【doc】聚合酶链反应联合地高辛探针筛检宫颈16例人乳头瘤病毒

【doc】聚合酶链反应联合地高辛探针筛检宫颈16例人乳头瘤病毒 聚合酶链反应联合地高辛探针筛检宫颈16 例人乳头瘤病毒 医学掩黔杂志】996正5月鹤L9卷荦3期 f6j,f( 聚合酶链反应联合地高辛探针筛检 宫颈16型人乳头瘤病毒 ……树龄踮娥 氏 /' 摘要目的寻找临床筛选宫颈16鼎几乳头瘤病毒(HPV16)感染患者的方法.探讨HPV16与 宫颈癌发生的相关-性方法自行研栅地高辛际记HPV!GDNA(DigHPV16DNA)探针.联合聚台 酶链反应(PCR)撞删丁73例宫颈癌,48侧慢性宫颈炎患哲的活检组织和脱落细胞.结果自制探针 灵敏度逃1p.特异性强;PCR一电泳法检珊宫颈癌技宫颈毙活检组织,HPV16DNA阳性率分别为 82和29(P<0.01);检删脱落蛐胞,瑁性革分别为89私25(尸<0.05)两种取样方法检测差 异无显着性(P>O.05).结论Dig—Hpv15DNA探针灵敏,持异,有推广价值.HPV16感染可能在宫 颈癌发生中起着重要的病因学用;宫预上皮脱落细胞是床上用PCR筛选HPV感染患者的理想 标求福 关键词乳头状瘤病毒子宫颈肿瘤坠 ScreeningofHPV16infectionincervixbyPCRanddigoxigeninprobeZhao 州?f',Zkengyan. f… ShMmg-etId.DepartmentoJImmunologytSha,~tongAcademyoiMedicalScu~*ces..]l'naT~250062 AbstractOb_iectiveToestablishthemethodofscreeningHPV16infectionofcervixinclinicand t.nvesr:RatetherelationshipbetweenHPV16andcervicalcancerMethodsDigoxigeninlabelled HPV161'NA(DigHPV16DNA)probewsprepared.HPV16DNAwasdetectedinbiopsiesandexfo— liatedcervicovagina]cellsof73uase~withcervicalc~Heerand48caseswithcervieitisbyPCRandDig HPV16I)NAprobeResultsTheprobeselfpreparedv,,absensitiveandspecific.itssensitivitycould reach1pgUsingPCRfollow6dbyagarosegelelectrophoresis.thepositiverateofHPV16inbiopsies wiLht-er,iceIcancerandcervicitis~rere82and29respectively(P<001).andthatLnexfoliated eervicovaginatcellswere89end25respectivety(尸 <0.05).ThereWaSnosignificantdifferencebe— tweenbiopsyandexfoliatedcervicovagina[ce!1.ConclusionsHPV16infectionmaybeanimportantvi raletiologyofcervicalcancer.Exfoliaredcervicovaginalcellswere~loresuitablespecimenthanbiopsy forscreeningHPVinfectionofcervixinchniebyPCR. KeywordsPapil[omavirusesCervicalneoplasmsDigoxigeninprobePo]ymerasechain reactlOn 人乳头瘤病毒(humanpapil[omavirus, HPV)属DNA肿瘤病毒,对人具有广泛的致病 性,除能引起e染性很强的生殖系感染外,某些 型别还具有潜在的致癌性.其中HPV16与宫 颈癌的发生密切相关,被视为宫颈癌的高危因 作苷单位25'J062济南.Ih东肯医学科学院基础医学研究 所免瘦譬 子.近年来,分子杂交和聚合酶链反应(poly— merasechainreaction,PCR)技术对HPVDNA 的检测取得了突破性进展.为提高PCR用于检 测宫颈HPV16感染的精确性,我们研制了地 高辛标记HPV16DNA(Dig—HPV16DNA)探 针,并对宫颈炎和宫颈癌组织DNA的PCR产 物作进一步杂交;同时还对不同来源的标本 检测结果进行了比较 材料与方法 1标本:48倒慢性宫颈炎,73例宫颈癌活硅组织 及相应上皮脱落细胞由山东省肿瘤医院提供,均经病 理检查确诊并一20c冻存. 2.主要试剂:地高辛标记和检测试剂盒呐自德国 BoehrlngerMannhetm公司;古HPV16DNA的重组 PBR322质粒(pHPV16)由德国zurHausen教授惠赠. 3组织DNA提取:常规蛋白酶K消化,酚/氯仿 抽提法进行. 4.DigHPv16DNA探针的制各:pHPV16按Ma— niatis方法进行细菌转化,培养及质粒扩增;常规碱 裂解法提取的质粒DNA经BamHI酶切,0.8琼脂 糖凝腔电泺分离7.9khHPV16DNA.并经V型槽电 洗脱回收纯化,碹机引物法进行地高辛标记. 5PCR:引物进自HPv16的E/E区开放读码框 架,扩增片段为195bp,由中国科学院上海细胞所合成. 反应体积为40t~l.分别15,pHPV16和鼠肝DNA为阳性 和阴性对照,在PE公司产扩增仪上接94C1分钟, 6OC1分钟,72C1分钟,3O十循环后72c延伸5分 钟扩增产物经2琼脂糖凝胶电泳. 6.杂交:10ngpHPV16DNA经10倍系列稀释 至lpg为阳性对照,XDNAPBR322,HBVDNA为阴 性对照及特异性检测.变性待检DNA经点膜,42c过 夜杂变,洗膜,显色后,出现蓝紫色斑者为阳性反应 结果 1.HPV16DNA片段的制备:提取的pHPV 16可被适量BamH1完全酶切,明其纯度较 高,可用于探针制备.回收的HPV16DNA经 凝胶电泳显示为均匀单一的条带.大小约 7.9kb. 2.探针的质量参数:1OngpHPV16经10 倍系列稀释的阳性对照结果显示灵敏度达 A1:l0pgXDNA1Bl;10pgPBR322{B3:10ngpHPV18 A,,A6:pt-IPV16(1Og,1Pg){Blt10ngt-IBVDNAI &,B:正常宫颈组织 附圈I)igHPV16DNA探针点杂变结果 ChinJMedLabSet,May1996,Vol19.No.3 lpg,与PBR322,XDNA,HBVDNA均呈阴性 反应(附图). 3.活检组织中HPV16DNA的检测:活检 组织DNA经PCR及琼脂糖凝胶电泳检测.宫 颈炎及宫颈癌的阳性率分别为29(14/48), 82(6o/73).检验表明.HPV16在宫颈癌的 感染率显着高于宫颈炎(P<0.01).进一步将 PCR产物与Dig—HPV16DNA探针进行点杂 交,结果在宫颈炎组与电泳法一致,在宫颈癌组 阳性率为85(62/73).经配对资料检验表 明.两种方法检出率的差异无显着性(尸> 0.05). 4.宫颈上皮脱落细胞中HPV16DNA的 检测:宫颈上皮脱落细胞组织DNA经PCR一琼 脂糖凝胶电泳检测,结果显示宫颈炎及宫颈癌 的阳性率分别为25(12,/48)和89(65,/73), (尸<o.05).与活检组织作相关性表明.两 种取样方法检测结果的差异无显着性(P> 0.O5),两组的符合率分别为9.8和90.4N. 讨论 HPV16感染在宫颈癌的发生中起着重要 的病因学作用,及时检出意义重大探针杂交 技术是目前较理想的检测手段.但常规使用的 同位素或生物素标记pHPVDNA探针存在半 衰期短,放射损伤,操作不便,内源性生物素干 扰等诸多弊端,限制了其临床应用地高辛标记 系统则克服了上述不足,其杂交周期短,操作稳 定,安全,杂交液可重复使用,无放射性污染.实 验结果显示DigHPV16DNA探针灵敏度达 lpg,对.X.DNA,PBR322,HBV等异源性DNA 即使提高点膜量也呈明确的阴性反应.可见,该 探针灵敏,特异,完全符合实验要求,具有很高 的实用推广价值 鉴于临床标本尤其是生殖道组织,常携带 有PBR322同源DNA序列的大肠杆菌,以pH- PV探针杂交.假阳眭结果时有发生本研究 制备的游离HPV16DNA片段经凝胶电泳及 杂交显示纯度高.无PBR322及RNA污染,完 全符合后续实验要求. 静 一. 中华医学柱驻杂l998年5月第l9卷第3期 Meisels等提出宫颈湿疣可能是宫颈上 皮内新生物(CIN)的前期病变,与宫颈癌的发 生有关各类研究结果表明高危HPV与CIN 有关.有恶变倾向.其E,E区为转换基因,能 阻止人角化细胞的衰老.其感染宫颈后常发生 E/E区的选择性整合和异常表达+并可能通 过激活癌基因,灭活抗癌基因及与HSV—I, HCMV起协同作用而致宫颈癌变".本研究 选用其E/E区特异引物对宫颈癌,宫颈炎患 者活检组织和脱落细胞组织DNA进行PCR 扩增.结果,HPV16在宫颈癌组的检出率显着 高于慢性宫颈炎组.充分证明高危HPV与宫 颈癌的高度相关性,同时提示HPV16感染的 慢性宫颈炎患者应视为宫颈癌的高危人群,需 作进一步追踪观察.将宫颈活检组织的PCR产 物与DigHPV16DNA探针作点杂交检测,表 明PCR一电泳法结果特异可靠,充分证实引物 选择的合理性另外.在宫颈癌组有两例PCR一 电泳法阴性的标本经PCR一点杂交检测呈阳 性.表明分子杂交检测PCR产物较电泳法有着 更高的灵敏度.但后者简便易控,操作迅速,其 检测的灵敏度亦符合常规实验检测的要求,因 而是PCR扩增产物分离,检测最常用的方法. 用宫颈活检组织检测HPV,取材较困难, 患者有一定的痛苦,常难以接受.我们对48例 宫颈炎和73例宫颈癌患者同时取活检及上皮 脱落细胞进行PCR电泳检测.两种取样方法检 测差异无显着性.由于PCR技术有灵敏度高和 特异性强等特点,因而对原始材料质量要求较 低,极微量的样品即可进行检测我们认为对 探针杂交而言.宫颈上皮脱落细胞可能存在细 胞数量不足的问题;但对于PCR,宫颈上皮脱 落细胞完全可取代活检组织,尤其适用于大 面积人群普查. 参考文献 lurHausenH.Papillomavirasesinanogenita[canc…R mode【tounderstandtheroleofviru~inhuman…cers CancerRes,l989.49:4677. 2SambreokJtFritschEF,Mama6sT.Motecularclotting;a laboratorymanual2ndedNewYork:ColdSpringHarbor LaboratoryPress?l989.25—41. 3KoutskyLA.GaltowayDA,HolmesKK.Epideminiogyof genitalhumanpapillotrmvirusinfection.EpideminlRev, l988.10:l22. 4AmbinderRF.C}LarocheP,StoolS,et.Thevec?rhe- motogyproblemindiagnosticnucleicacidhybridizationof clinicalspedmessJClinM~robio[.1986,24:l6. 5MeiselsA,FortinR,RoyM.Condy[omatouslesionsofthe cervix.1.Cytolngte,colpc~copicandhistopathotogic study.ActaCyto[.1977,2l?379. 6HowleyPMRoteofthehunmnpapi1torrmvirusesinhuman can,er.CancerRes,l991-51:5019 7AltmannA,JochmusI,RtMF.Intra-andextraceUularcon- tro[mechanismsofhumant:x~piltomavirusinf~tion.Intervi- rology,l99437180 8YoungLS,BevanIS,Johr~onMA,et.Thepo[ymerase chainreactionaneepidemintogicaltoo]forinvestigating ce~teathumanpapitlomavte~inf~tinn.BMJ,l989,298: l4 (收稿:1995—10ll修回1996—0228) (本文编辑:陈伟明) 全国医院感染管理第二届学术年会征文通知 为加强学术交流.深入开展医院感染管理工作,不断提高医院感染监测,控制与管 理水平,降低医院感染发病 率,我会决定于1996年9月召开全国医院感染管理第二届学术年会.现将征文要求 通知如下:(1)内容:医院感染 管理,医院感染监测,医院感染的病原学研究,医院感染与护理管理,医院感染与医 疗质量管理,医院的消毒与灭 菌,抗生素的台理使用与管理,医院感染管理专业等.(2)字数:论文在500o字以 内,用稿纸打印(或复写)一式 两份.并附一份400字的论文摘要.(3)截稿日期:1996年6月30日(以邮戳为准)(4)凡在正式刊物上发表过的文 章不在征集范围 论文请寄:北京市西艟区西安门大街一号北京医科大学第一医院医院管理研究室 邮政编码:100034联系 人:姚洪屯话:(OtO)Tt7II22—3283或3275 中华医院管理学会医院感染管理专业委员会