)。其中 EHEC和 EPEC 的致病机理十分相似,它们都会黏附在宿主细胞表面,利用 III 型分泌系统效应蛋白 注入宿主细胞内,引发感染宿主细胞肌动蛋白聚集等损害,即对宿主细胞造成黏附/ 抹去损伤。但是 EHEC与 EPEC也存在许多不同之处。 1.1 肠出血型大肠杆菌O157:H7 1.1.1 EHEC 与EPEC 致病性的比较 EHEC O157:H7 毒力岛上的基因与 EPEC上的基因有较高的同源性,但是它们的 黏附/抹去损伤的发展途径不同。 O157引起的黏附/抹去损伤的发展比 EPEC要慢。 Tir 作为紧密素受体插入宿主细胞膜内。在 EHEC 感染时,Tir 并不形成酪氨酸磷酸化; 而 EPEC 菌株的 Tir 由蛋白激酶 A 和酪氨酸蛋白激酶修饰后被注入宿主细胞。Tir 分 泌的差异反映出细菌黏附的差异。EPEC的粘附主要在小肠,因为粘附基因只有在该 位置才被激活;而 O157菌株的粘附主要在大肠,因为粘附基因也只有在大肠被激活。 另外,毒力岛不同的调节方式也影响了菌株的毒力。1999 年 Mellies 等研究表明在 EPEC 中毒力岛的基因调节涉及一个质粒编码区 PerA_C,该区可以激活毒力 岛的一 个转录基因 ler,从而进一步调节毒力岛的其它基因;而 EHEC 缺乏 PerA_C 区,毒 [1] 力岛的激活可能由 ler单独完成 。 EPEC不产生志贺样毒素,它借助一些定殖因子黏附在肠道粘膜上皮细胞,破坏 粘膜微绒毛,即产生黏附/抹去损伤,最终引发宿主细胞内一系列病理变化,其主要 血清型有 O127:H6 和 O142:H34。EPEC 的易感人群为 2 岁以下儿童,多流行于发展 中国家,发病症状为水样腹泻,感染部位为小肠,有位于染色体上长度为 35Kb的 LEE2 利 用串联亲 和纯化研 究 EHEC O157:H7 III 型分泌系统 分子伴侣 蛋白复合 物 岛编码与黏附/抹去损伤相关的毒力因子的存在就足以致病, EPEC菌体在体外上皮细 胞的黏附称为局部性粘连(localized-adherence,LA)。在体外,EPEC 菌体与细胞共 孵育时,LA 快速被诱导形成。EPEC 菌株产生不同类型的黏附菌毛(bundle-forming [2] pilus,Bfp),其中一些菌毛涉及到致病性 。 1.1.2 肠出血型大肠杆菌 1.1.2.1 EHEC O157:H7 的流行概况 肠出血型大肠杆菌为出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征的病原体,是最近几 年日益引起人们关注的一类严重危害人类健康的重要肠道致病菌。目前已经分离到 50 多个血清型,但引起人类疾病的主要是 O157:H7,感染率占 EHEC 感染的 50%~ [3] 80% 。O157:H7 可以引起人的出血性结肠炎、血小板减少性紫癜、溶血性贫血的溶 血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome, HUS)等多种并发症,死亡率达 3%-5%。 1982年首次在美国暴发。1996年在日本大阪地区发生流行,患者过万,死亡 11人。 随后澳大利亚、美国、英国、瑞典及加拿大等国家也相继发生了多起 O157:H7 的散 [4,5] 发性感染 。我国于 1988年首次分离到 EHEC O157:H7菌株,1999年在安徽和江苏 [6] 等省暴发的 O157:H7感染疫情,患者超过 2万人,流行时间长达 7个月 。从全世界 的流行病学调查发现,基本上是先散发病例,继而小型暴发,然后才有可能发生暴发 流行。EHEC感染的重要传染源是污染食品,如未煮透牛排和其它肉类制品、水、未 经巴氏消毒过的牛奶、果汁和生的蔬菜或水果。牛可能是 O157:H7的主要储存宿主。 1.1.2.2 EHEC O157:H7 的致病机理 1.1.2.2.1 志贺样毒素(Stxs)志贺样毒素是 EHEC最重要的毒力因子之一,编码 Stx的基因位于 EHEC染色体 上前噬菌体的基因组中,具有转导能力。EHEC O157:H7 菌株表达志贺毒素(曾称 [7] Vero 毒素或志贺样毒素)有两种,分别为 Stx-I和 Stx-II 。Stx-I与志贺杆菌产生的志 贺毒素基本相同,Stx-II与 Stx-I有 60%的同源性,两型毒素均由溶原性噬菌体介导。 Stx由 1 个 A亚单位和 5 个 B亚单位组成,B 亚单位与宿主细胞特异糖脂受体(Gb3) 结合,肠绒毛和肾上皮细胞有高浓度的糖脂受体。A亚单位内在化后可裂解 60S核糖 体亚单位的 28S rRNA,阻止其与氨酰 tRNA的结合,终止蛋白质合成,肠绒毛结构 的破坏引起吸收减低和液体分泌的相对增加。HUS 的发生在表达 Stx-II 的 EHEC 中 较多见,因 Stx-II能选择性破坏肾小球内皮细胞,这种破坏引起肾小球滤过减少和急 [8,9] 性肾功能衰竭 。Stx 还能刺激炎症细胞因子(肿瘤坏死因子α,白细胞介素 6)的 [10] 表达,还可加强糖脂受体的表达。Walterspiel等研究 4种抗生素对 5株大肠杆菌释 放 Stx 的影响,结果表明抗生素处理大肠杆菌后,5 株大肠杆菌释放 Stx 的量存在明 内蒙古 农业大 学博 士学位论文 3 显差异,同时释放毒素量与药物浓度有关。由此可见,使用抗生素可能增加 HUS 的 发生率而加剧病情。因此,尽量避免使用抗生素治疗。 1.1.2.2.2 黏附/抹去 损伤 EHEC O157:H7感染宿主首先必须黏附在宿主结肠肠道的粘膜上皮细胞,避免被 分泌液和肠蠕动清除。在这个过程中,对结肠粘膜上皮细胞造成了黏附/抹去损伤 (Attaching and effacting lesion,简称 A/E lesion,即 A/E 损伤),这是 O157:H7感染 宿主肠道最显著的特征。A/E 损伤是指细菌在黏附于肠上皮细胞刷状缘后,通过引发 跨膜和细胞内信号的级联反应将自身分泌的信号蛋白转位于宿主细胞,进一步利用宿 主细胞的信号转导系统,使感染宿主细胞本身的组织结构发生改变,导致宿主细胞骨 架重排和包括肌动蛋白的积聚等特异性损害。该损害以刷状缘微绒毛的损坏及细菌对 肠杯状细胞膜的紧密黏附为特征。与这一过程密切相关的基因位于染色体上称为肠细 [11] 胞消失位点(Locus of enterocyte effacement,LEE)的区域 。EHEC的毒力岛(LEE 岛)与 EPEC染色体的毒力岛有高度的同源性。这也正是 EHEC与 EPEC致病性相似 的原因之一。 1.1.2.3 EHEC 的LEE 岛编码基因的表达与调 控 1.1.2.3.1 EHEC 的LEE 岛编码基因的表达 O157:H7的染色体基因组中除了包含 4.1 Mb的与 E.coli K-12菌株共有的主要骨 架序列,还含有长度为 1.4 Mb的编码毒力因子的基因序列,如志贺样毒素基因(Stx [12] gene)和 LEE 岛 。编码造成 A/E 损伤的毒力因子的 LEE岛主要位于 EHEC染色体 上长度为 35 kb左右的 DNA片段,共 41个基因,LEE 编码区主要编码了 III型分泌 系统所需要的绝大多数蛋白。包括 LEE1(ler、escR、escS、escT、escU )、LEE2(escC、 escJ、sepZ、cesD )、LEE3(escV、escN )、LEE4和 LEE5(tir、eae、cesT)五个操纵 子。图 1为 EHEC O157:H7的 LEE 基因组成示意图。LEE1、LEE2和 LEE3三个操 纵子包括 22 ORFs,编码构成 III型分泌系统的装置蛋白;LEE3 编码的 ATP水解酶 EscN通过把 ATP水解成 ADP为 III型分泌系统提供能量; LEE4 编码 EscF及转位蛋 白 EspA、EspB、EspD、EspF,EspA单体聚合成微丝,在 EscF形成的针状复合物上 继续延伸,细菌借助这一中空的针状结构将其效应分子注入宿主细胞的胞质内; EspB 和 EspD在宿主细胞的细胞膜上形成微孔结构;EspF蛋白注入宿主细胞,作用于线粒 [13] 体,在细胞程序性死亡过程中扮演重要角色 。 LEE4 编码 SepL和 LEE2编码的 SepD [14] [15,16] 为 III 型分泌系统转移效应蛋白的控制元件 ,效应蛋白被转入到宿主细胞内 。 LEE5编码 Tir、紧密素intimin及 CesT。 4 利 用串联亲 和纯化研 究 EHEC O157:H7 III 型分泌系统 分子伴侣 蛋白复合 物[21] 图1 肠 出血 型 大 肠杆 菌O157:H7 LEE 基 因组 成 Fig. 1 Genetic organization of the EHEC O157:H7 LEEEHEC O157:H7 诱导宿主细胞发生 A/E 损伤,其中关键因素为 LEE 编码的 III型 分泌系统和许多 III 型分泌系统效应蛋白。菌体与宿主肠上皮细胞初始接触后,微绒 [17] 毛的刷状缘被破坏,同时细菌进一步在肠上皮细胞上形成肌动蛋白基座 。为了接触 宿主细胞,EHEC 菌体利用 III 型分泌系统将 eae 基因编码的紧密素(intimin)受体 [18] ?效应蛋白 Tir 注入宿主细胞 ,进而结合细菌外膜蛋白紧密素。紧密素与 Tir 的结 [19] 合诱导 Tir 成簇,引起宿主细胞的一个级联反应,使得肌动蛋白聚集和基座 形成 , 从而导致 A/E 损伤的形成。EHEC 形成 A/E 损伤还需要除 LEE 岛外的其他蛋白,如 Tir-细胞骨架偶联蛋白(Tir-cytoskeletoncoupling Protein,Tccp),也称作 EspFu,由隐 [20] 性前噬菌体 CP-933U 编码 。图 2 为 EPEC与 EHEC 转运 LEE 编码的效应蛋白和非 LEE 编码的效应蛋白注入宿主细胞示意图。EHEC 与 EPEC 在宿主利用 III 型分泌系 统将分泌蛋白注入宿主细胞内的过程是相似的,但作用机制存在差异。[21] 图2 EPEC 与EHEC 效应 蛋白 的转 移及A/E 损伤 过程 Fig.2 EPEC and EHEC translocate LEE-encoded and other effector proteins into the host cell cytosol 内蒙古 农业大 学博 士学位论文 5 1.1.2.3.2 LEE 岛的群体效应和协同调 控III型分泌系统与菌毛表达通过宿主激素肾上腺素和去甲肾上腺素(Epi/Ne)正向 [22] 激活。首先通过群体效应调控蛋白 QseA,QseA可以控制 ler 和 grlRA 的转录水平 。 QseA通过来自 Epi/Ne的信号发生反应,并且形成一个未鉴定的菌复合物 AI-3(Auto inducer-3),是由 qseC 和 qseB 编码的双组件系统。这个双组件系统有一 个关键作用 是可以通过控制调节蛋白 FlhD 和 FlhC 来进行转位的正调控。已知 flhDC的组成型表 达是抑制 EHEC 黏附上皮细胞,因此,flhDC 的负调控结合 GrlA 可能在应对 Epi/Ne 或 AI-3共同刺激下对 III型分泌系统和菌毛进行共协调作用。有趣的是,存在第二个 双组件系统,它对 Epi、碳酸盐和硫酸盐有应答。这个系统不仅可以调控 LEE,而且 可以激活编码效应蛋白 EspFu基因的转录。qseEF操纵子编码的一种外膜蛋白 QseG, 它被认为是 Tir效应蛋白转运所必需的,但具体机制尚不清楚。 1.1.2.3.3 水平获得调控因子对LEE 岛的调 控 除了菌毛以外,III 型分泌系统还与非 LEE 效应蛋白和水平获得性基因岛编码的 毒力蛋白有联系,同时经常引入可溶性噬菌体。与株 E.coli K-12 MG1655相比较, EHEC O157:H7 EDL933和 EHEC O157:H7 Sakai菌株含有额外的区域 O 岛(O islands, OIs)和 S 环(S-loops)。有趣的是,附加调控蛋白是由这些水平获得的 DNA编码的。 Pch 蛋白可能在 LEE 编码的效应蛋白与非 LEE 编码的效应蛋白之间起了 非常重 要的连接作用。除了 LEE 编码的效应蛋白外,还存在至少 30 种非 LEE 编码的效应 [23] 蛋白,它们可以通过 III 型分泌系统分泌到宿主上皮细胞中 。它们其中一部分是由 OIs(作为隐形噬菌体的一部分)编码。这些效应蛋白所具有的多样性、可移动性和 [24] 遗传组成表明它们存在一种不同于一般效应蛋白属性的“即插即用”的作用机制 。 用融合绿色荧光蛋白的方法研究表明非 LEE 岛效应蛋白 NleA 可调控 LEE 的表达, 由此引发关于非 LEE 效应蛋白是如何有效调节 LEE表达的思考。有些研究通过转录 子沉默和染色体免疫共沉淀方法表明 PchA 和/或 Ler 结合并激活了编码非 LEE 效应 [25] 蛋白的基因和编码毒力蛋白的基因 。这是首次证明非 LEE 效应蛋白对 LEE 表达的 调控。由于 PchA的结合贯穿启动子和编码序列,因此 PchA通过 RNA聚合作用来完 成是不可能;与之相反,已经证明 Pch蛋白可能通过调控启动子附近的染色体结构, 而使得转录完成。Pch 同系物可能在许多致病菌中发挥促进水平获得基因表达的作 用,例如沙门氏菌、痢疾杆菌、耶尔森氏菌和 EPEC。 水平获得的调控蛋白属性的差异是影响 EHEC O157各菌种之间分泌水平差异的 一个重要因素。这些调控蛋白对 III 型分泌系统的调控可能是多方面的,包括 LEE1 (通过 Ler 表达)和较后面的位点(比如通过转录后机制)。已有报道 LEE4 操纵子 [26] 是受转录后调控导致 EspA蛋白(形成转位菌毛)在各株菌中表达不同 。虽然目前6 利 用串联亲 和纯化研 究 EHEC O157:H7 III 型分泌系统 分子伴侣 蛋白复合 物 这种差异原因还不明确,但最近有研究得出 LEE4的转录由于 RNase E 的控制,导致 目标 RNA 半衰期和翻译水平的不同。几种输入型调控蛋白表现出了影响 LEE4 表达 的作用,包括 Dam-甲基化,这些有助于观察调控的多相性或过转录调控。通过分析 痢疾杆菌和沙门氏菌中的 III 型分泌系统调控,III 型分泌系统的转录后 调控是通过 RNA伴侣蛋白 Hfp来实现的,因此 Hfp将有助于观察 EHEC中 III型分泌系统的转录 后调控。 1.1.3 III 型分泌系统 1.1.3.1 分泌系统