超声介导微泡造影剂对人脐静脉血管内皮细胞膜作用的研究-临床医学论文

超声介导微泡造影剂对人脐静脉血管内皮细胞膜作用的研究-临床医学 作者:刘玉凤任卫东唐力陈昕马春艳刘跃华 【摘要】目的探讨超声介导微泡造影剂(MBCA)对人脐静脉血管内皮 细胞(HUVEC)膜的作用。方法向两皿HUVEC中加入MBCA(商品名: SonoVue)，用超声辐照，辐照后立即取一皿细胞送电镜室进行SEMS 观察。另一皿细胞继续培养24h后进行SEMS观察。结果超声介导 SonoVue可使HUVEC细胞膜的形态和结构发生明显异常改变。约 23%细胞的细胞膜可见大小不等、数量不一的小孔。细胞继续培养24h 后再进行SEMS观察，发现细胞膜的形态未见小孔样结构改变。结论 超声介导SonoVue可使HUVEC细胞膜产生可逆性的小孔。 【关键词】超声;人脐静脉血管内皮细胞;微泡造影剂;小孔 【Abstract】ObjectiveToresearchtheeffectofultrasound mediatedmicrobubblescontrastagent(MBCA) SonoVueonHumanumbilicalvEinendothelialcells(HUVECs).MethodsHUVECswerealltreatedwithSonoVue.Afterultrasoundirradiation,onedishofHUVECswereobservedbyelectronmicroscope,theotherswereobservedafterbEIngculturedfor24hours.ResultsUltrasound mediatedSonoVuecausedobviouslyabnormalalterationontheshapeandstructureofHUVECmembrane.Poresofdifferentdiametersandquantityappearedinthemembraneofabout23%cell.Afterbeingculturedforanother24hours,porestructureofthecellsdisappeared.ConclusionsUltrasoundmediatedSonoVuecausesreversibleporesinHUVECmembrane. 【Keywords】Ultrasound;HUVEC;MBCA;Pore目前超声介导微泡造影剂(microbubblescontrastagont,MBCA)在基因治疗方面的潜在应用价值备受关注。基因治疗时，基因物质必须到达靶细胞，通过细胞膜，进入细胞核，然后再经过转录、翻译为蛋白质，才能起到治疗作用〔1〕。本研究旨在观察超声介导MBCA对人脐静脉血管内皮细胞(HVVEC)膜的作用。 1材料与方法 1.1材料及试剂HUVEC(南京凯基生物科技开发有限公司)。试剂:胎牛血清(FBS)(Gibco公司，美国)，1640培养液，胰酶蛋白消化液，青霉素，链霉素，MBCA(商品名:SonoVue，Bracco公司，意大利)，0.9%生理盐水。实验器材:单孔聚苯乙烯培养皿(Coring公司，美国)，25ml一次性培养瓶，培养箱，倒置显微镜(IMS)，显微镜，计数板，超声探头(Philipsie33S51，频率1,5mHz，heart:pen档)，温度仪，水浴箱，扫描电镜(SEMS)。 1.2实验方法 1.2.1细胞培养含10%FBS的1640细胞培养液培养HUVEC，每1,2d换液1次，每3,4d传代1次。 1.2.2SonoVue的配制5ml注射用生理盐水(0.9%NaCl)加入SonoVue药瓶中(每瓶含SF659mg，冻干粉25mg)，剧烈震荡20s至瓶内药物混合均匀后备用(此时SonoVue浓度为17mg/ml)。 1.2.3实验分组A组:正常对照组;B组:单纯超声辐照组;C 组:SonoVue组，以上各组均为一皿;D组:SonoVue+超声辐照组，两皿。用含10%FBS的1640培养液配成HUVEC悬液，计细胞数将浓度调至1×106/ml，将1ml细胞悬液接种到直径35mm单孔聚乙烯培养皿中。C组、D组各加浓度为17mg/ml的SonoVue，每孔加300μl。B组、D组用超声辐照，辐照后立即各组取一皿送电镜室进行SEMS观察。D组的另一皿细胞继续培养24h后进行SEMS观察。 2结果 超声介导对HUVEC细胞膜的作用。正常对照组HUVEC呈圆形或椭圆形，面可见较多皱襞和绒毛样结构。单纯超声辐照组及SonoVue组HUVEC形态及细胞膜未见明显异常，与对照组比较无明显改变。SonoVue+超声辐照组HUVEC细胞膜的形态和结构可见明显异常，约23%细胞的细胞膜可见大小不等、数量不一的小孔，小孔直径,5μm，大多在2μm左右，大部分小孔周边细胞膜限局性隆起，呈“弹坑样”。该组细胞继续培养24h后再进行SEMS观察，HUVEC呈椭圆形，或多角形，细胞帖壁，多视野反复仔细观察细胞膜的形态结构与对照组细胞膜的形态结构无明显差异，未见小孔样结构改变。SEMS观察以上各组细胞时，均可见数量不同的细胞凋亡，形成凋亡小体。见图1。图1各组HUVEC细胞形态 3讨论 近年研究表明，超声介导MBCA可对靶细胞产生一系列生物学效应，其中的空化效应可使细胞膜通透性增加〔2〕。Bao等〔3〕的研究表明，使用低声压超声波对中华田鼠卵巢细胞的含微泡悬浮液进行辐照，细胞膜对大分子暂时开放后再关闭。在细胞膜一过性开放期间，外面的大分子可进入细胞为细胞摄取。Taniyama等〔4〕体外培养骨骼肌细胞，荧光素标记的质粒经超声辐照30s，发现质粒被转染到细胞内，结果实验组细胞中的荧光素明显增加，同时电镜证实细胞表面有短暂的小孔形成(直径,5μm)，基因是经这些小孔进入细胞内的。 本实验观察到:SonoVue的浓度为17mg/ml时可使HUVEC细胞膜产生可逆性的小孔。近来研究表明，超声介导MBCA能增强体外培养细胞和活体细胞对外源性基因的摄取、转染和表达。学者们的初步研究结果表明，超声波可引起细胞的通透性增加，其机制可能为空化效应与机械作用所引起，学者们更倾向于前者。Qian等〔5〕的研究发现，超声波可引起细菌的细胞膜通透性增加，使庆大霉素更容易进入菌体内，从而增强抗生素的抗菌效果。Miller等〔6〕研究了超声波对人体表皮癌细胞的损害，发现癌细胞的破坏与是否使用微泡关系密切。 本研究表明，SonoVue可增强超声的空化效应，使HUVEC细胞膜上出现可逆性小孔，导致细胞膜通透性增强。空化效应可能是超声 介导MBCA增强基因转染率的主要机制之一。 【参考文献】 1ForbesSJ，HodgsonHJ.Genetherapyingastroenterologyandhepatology〔J〕.AlimentPharmacolTher，1997;11(5):8236. 2KochS，PohlP，CobetU，etal.Ultrasoundenhancementoflipsome medialcelltransfectioniscausedbycavitationeffects〔J〕.UltrasoundMedBiol，2000;26(5):897903. 3BaoS，ThrallBD，MillerDL， etal.Transfectionofareporterplasmidintoculturedcellbysonoporationinvitro〔J〕.UltrasoundMedBiol，1997;23(6):9539. 4TaniyamaY，TachibanaK，HiraokaK， etal.DevelopmentofsafeandefficientnovelnonviralgenetransferusingultrasoundenhancementoftransfectionefficiencyofnakedplasmidDNAinskeletalmuscle〔J〕.GeneTher，2002;9(6):37280. 5QianZ，SangersRD， PittWG.Investigationsofthemechanismofthebiocousticeffect〔J〕.JBiomedMaterRes，1999;44(2):198205. 6MillerDL， QuddusJ.Sonoporationofmonolayercellsbydiagnosticultrasoundactivationofcontrastagentgasbodies〔J〕.UltrasoundMedBiol，2000;26(40): 6617.