胃动素对胃窦平滑肌细胞内Ca^2＋浓度的影响及机制

胃动素对胃窦平滑肌细胞内Ca^2＋浓度的影响及机制 胃动素对胃窦平滑肌细胞内Ca^2，浓度的 影响及机制 184ChinJApplPhysiol2006;22(2) fluctuatedfr0m70HztO110I-Iz,thento35I-Iz,andfinallyto30Hz.? Inthecontralateralsideprimarynetworkafterdischargesin theCPuWereinducedbytheCTRC.Therefore,thecharacteristicprimarynetworkafterdisch argescouldbeshiftedfromtheCPuor totheHPC.butamplified.Ontheotherhand,HPCsharpwavescouldbedepressedwhentheCP unetworkseizuresoccurl'ed.Con? clusion:ThereestablishmentofCPu— hippocampalepilepticnetworkscouldbetranshemisphericallypromotedbyover— activationofthe rightCPunetwork,inwhichbilateralhippocampalneuronalnetworkandCPuneuralnetwork wereinvolvedinsomeparticularpatho— physiologicalinformationencoding. KEYWORDS:caudateputamen:hippocampus;epilepticnetwork;neuralinformationenco ding;tetanization 胃动素对胃窦平滑肌细胞内Ca2浓度的影响及机制 方萍,董蕾.罗金燕,孙秀珍 (西安交通大学第二医院内科,陕西西安710004) 摘要目的:观察胃动素对新生大鼠胃窦平滑肌细胞内Ca"浓度的影响及机制.方法: 采用激光共聚焦显微镜结合细胞内荧光 染色观察不同条件下相同浓度胃动素对培养大鼠胃窦平滑肌细胞内C82浓度的 影响.结果:细胞膜ca2通道阻断剂维拉帕米, 含ca2螯合剂EGTA的D—Hank'S液及细胞内Ca2释放阻断荆TMB-8均可不同 程度抑制MTL对胃寞平滑肌细胞内ca2的升高 作用.结论:MTL具有升高胃窦平滑肌细胞内ca2的作用,细胞外ca2内流和内ca2 释放参与了这种作用. 关键词:胃动素;激光共聚焦显微镜;C82;胃窦平滑肌细胞 KEYWORDS:motilin;laserscanningconfocalmicroscopye:C82;artralsmoothmusclecei ls 中图分类号:R333文献标识码:A文章编号:1000.6834(2006)02.0124.03 胃动素(motilin,Mn,)是由22个氨基酸组成的脑肠肽,在 胃肠道和中枢均有分布,它通过作用于MTL受体发挥生理作 用.1999年Feighner等人成功鉴定了MTL受体的基因序列 和生物学特性,但有关MTL对胃肠运动作用的细胞内机制还 不十分清楚….我们的实验将针对这一问题进行探讨. 1材料与方法 1.1药品及试剂 MTL,胶原酶I型,依他酸(EGTA),3,4,5三甲氧基苯 甲酸8辛酯(TMB-8)均购自Sigma公司,维拉帕米(Vera— pamil)购自上海禾丰制药有限公司(批号020401),a—actin单 克隆抗体购自武汉博士德公司.高糖DMEM为GIBcO公 司产品,胰蛋白酶购自华美公司,Fluo-3/AM为美国BIO. RAD产品.Hank'S液组成如下:(mmol?L)CaC1,1.3,KC1 5.4,KI-I2PO40.4,MgC12'6H2O0.4,MgSO4?7H2O0.4,NaC1 137,glucose5.6.D-Hank'S液以0.Immol?LEGTA代替ca— C12. 1.2实验分组 (1)Hank'S液平衡10min+MTL(1t~mol?L);(2)含维 拉帕米(10/*mol?L)的Hank'S液平衡10min+MTL(1ttmol ? L);(3)含EGTA(0.1mmol?L)的D.Hank's液平衡30 min+MTL(1t~mol?L);(4)含TMB.8(1Ot~mol?L)的 Hank'S液平衡10min+MTL(1t~mol?LI1). 1.3大鼠胃寞平滑肌细胞(Antralsmoothmusclecells.ASM. )培养 取1,3dSD乳鼠(第四军医大学实验动物中心,SCXK 军2002—005)的胃窦立即置于冰冷Hank'S液中,刮除内膜, 用含双抗的冰冷Hank'S液冲洗3,4次.以1g?LI型胶 原酶37?消化60min,每20min收集1次细胞,离心终止消 化,以DMEM培养液(含100mg?L小牛血清)制成细胞悬 液,细胞密度10?L一,于C02孵箱中培养.待细胞长成单 层,用a.actin单克隆抗体免疫组化鉴定.结果显示90%为阳 性细胞.以250mg?L胰酶消化传代,将3,5代细胞接种 于特制的50mm培养皿中,每组接种6块培养皿.24h细胞 贴壁生长后留作荧光标记. 1.4Fluo3/A/Vl荧光染色 用D-Hank'S液稀释的Fluo-3/AM应用液(10岬10l?L一, pH7.4)处理细胞,避光置37?孵育30min后吸出染液,以 Hank'S液冲洗细胞3次,加入0.2ml平衡液后用于检测. 1.5细胞内Caz的测定 染色后细胞置于激光共聚焦显微镜(1aserscanningcon. focalmicroscope,LSCM)载物台的40倍光学显微镜下,选择 单个或两三个细胞层面,观察染色后细胞某一层面的荧光图 像.动态扫描细胞内荧光强度(fluorescenceintensity.FI)并 观察FI变化曲线,每秒记录一幅图像,每隔30,50S记录一 段FI变化曲线(持续约30,50S).激发波长488nm,发射 波长522nm,采样频率为488Hz.LSCM由Bio-Rad公司 MRC-1024提供的Time—Course/Ratiometric软件控制.记录 起始激发波引起的FI在10,20S内自行降至静息水平即可 进行实验.AFI:PeakFI—RestingFI,代细胞内ca的相 对变化,FI相对变化率:AFI/RestingFI.达峰时间(TimetO peak)取决于外Ca2内流诱导的细胞内Ca2释放,峰值持续 时间(Timetpenk)主要依赖于外Ca2内流l. 1.6数据处理 结果以(互?s)表示,数据经过Pentium90微机系统 Time-Course/Ratiometric软件对图形进行实时测量而获得. 中国应用生理学杂志,2006;22(2) 组间差异显着性检测用方差分析法. 2结果 2.1MTL对ASMCs内Ca2的影响 镜下可见ASMCs轮廓清晰,经Fluo-3/AM标记后细胞 中部FI较强.周边较弱.由于细胞所处状态不同,静息FI 略有差异.1/~mol?LMTL引起同一组细胞在不同时刻FI 逐渐增强.在峰值持续一段时间后逐渐降低,FI相对变化率 约为68.1%(图1.表1).相同体积Hank'S液不引起ASM cs内Ca2的变化. 185 ,tt镘弱t Fig.1EffectsofMTLonintracellularCaofASMCs(Ba— lancedbyhank'Sbuffer) Tab.1InflueacesofcalciumregulatorontheeffectsofMTLonintracellularCa2ofASMCs(? s,=6) P<0.05."P<0.01Hank'sgroup;#P<0. 05,##P<0.01RestingFI 2.2Ca调节剂对MTL作用的影响 将培养的ASMCs在含有10/~mol?L维拉帕米的 Hank'S液中平衡10min后再加入1p.mol?L,MTL,FI上升 的达峰时间前移,峰值持续时间缩短,FI相对变化率为 27.3%(图2A,表1).用含有0.1mmol?Lca2螯合剂 EGTA的D-Hank'S液预处理细胞30min,此时可见1/~mol? LMTL只引起细胞内Ca的短暂升高,FI很快达到峰值, 持续很短又很快下降,FI相对变化率为27.5%(图2B,表 1).实验还用含10/~mol?LTMB-8的Hank'S液预处理细 胞10min,此时1t~mol?LMTL仅引起细胞内Ca2Fl轻 度升高.与MTL单独作用比,达峰时间明显后移,峰值持续 时间稍短,FI相对变化率仅为16.7%(图2C,表1).可见三 种Ca调节剂均可不同程度影响MTL作用的FI变化率, 达峰时间和峰值持续时间. 3讨论 细胞内Ca"是细胞收缩必不可少的中介离子,是兴奋 收缩耦联的重要环节.细胞内Ca2主要来源于细胞外Ca2 内流和内Ca"释放.细胞膜上Ca通道主要分为电压依赖 性Ca通道和配体门控性ca2通道,前者主要在肌肉和神 经组织的可兴奋膜上起作用,后者包括各种与受体耦联的 caz通道,广泛分布于各种组织中.电压依赖性ca2通道 是细胞外Ca"内流的主要途径,其活动受化学或电刺激导 致的膜电位改变的调控,能被传统的Ca通道阻滞剂所阻 断L3J.配体门控Ca通道缺乏电压依赖性,对Ca2通道阻 滞剂不敏感.配体与受体结合后,主要通过调节磷脂肌醇的 代谢来间接调节通道的开放概率,从而调节细胞外Ca内 流.而细胞内Ca?释放调节主要存在Ryanodine受体 (RyRs)家族和三磷酸肌醇受体(IR)家族两条途径[. B C .I} F.2InfluencesofcalciumregulatorontheeffectsofMTL onintracellularCaofASMCs A:Balancedwithhank'Sbuffercontainingverapamil;B:Bal— ancedwithD-hank'SbuffercontainingEGTA;C:Balancedwith hank'SbuffercontainingTMB-8 (下转第214页) 214ChinJApplPhysiol2006;22(2 EFFECToFACHYRANTHESBIDENTATA PoLYSACCHARIDESoNSIGNALTRANSDUCERAND ACTIVAToRoFTRANSCRIPTIoN6ANDITSmRNA EXPRESSIONINARATMoDELoFASTHMA LIChang—chong,YELe—ping,SUMiao—shang,HUXiao—guang,ZhangWei— xi,LUOYun—chun (DepartmentofRespiratoryMedicine.YuyingChidren'sHospitalAffiliatedtoWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325027,China) ABSTRACT Aim:Tostudytheeffectofachyranthesbidentatapolysaccharides(ABPS)ontheexpressionofsignaltransducerandacti'vatorof transcription6anditsmRNAinbronchusofaratmodelofasthma.Methods:ThirtymaleSDratswererandomlydividedintothree groups:thecontrolgroup,asthmagroupandABPSgroup.Thetotalcellnumbers,eosinophils(EOS)numbersanddifferentiatedcell numbersinbronchoalveolarIavagefluid(BALF)werecountedbydifferentcountfluids.TheconcentrationsofIL4inserumand BALFweremeasuredbysandwichELISATheproteinexpressionsofSTAT6weredetectedbyimmunohistochemistrytechniques. ThemRNAexpressionsofSTAT6weredetectedbyhybridizationinsitu.Results:? ThetotalcellnumbersinBALF,theabsolute numbersofEOS,theratiosofeosinophilstothetotalcellnumbers(EOS%)ofasthmagroupwereallsignificantlyhigherthanthose ofthecontrolgroup(P<0.01).ThetotalcellnumbersinBALF,theabsolutenumbersofEOSandEOS%ofABPSgroupwereall significantlylowerthanthoseofasthmagroup(P<0.01).? TheconcentrationsofIL4inBALFandserumofasthmagroupwere significantlyhigherthanthoseofcontrolgroup(P<0. 叭),whiletheconcentrationsofIL4inBALFandserumofABPSgroup weresignificantlylowerthanthoseofasthmagroup.? ImmunohistochemistryshowedthattheproteincontentofSTAT6aroundthe bronchusofasthmagroupwassignificantlyhigherthanthatofthecontrolgroup(P<0.01),whilethatofABPSgroupwassignifi— cantlylowerthanthatofasthmagroup,theepithelialceilswerethechiefexpressionceils;hybridizationinsitushowedthatthemR— NAexpressionofSTAT6aroundthebronchusofasthmagroupwassignificantlyhigherthanthatofthecontrolgroup(P<0.叭), whilethatofABPSgroupwassignificantlylowerthanthatofasthmagroup,theepithelialceilswerethechiefexpressionceils.Con. clusion:STAT6proteinandSTAT6mRNAwerefoundstronglyexpressedinratasthmamodel.theepithelialcellswerethechiefex— pressioncells.ABPShadaninhibitoryeffectonairwayinflammationcellsinfiltrationsuchasEOS,itsignificantlydepressedSTAT6 anditsmRNAexpression,thusreducedthesynthesisofIL一 4mightbekeyinmodulatingmechanismofasthma. KEYW0RDS:asthma;signaltransducerandactivatoroftranscription6;achyranthesbidentatapolysaccharides (上接第185页) 我们的实验结果显示MTL可引起培养的ASMCs内Ca缓慢 升高,然后是一个持续的,升高的,稳定的平台期.这与VanAssche G等所报道的MTL对结肠平滑肌的作用可能与ca有关的结果一 致l5j.细胞内ca的升高有多种调节机制,理论上主要依赖于细胞 膜Ca"通道介导的Ca"跨膜内流和细胞内储存Ca的释放.前者 在维持细胞内Ca2处于高水平平台期中起重要作用,而后者主要参 与细胞内ca"迅速达到峰值,并且二者在不同的诱因及不同的细胞 中所起的作用各有侧重.我们的实验表明电压依赖性ca通道介 导的外Ca"内流和细胞内Ca释放均不同程度地参与了MTL升 高ASMCs内ca"的作用.用电压依赖性Ca2通道阻断剂和含有 EGTA的无Ca"细胞外液均可不同程度抑制MTL对ASMCs内 ca"的升高作用,导致MTL所致细胞内ca升高的平台期降低,达 峰时间前移,峰值持续时间缩短.这表明细胞外ca内流是ASM— cs细胞内ca2升高平台期维持的重要因素.此外,使用细胞内 ca"释放阻断剂TMB一8预处理细胞后,也可明显抑制细胞内ca 的升高,达峰时间明显后移,这提示细胞内ca释放可能是ASMCs 细胞内Ca"迅速升至峰值的主要来源.但MTL具体以何种方式促 进细胞外Ca"内流以及通过细胞器上的IP,R还是RyRs促进细胞 内ca"释放仍需进一步探讨. 4参考文献 【lJFeighnerSD,TanCP,McKeeKK,ela1.Receptorformotilin identifiedinthehumangastrointestinalsystem[J].Science, l999,284(25):2184.2188. 【2JYoneyamaK.Validationofconfocallaserscanningmicroscopyfor detectingintraeellularcalciumheterogeneityinliverslices[J].J Pharmacol丁icolMethods,2001,45(3):187—93. [3]张志雄,祁小燕,徐有秩.银杏内酯B对豚鼠模拟缺血心肌 细胞L一型钙电流及胆内游离钙的影响[J].生理,2003, 55(1):24—28. [47MarthanR.Store.operatedcalciumentryandintracellularcalcium releasechannelsinairwaysmcothmuscle[J]AmJPhysiolLung CellMolPhysiol,2004.286(5):L907—908. 【5]VanAsscheG.DepoortereI.ThijsT.ela1.Contractileeffects andintracellularCa2signallinginducedbymotilinandcry. thromycininthecircularsmoothmuscleofhumancolon[J].Neu. rogastroenterolMotil,2001,13(1):27.35. *基金项目:国家自然科学基金资助(30170414) 收稿日期:2004.09—01;修回日期:2005—10.08 作者简介:方萍(1976.),女,陕西人,主治医师,博士,主要 从事肌细胞电生理及信号转导的研究.通讯作者.Tel:(029) 87679368,E—mail:donglei4488@slna.coin