自然霉变玉米对仔猪肠道微生态的影响

自然霉变玉米对仔猪肠道微生态的影响 自然霉变玉米对仔猪肠道微生态的影响 (雷晓娅 陈代文 毛湘冰 毛倩 陈洪 张玲 段绪东 余冰) 玉米等饲料原料在田间及贮运过程中均容易发生霉变，动物摄入含霉菌毒素的饲料后，会出现生产性能下降、胃肠道功能紊乱、机体氧化损伤、免疫抑制和抗病力减弱等毒性效应，给养猪业带来严重的危害;同时，残留在动物产品中的霉菌毒素及其代谢产物可以通过食物链而危害人类的健康。大量研究表明，霉菌毒素会降低动物的采食量和日增重。胃肠道既是养分消化吸收的主要部分，也是抵御摄入天然毒素的第一道屏障。有研究表明，霉菌毒素会损伤动物肠道结构，降低养分消化吸收。动物消化道内存在大量微生物，肠道微生物区系的平衡对于动物的健康起着非常重要的作用，当动物摄入被霉菌毒素污染的饲粮后对肠道微生物区系有什么样的影响，还未见报道。因此，本试验旨在从肠道形态结构和微生态环境变化两个方面考察自然霉变玉米对仔猪生长性能和肠道健康的影响，并通过采食量配对组的设定来进一步剖分效应产的可能原因。 1 材料与方法 1.1试验 试验设3个处理，分别为对照组(饲喂玉米—豆粕型基础饲粮)、霉变玉米组(饲喂由自然霉变玉米100%替代基础饲粮中正常玉米的饲粮)和采食量配对组(饲喂基础饲粮，采食量与霉变玉米组相同)，每个处理5个重复，每个重复1头仔猪。试验期21d。 霉变玉米为自然霉变所得，经检测主要为黄曲霉毒素B1(AFB1)污染，含量为216.52μg/kg;其营养成分为:粗蛋白质12.42%，能量16.90MJ/kg，钙0.0287%，磷0.3027%。 1.2试验饲粮 基础饲粮为正常玉米—豆粕型饲粮，参照美国NRC(1998)5~10kg仔猪的营 养需要配制，为粉料。基础饲粮组成及营养水平见表1.将基础饲粮中正常 玉米用霉变玉米100%替代后构成霉变玉米组饲粮。 表1 基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础)% 项目 含量 原料 玉米 55.3 膨化大豆 12.00 去皮豆粕 11.00 大豆浓缩蛋白 5.00 进口鱼粉 3.00 乳清粉 6.00 蔗糖 3.00 氯化胆碱 0.10 食盐 0.25 脂肪粉 1.50 石粉 1.08 磷酸二氢钙 0.73 L-赖氨酸盐酸盐 0.40 DL-蛋氨酸 0.05 苏氨酸 0.15 色氨酸 0.04 复合多维1) 0.05 香味剂 0.05 微量元素混合料2) 0.30 合计 100.00 营养水平 消化能(MJ/kg) 14.73 粗蛋白质 19.54 钙 0.80 总磷 0.59 有效磷 0.41 可消化赖氨酸 1.25 可消化蛋氨酸 0.34 可消化苏氨酸 0.79 可消化色氨酸 0.23 1) 为每千克饲粮提供:VA 32.5 MIU，VD 8 MIU，VE 80g，VK 10g，VB 25 g，VB12 g，VB 3326 12 120mg，叶酸 3 g，烟酸100 g，生物素500m g，泛酸50 g。 2) 为每千克饲粮提供:Fe120mg/kg，Cu 15 mg/kg，Mn 50 mg/kg，I 0.3 mg/kg，Zn 120 mg/kg， Se 0.3 mg/kg。 1.3 饲养管理 按体重相近的原则随机分为3个处15头28日龄断奶仔猪经7天适应期后， 理，每个处理5个重复，每个重复1头仔猪，饲养于代谢笼中，自由饮水，每天饲喂4次(8:00,12:00,16:00,20:00)，每次以采食后料槽略有少量余料为度，采食量配对组每次均少量供给，推迟两个小时等霉变玉米组采食完成后计算出采食量，再结算补给应给予的饲料量。试验期间每天记录采食量。猪舍温度控制在26?~28?，消毒按常规程序进行。 1.4样品采集 1.4.1饲料样品 按照国标GB/T 14699.1—2005《饲料采样法》的要求分别采集粉碎后的霉变玉米和正常玉米以及不同处理饲粮各1kg，再按照“四分法”将样品减少到200g，与-20?冰箱保存待测。 1.4.2十二指肠和空肠 在试验第22d早上仔猪麻醉致死剖解后，分离肠道，用生理盐水冲洗干净，剪取十二指肠和空肠前段3~4cm，放入10%福尔马林固定液中，待测肠绒毛形态结构。 1.4.3后肠内容物 在试验第15d早上喂料后2h，用无菌棉签刺激仔猪肛门，收集仔猪直肠内容物，在试验第22d喂料后2h进行麻醉剖解，于冰面上收集盲肠和直肠内容物，所有内容物液氮速冻后转入-70?冰箱贮存，待测肠道微生物数量及代谢产物含量。 1.5测定指标及方法 1.5.1饲料中霉菌毒素含量 采用酶联免疫法测定霉变玉米和正常玉米以及各处理饲粮中黄曲霉毒素B1(AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)的含量。按照ROMER试剂盒说明书进行测定。 1.5.2生长性能 与试验起始、第15d和22d早上空腹称重，计算各阶段平均日增重(ADG);每天结算采食量，计算各阶段平均日采食量(ADFI);根据日增重和日采食量计算料重比(F/G)。 1.5.3肠道组织形态结构 将置于10%中性福尔马林固定液中的十二指肠和空肠组织经脱水、浸蜡、 切片等处理，再经苏木精伊红染色，在光学显微镜下进行观察，每个样包埋、 品均选择8个典型的视野(绒毛完整、走向平直)测定十二指肠和空肠绒毛长度和隐窝深度，计算绒毛长度与隐窝深度比值。样品在四川农业大学病理实验室测定。 1.5.4后肠内容物微生物数量 按照OMEGA试剂盒说明书提取盲肠和直肠内容物DNA，采用本试验室Hongwei Qi等建立的荧光定量PCR方法测定和计算盲肠和直肠中大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌以及总菌数量。各菌引物和探针序列见表2.PCR反应体系见表3。SYBR Premix Ex Taq购自TaKaRa，Real Master Mix(Probe)购自TIANGEN。总菌PCR扩增程序为95? 10s，95? 5s;60~64? 25s，39个循环;大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌PCR扩增程序均为95? 10s，95? 5s;60~64? 25s，49个循环。 表2 各菌引物和探针序列 Gene Primer and probe sequence Product Length(dp) Lactobacillus 126 FQ-RSF GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC FQ-RSR GAACAGTTACTCTGACACCCGTTCCTTC FQ-RS-P AAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACT‎‎CTGTT Escherichia coli 96 FQ-DCF CATGCCGCGTGTATGAAGAA FQ-DCR CGGGTAACGTCAATGAGCAAA FQ-DC-P AGGTATTAACTTTACTCCCTTCCTC Bifindobacterium 121 FQ-SQF CGCGTCCGGTGTTAAAG FQ-SQR CTTCCCGATATCTACACATT‎‎CCA FQ-SQ-P ATTCCACCGTTACACCGGGAA Total bacteria 200 Eub338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG Eub518R ATTACCGCGGCTGCTGG 表3 各菌PCR反应体系μl 项目 总菌 乳酸杆菌和大肠杆菌 双歧杆菌 灭菌超氧水 4.25 7.7 7.2 上游引物 0.5 1 1 下游引物 0.5 1 1 DNA 1 1 1 染料 6.25 探针 0.3 0.8 Real MasterMix 8 8 Enhancer Solution 1 1 合计 12.5 20 20 1.5.5后肠内容物微生物代谢产物含量 第二周末直肠及第三周末盲肠和直肠内容物的挥发性脂肪酸采用气相色谱 法测定;氨采用比色法测定;挥发性脂肪酸和氨的具体操作步骤参照陈洪的方 法测定;乳酸采用化学比色法测定，具体操作参照南京建成试剂盒说明书进行。 1.6 数据处理 结果以平均值?标准误表示，数据处理与分析采用SAS8.2进行，将对照组和霉变玉米组以及霉变玉米组和采食量配对组分别进行t检验，以P<0.05作为 差异显著性判断标准。 2 结果 2.1霉菌毒素含量 玉米及饲粮霉菌毒素含量见表4。可见，霉变玉米主要受黄曲霉毒素B1污染，含量 超标，进而导致霉变玉米组饲粮黄曲霉毒素B1也超标，而呕吐毒素和玉米赤霉烯酮可检出，但含量未超标。 表4 饲料中主要霉菌毒素含量μg/kg 项目 对照组 霉变玉米组 霉变玉米 正常玉米 标准 黄曲霉毒素B1 4.68 168.66 216.52 4.11 ?10 呕吐毒素 0 0 63 73 ?1000 玉米赤霉烯酮 39.57 40.9 14.9 92.16 ?500 2.2不同处理对仔猪生长性能的影响 不同处理对仔猪生长性能的影响结果见表5。与对照组相比较，霉变玉米组仔猪的平均日增重和平均日采食量在试验前两周及全期均有降低的趋势，但差异不显著(P>0.05)。而与采食量配对组相比，霉变玉米组仔猪的全期平均日增重显著增加(P<0.05)，全期料重比则显著降低(P<0.05)。 表5 不同处理对仔猪生长性能的影响 项目 对照组 霉变玉米组 采食量配对组 初始重/kg 8.10?0.33 8.10?0.33 7.94?0.42 末重/kg 18.54?0.57 17.20?0.77 15.28?0.52 前两周 平均日增重/g 448.86?30.05 368.86?47.56 352.94?23.19 平均日采食量/g 664.61?48.22 564.71?64.69 564.71?25.80 料重比 1.48?0.02 1.55?0.05 1.60?0.08 全期 a平均日增重/g 497.33?22.38 433.52?25.00 373.61?19.57 平均日采食量/g 764.90?44.30 657.55?60.44 657.55?32.30 a料重比 1.54?0.05 1.51?0.07 1.76?0.05 注:a表示霉变玉米组与采食配对组间差异显著(P<0.05)。 2.3不同处理对仔猪肠道形态结构的影响 不同处理对仔猪肠道形态结构的影响结果见表6。与对照组相比，霉变玉米组仔猪空肠绒毛长度与隐窝深度的比值显著降低(P<0.05);与采食量配对组相比，霉变玉米组仔猪空肠绒毛长度以及绒毛长度与隐窝深度比值均显著降低(P<0.05)，隐窝深度显著提高(P<0.05)。 表6 不同处理对仔猪肠道形态的影响(单位:μm) 项目 对照组 霉变玉米组 采食量配对组 十二指肠 绒毛长度 322.74?19.81 334.97?20.05 294.86?17.27 隐窝深度 311.29?18.74 310.49?21.76 322.70?27.79 绒毛长度/隐窝深度 1.05?0.09 1.11?0.12 0.94?0.10 空肠 绒毛长度a 339.76?5.05 306.45?14.91 357.55?2.42 隐窝深度a 242.33?18.71 293.119?18.01 229.38?8.38 绒毛长度/隐窝深度ab 1.45?0.14 1.06?0.08 1.57?0.06 注:a表示霉变玉米组与采食配对组间差异显著(P<0.05);b表示对照组与霉变玉米组间差异显著(P<0.05)。 2.4 不同处理对仔猪后肠微生物数量的影响 不同处理对仔猪后肠菌群的影响结果见表7。从表7中可看出，与对照组相比，霉变玉米组仔猪第三周末直肠内容物乳酸杆菌数以及盲肠内容物大肠杆菌数和乳酸杆菌数均显著提高(P<0.05);与采食量配对组相比，霉变玉米组仔猪的直肠和盲肠内容物中个菌数均无显著差异。 表7 不同处理对仔猪后肠菌群的影响(cfu/g) 项目 对照组 霉变玉米组 采食量配对组 第二周末直肠内容物 总菌 9.975?0.087 9.668?0.259 9.562?0.144 大肠杆菌 7.278?0.047 7.696?0.197 7.236?0.168 乳酸杆菌 7.384?0.376 8.3190.344 7.690?0.473 双歧杆菌 7.486?0.532 6.590??0.548 6.715?0.312 大肠杆菌/总菌% 0.211?0.032 4.114?2.794 0.819?0.486 乳酸杆菌/总菌% 0.762?0.476 9.248?4.082 3.723?2.009 双歧杆菌/总菌% 1.449?0.916 0.578?0.355 0.348?0.152 第三周末直肠内容物 总菌 11.109?0.192 11.139?0.268 10.851?0.141 大肠杆菌 7.452?0.081 8.672?0.559 7.444?0.094 乳酸杆菌b 7.206?0.230 8.403?0.271 7.666?0.230 双歧杆菌 7.629?0.352 7.304?0.417 7.294?0.262 大肠杆菌/总菌% 0.042?0.027 3.707?3.354 0.051?0.020 乳酸杆菌/总菌% 0.057?0.045 0.390?0.187 0.092?0.032 双歧杆菌/总菌% 0.066?0.033 0.031?0.011 0.040?0.010 第三周盲肠内容物 总菌 10.820?0.232 11.143?0.212 10.682?0.158 大肠杆菌b 7.478?0.138 8.835?0.570 7.621?0.101 乳酸杆菌b 6.664?0.205 8.059?0.370 6.921?0.372 双歧杆菌 7.310?0.253 7.136?0.430 7.213?0.243 大肠杆菌/总菌% 0.070?0.037 1.875?1.188 0.108?0.034 乳酸杆菌/总菌% 0.023?0.017 0.228?0.101 0.036?0.017 双歧杆菌/总菌% 0.064?0.037 0.030?0.015 0.048?0.019 注:b表示对照组与霉变玉米组间差异显著(P<0.05)。 2.5不同处理对仔猪后肠微生物代谢产物的影响 不同处理对仔猪后肠微生物代谢产物的影响结果见表8。与对照组相比，霉变玉米组仔猪第三周末直肠和盲肠内容物丙酸含量及直肠内容物丁酸含量均显著提高(P<0.05);第三周末直肠内容物氨含量及盲肠内容物乳酸含量均有提高的趋势(P>0.05)。与采食量配对组相比，霉变玉米组仔猪的第二周末直肠内容物乙酸和总挥发性脂肪酸含量显著降低(P<0.05)，第三周末盲肠内容物丙酸含量显著提高(P<0.05);第三周末直肠和盲肠内容物氨含量均有提高的趋势(P>0.05)。 表8 不同处理对断奶仔猪后肠微生物代谢产物的影响 项目 对照组 霉变玉米组 采食量配对组 第二周直肠内容物(mmol/L) 乙酸a 81.77?6.55 72.05?7.51 92.85?3.20 丙酸 23.32?2.59 23.04?3.14 26.16?4.35 丁酸 5.39?2.09 6.45?2.09 11.68?2.47 总挥发性脂肪酸 110.49?7.12 101.53?9.99 130.69?7.25 第三周直肠内容物(mmol/L) 乙酸 62.25?9.20 66.60?4.96 62.49?13.63 丙酸 20.30?2.22 32.33?2.09 26.20?3.54 丁酸 9.98?1.34 18.21?2.46 15.96?2.77 总挥发性脂肪酸 92.52?12.56 117.15?7.97 104.65?11.88 第三周盲肠内容物(mmol/L) 乙酸 68.99?9.25 65.28?8.31 53.86?7.90 丙酸 2.26?0.46 31.24?2.73 17.83?2.27 丁酸 7.62?1.68 10.58?2.72 4.31?0.46 总挥发性脂肪酸 78.87?10.98 107.09?12.36 76.00?10.07 氨(mg/100g) 第二周直肠内容316.63?23.61 254.03?58.54 243.40?46.23 物 第三周直肠内容224.87?32.37 298.00?80.29 248.23?44.91 物 第二周盲肠内容86.05?20.94 84.66?19.27 72.880?7.83 物 乳酸(mmol/L) 第二周直肠内容2.64?0.52 2.17?0.42 2.42?0.30 物 第三周直肠内容4.07?1.50 3.63?0.68 5.45?0.93 物 第二周盲肠内容2.11?0.18 2.92?0.85 2.37?0.63 物 注:a表示霉变玉米组与采食配对组间差异显著(P<0.05);b表示对照组与霉变玉米组间差异显著(P<0.05)。 1)总挥发性脂肪酸为测定值。 3讨论 3.1不同处理对仔猪生长性能的影响 本试验所用自然霉变玉米主要以黄曲霉毒素B1(168.66μg/kg)污染为主，黄曲霉毒素会抑制猪的生长发育，导致免疫器官发育受阻，抑制免疫功能，损害生殖功能等。Harvey等研究发现2.5mg/kg黄曲霉毒素组生长猪体增重显著低于对照组;Schell等研究发现922μg/kg黄曲霉毒素极显著降低仔猪ADFI和ADG;史莹华等也报道0.1mg/kg黄曲霉毒素导致生长猪ADG降低12.90%(P<0.01)，F/G提高7.54%(P<0.01)。本试验也发现与基础饲粮组相比，自然 霉变玉米组饲粮导致仔猪ADG和ADFI的降低;但与采食量配对组相比，霉变玉米组仔猪ADG增加，F/G降低。该结果表明，在本试验条件下自然霉变玉米导致仔猪ADG的降低主要是降低了ADFI。冯光徳研究也发现在0~7d、8~14d和0~14d，自然霉变玉米组肉鸭ADG较采食配对组分别增加4.63%、18.25%和13.83%(P<0.01);霉变玉米组肉鸭全期F/G较正常玉米组合采食配对组分别降低4.90%(P<0.01)和5.56%(P<0.01)。此外，叶涛用含呕吐毒素为主的自然霉变玉米饲喂生长肥育猪，结果发现生长育肥猪的饲料转化效率因霉变玉米的使用而得以改善(即料肉比降低。产生上述结果的可能原因包括2个方面，一方面玉米自然霉变过程中可能产生一些未知成分，如蛋白酶和淀粉酶等消化酶产生，可溶性糖和还原糖提高，进而对仔猪产生一定的促生长作用;另一方面，采食量配对仔猪因采食量的受限可能导致维持需要的增加，从而使采食量配对组仔猪的料重比增加。 3.2不同处理对仔猪肠道形态结构的影响 小肠是消化道内营养物质吸收和转运的主要部位。小肠绒毛主要负责营养物质的吸收，绒毛高度越高说明成熟细胞越多，吸收功能越强;隐窝深度反应细胞的生成率，隐窝深度越浅，说明细胞成熟率上升，分泌功能增强。绒毛高度与隐窝深度的比值(VCR)综合反应了小肠的吸收功能,VCR比例越大养分吸收能力越强。苏军研究发现随饲粮中霉玉米替代比例的增加，仔猪十二指肠和空肠前段的绒毛高度呈显著线性或二次曲线降低，十二指肠前段隐窝呈显著线性加深，空肠前段隐窝呈显著线性或二次曲线加深。本试验研究发现霉变玉米显著降低空肠绒毛长度以及绒毛长度与隐窝深度比值，显著增加隐窝深度，表明自然霉变玉米能损伤仔猪空肠形态结构，与前人研究结果一致。空肠结构的损伤将抑制养分的吸收，进而影响霉变玉米组仔猪的生长性能。 3.3不同处理对仔猪肠道菌群和微生物代谢产物的影响 正常动物的肠道微生物区系处于动态平衡中。健康仔猪从十二指肠到结肠，双歧杆菌、乳杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、类杆菌、梭菌和肠球菌8种细菌数量都随肠段后移而逐渐增加。在肠道中，挥发性脂肪酸主要来源于梭 形杆菌等厌氧菌对碳水化合物和未消化蛋白质的发酵，氨是肠道腐败菌分解未消化的蛋白质而产生。 动物摄入含AFB1的食物后，约有50%AFB1在十二指肠被吸收，未被吸收的AFB1进入后肠，若导致肠道粘膜受损，则病原微生物较易定植，且因形态结构的损伤对营养物质的消化和吸收可能受限，致使进入后肠的营养物质增多，造成微生物发酵异常。此外，有研究发现当肝脏结构功能异常时，肠道微生态环境也将遭到破坏。本试验也发现霉变玉米组仔猪肝脏有不同程度的损伤(尚未发表)。本试验结果发现自然霉变玉米饲粮提高仔猪第三周末盲肠内容物大肠杆菌数、乳酸杆菌数和丙酸含量以及直肠内容物乳酸杆菌数、丙酸和丁酸含量，氨含量有提高的趋势。可能是由于霉菌毒素造成仔猪肠道受损，进入后肠养分增加，被乳酸杆菌和大肠杆菌利用，促进其数量及代谢产物丙酸的增加。结果表明，本试验条件下，霉变玉米饲粮会改变仔猪后肠菌群结构，而变化的原因及带来的可能影响有待进一步研究。 4结论 )有降低仔猪平均日采食量自然霉变玉米(含168.66μg/kg黄曲霉毒素B1 和平均日增重的趋势，损伤了空肠形态结构，提高了盲肠大肠杆菌数和乳酸杆菌数，改变了肠道微生物区系。