助孕胶囊对多囊卵巢大鼠卵巢细胞凋亡的影响

助孕胶囊对多囊卵巢大鼠卵巢细胞凋亡的影响 助孕胶囊对多囊卵巢大鼠卵巢细胞凋亡的影响 作者:刘润侠 党慧敏 刘艳巧 康晓玲 陈梅 【摘要】 目的 观察助孕胶囊对多囊卵巢(PCO)大鼠血性激素水平及卵巢细胞凋亡的 影响，探讨其对PCO模型大鼠的治疗作用并分析其可能的作用机制。 采用孕激素联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)造模法制备PCO模 型大鼠。随机分为对照组、PCO模型组、中药组(助孕胶囊)、西药组 (克罗米酚)，运用放免法测定血性激素水平的变化;采用TUNEL法检 测卵巢组织凋亡细胞及免疫组化染色检测卵巢组织颗粒细胞Bcl 2、Bax的达水平。结果 助孕胶囊可明显降低PCO大鼠血清睾酮T、 促黄体生成素LH水平，显着降低卵巢颗粒细胞凋亡率并下调卵巢组 织颗粒细胞Bax蛋白的表达。结论 助孕胶囊能够通过调整内分泌及 抑制卵巢局部细胞凋亡，在中枢及卵巢局部协调发挥作用，从而调整 PCO性腺功能，促进卵泡的发育成熟及排卵。 【关键词】 多囊卵巢 综合征;助孕胶囊;性激素;凋亡 The effect of Zhuyun Jiaonang on the ovary apoptosis in polycystic ovary rats ABSTRACT: Objective To observe the effect of Zhuyun Jiaonang (ZYJN) on procreate endocrine hormone and the expression of ovarian local cytokines in rats with polycystic ovary (PCO), and analyze the possible therapeutic mechanism. Methods The PCO rat models were established by pregnancy hormone combined with human chorionic gonadotrophin (HCG). Then they were randomly divided into four groups, control group, model group, Chinese crude drug group (ZYJN) and western medicine group (CC). The levels of serum gonadal hormone were detected by radioimmunoassay. Using the immunohistochemical staining technique we detected the expression level of apoptosis regulatory protein Bcl 2, Bax and apoptotic index in ovarian granular cell with TUNEL marking methods. Results ZYJN could decrease the level of testosterone (T) and luteotropic hormone (LH) in rat serum and the expression of protein Bax. The apoptosis index (AI) of ovarian granular cells in model group was obviously higher than that in the control group and treatment group (P0.05). In comparison with model group, the difference was apparent in ZYJN, whose apoptosis index (AI) of ovarian granular cells was obviously lower than the model group (P0.05). Conclusion ZYJN could play a coherent role in the center and ovary by regulating the endocrine function and affecting the apoptosis of ovarian granular cell in rat ovary, thus adjusting gonadal gland and promoting the maturity and ovulation of follicle. KEY WORDS: polycystic ovarian syndrome; Zhuyun Jiaonang; gonadal hormone; apoptosis 多 囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)是一组发病多 因性，临床表现多态性的综合征，以雄激素过多和持续性无排卵为临 床特征。中药调经促排卵临床疗效确切，助孕胶囊为临床经验方，对 PCOS、各种无排卵及排卵障碍导致的月经不调、不孕不育有较好的疗 效。基于以往临床观察研究的基础上，本研究通过建立多囊卵巢 (polycystic ovarian, PCO)大鼠模型，观察助孕胶囊对PCO模型大 鼠卵巢颗粒细胞凋亡及其凋亡调控蛋白表达的影响， 以便从分子生 物学水平及卵巢局部分析其可能的作用机制，为中药调经助孕提供科 学依据。 1 材料与方法 1.1 动物、药品及给药方法 健康SD 雌性大鼠，体重50g左右(西安交通大学医学院实验动物中心提供)。 中药助孕胶囊由西安交通大学医学院第二附属医院中药制剂室提供 (成分主要为紫河车、鹿角胶、仙灵脾、熟地、女贞子、旱莲草、桃 仁、红花、半夏、胆南星等)，0.4g/胶囊，1g胶囊含生药1.575g; 克罗米酚由上海衡山药业有限公司生产，产品批号040301，50mg/粒。 将动物随机分为4组，分别为正常对照组、模型组、中药组(助孕胶 囊组)、西药组(克罗米酚组)，每组各10只。中药组按助孕胶囊生药 6g/(kg?d)，西药组按人与大鼠公斤体重折算系数给药，克罗米酚 (CC)20mg/(kg?d)。对照组和模型组大鼠同期灌服同体积蒸馏水 10mL/kg体重，各组1次/d，共14d。 1.2 动物模型的制作 参照 朱辉等[1]的方法，选用24日龄未成年雌性SD大鼠，皮下埋植左旋 18 甲基炔诺酮硅胶棒(3mm)，在27日龄时每日皮下注射1.5u人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin, HCG)2次，正常对照组每日皮下给注射用水2次，共注射9d。37日龄连续阴道涂片2个性周期。采血，测雄激素(testosterone, T)、胰岛素(insulin, INS)水平。观察到阴道角化细胞持续出现及结合血清T、INS测定，判断PCO大鼠模型是否成功。对照组连续阴道涂片2个性周期，显示完整的动情周期，血清T、INS的测定结果在正常范围。 1.3 血清学指标 末次给药后24h，20g/L戊巴比妥钠0.3mL腹腔麻醉，打开腹腔，腹主动脉取血，离心分离血清，采用放射免疫法检测血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)、促黄体生成素(luteotropic hormone, LH)、雌二醇(estradiol, E2)的水平，由西安交通大学医学院第二附属医院放免检验科按操作程序测定，批内批间误差10%。性激素放射免疫分析药盒购自拉尔文生物工程技术有限公司。 1.4 病理观察 观察双侧卵巢大体解剖，并取下双侧卵巢组织，用10%(体积分数)的甲醛液固定，常规石蜡包埋、切片，待做HE染色及免疫组织化学分析，光镜观察卵巢的组织形态改变、卵泡的大小发育情况。 1.5 Bcl 2、Bax表达的免疫组化检测 SP试剂盒和Bcl 2、Bax单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司，应用DAB显色，均进行抗原修复、HE染色，切片厚4μm，并做阴性和阳性对照。免疫组化结果判定:阳性染色为棕黄色颗粒，特异性位于细胞膜周围。对综合染色强度和分布范围进行半定量评分。评分:(-)，无着色为阴性计0分;(+)，染色弱但明显强于阴性对照者为1分;( )，染色清晰者为2分;( )，染色强者为3分。无阳性细胞数者为0分;10%为1分;20%-30%为2分;30%为3分。上述两种评分相加为表达强度评分。 1.5 卵巢细胞凋亡的检测 TUNEL试剂盒购自福州迈新生物工程公司，经TUNEL法染色后细胞核呈蓝黑色为凋亡细胞，胞核呈浅红色为正常细胞。每个标本观察2张切片，每张切片随机计数6-8个高倍镜视野中凋亡阳性细胞核数目及其占总细胞核数目的比例，求其均值即为卵巢细胞凋亡指数(apoptosis index, AI)。 1.6 统计学处理 所有数据均以均数?标准差(?s)表示，各测量值间的比较用One way ANOVA方差分析，相关性检验 用两变量的相关性分析方法，P0.05为具有显着性差异。 2 结果 2.1 光镜检测结果 对照组镜下见多个黄体及不同发育阶段的卵泡，初级卵泡位于浅层，数目较多，体积小，呈圆形或椭圆形。生长卵泡大小不一，位置较深，成熟卵泡多位于浅表部，可见卵泡腔、卵细胞及卵丘结构。颗粒细胞呈多层(多为6-8层)，形态完整，排列整齐，卵泡膜细胞呈梭形排列;模型组镜下见卵泡颗粒细胞减少而膜细胞层增加，后者常发生黄素化，卵巢皮质间质细胞明显增生，其中可见散在丛状的黄素化细胞巢;西药组在镜下仍可见黄素化的膜细胞层增加，卵巢皮质间质细胞增生，同时可见皮质内出现许多初级卵泡、生长卵泡及少量成熟卵泡，颗粒细胞层数增加，泡膜细胞层变薄，黄体组织数量较模型组明显增多;中药组镜下可见皮质内大多数卵泡为正常发育的卵泡，有初级卵泡、生长卵泡及成熟卵泡。颗粒细胞层数明显增加，约为4-5层，形态完整，排列整齐。泡膜细胞层明显变薄，黄体组织数量较模型组明显增多。 2.2 血清性激素的变化 实验数据显示，模型组T、LH水平高于对照组，而FSH、E2水平明显低于对照组，符合PCOS内分泌紊乱的表现特征。中药组大鼠血清T、LH水平明显低于模型组，而FSH、E2水平高于模型组，均具有显着性差异(P0.05)，西药组大鼠血清E2、FSH水平亦显着高于模型组(P0.05)，两组之间相比无显着性意义(P0.05)。而西药组大鼠血清T、LH水平与模型组之间相比则无显着性差异(P0.05，表1)。 表1 各组大鼠血清性激素的测定结果(略) Table 1 Results of serum gonadal hormone *P0.05 vs. control group; **P0.05 vs. model group; #P0.05 vs. CC group; ZYJN: Zhuyun Jiaonang; CC: chloramiphe 2.3 卵巢颗粒细胞凋亡率的变化 实验结果显示，模型组大鼠细胞凋亡指数明显高于对照组(P0.05)，中药组大鼠细胞凋亡指数显着低于模型组(P0.05)，而西药组大鼠细胞凋亡指数低于模型组，但无显着性差异(P0.05，表2)。