[汇总]大黄酸对体外培养小鼠肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白1表达及葡萄糖摄入的影响

[汇总]大黄酸对体外培养小鼠肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白1达及葡萄糖摄入的影响 大黄酸对体外培养小鼠肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白1表达及葡 萄糖摄入的影响 大黄酸对体外培养小鼠肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白1表达及葡 萄糖摄入的影响 2011-05-09 章精 刘志红 李颖健 陈朝红 黎磊石 【摘要】 目的 研究大黄酸对系膜细胞葡萄糖转运蛋白1(GLUT1) 及葡萄糖摄入的影响，探讨大黄酸拮抗TGFβ1作用的可能机制。方 法 选用体外培养的小鼠肾小球系膜细胞，GLUT1 mRNA表 达的检 测 采用Northern印迹，葡萄糖摄入的测定采用2-deoxy-〔3H〕 -D-glucose摄入法。结果TGFβ1显著增加系膜细胞GLUT1 mRNA的 表达和葡萄糖摄入，大黄酸对正常培养条件下系膜细胞的葡萄糖摄入 没有明显影响，但可以拮抗TGFβ1增加系膜细胞GLUT1 mRNA表达与 葡萄糖摄入的作用。结论 TGFβ1介导系膜细胞葡萄糖代谢的改变 以及细胞外基质合成的增加，大黄酸能明显抑制TGFβ1所引起的系 膜细胞GLUT1表达与葡萄糖摄入的异常增高。 【关键词】 葡萄糖转运蛋白1 大黄酸 转化生长因子β1 肾小球系膜细胞 Effect of rhein on glucose transporter-1 expression and glucose uptake in mouse glomerular mesangial cells cultured in vitro ZHANG Jing,LIU Zhihong,LI Yingjian,et al. Research Institute of Nephrology,Jinling Hospital,Nanjing University, School of Medicine,Nanjing,210002 【Abstract】 Objective To explore the possible molecular mechanism that rhein antagonizes the effect of TGFβ1 on glomerular mesangial cells. Methods Cultured C57/SJL mouse mesangial cells were used in the in vitro study. The expression of glucose transporter 1 (GLUT1) mRNA was detected by Northern blot and the ability of glucose uptake was determined by 2-deoxy-〔3H〕-D-glucose uptake assay. Results Rhein had no effect on glucose uptake in mesangial cells cultured in normal glucose concentration. TGFβ1 could upregulate the expression of GLUT1 mRNA and gucose uptake in mesangial cells and this effect was markedly attenuated by the addition of rhein in a dose-dependent manner. Conclusion TGFβ1 could upregulate the expression of GLUT1 mRNA and glucose uptake in mesangial cells, leading to excessive glucose consumption and extracellular matrix production in diabetic nephropathy. Rhein antagonized the effect of TGFβ1 in mesangial cells. 【Key words】 Glucose transporter 1 Rhein Transforming growth factor β1 Glomerular mesangial cells 大部分哺乳动物细胞是以葡萄糖作为其主要的能量来源，葡萄糖 转运蛋白1(glucose transporter 1，GLUT1)是细胞膜上一种重要的 葡萄糖载体分子，介导葡萄糖通过易化扩散由膜外转运至细胞内，直 接调节细胞的糖代谢〔1〕。 系膜细胞代谢异常与细胞外基质(extracellular matrix, ECM) 合成增加是糖尿病肾病中肾小球硬化形成的关键因素〔2〕，GLUT1 是肾小球系膜细胞主要的葡萄糖转运体，GLUT1在系膜细胞的过度表 达使得过多的葡萄糖进入细胞，引起细胞糖代谢的紊乱，进而导致细 胞外基质合成增加〔3，4〕。转化生长因子β1(TGFβ1)在糖尿病肾 病的发生及发展中起重要作用，TGFβ1可以上调系膜细胞GLUT1的 表达与葡萄糖的摄入〔5〕，因此，抑制TGFβ1介导的GLUT1在系膜 细胞的过度表达是预防与治疗糖尿病肾病重要途径。 大黄酸(rhein， 4,5 dihydroxyanthraquinone-2-carboxylic acid)是中药大黄的一种主要成份，动物实验表明中药大黄及其提取物大黄酸可以抑制糖尿病大鼠肾脏的高代谢，明显减少尿蛋白，控制肾脏的肥大，但其作用机制并不清楚〔6，7〕。体外实验显示大黄酸可以抑制肿瘤细胞葡萄糖的摄入，影响其能量供应，而且大黄酸对系膜细胞的增殖也有抑制作用〔8，9〕。 为了研究大黄酸对糖尿病状态下系膜细胞糖代谢可能的影响，我们分别观察了大黄酸对正常培养条件下和TGFβ1刺激下系膜细胞GLUT1表达及葡萄糖摄入的影响。 材料和 一、材料 大黄酸由本研究所从中药大黄中提取，纯度大于95%;DMEM(低糖)购自Sigma公司;小牛血清购自四季青生物工程研究所;TGFβ1购自Promega公司;GLUT1 cDNA探针由美国华盛顿大学Mueckler博士惠赠;随机引物标记试剂盒来自Promega公司;2-deoxy-〔3H〕-D-Glucose购自Amersham公司。 二、系膜细胞培养 本实验采用的系膜细胞是从四周龄C57B1/6J×SJL/J小鼠肾小球分离克隆的系膜细胞系。所有实验均控制在25,35代细胞中进行。细胞在DMEM培养液中培养传代(20%小牛血清)。 三、RNA提取与Northern印迹 选70%融合的系膜细胞，用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，取30μg RNA在含2.2mol/L甲醛的1%琼脂糖中电泳，毛细管法转印至尼龙膜上，80?固定两小时，在预杂交液(5×SSPE，50%甲酰胺，5×Denhardt's液, 0.1%SDS,100μg/ml鲑鱼精子DNA)中42?预杂交4小时，在含32P标记cDNA探针的杂交液(5×SSPE,50%甲酰胺，0.1%SDS，100μg/ml鲑鱼精子DNA)中42?杂交18小时，2×SSC，0.1%SDS溶液室温洗三次，0.2×SSC，0.1%SDS溶液55?洗一次，对 X光片-70?曝光48小时。GLUT1探针标记采用随机引物法。 四、系膜细胞葡萄糖摄入测定 系膜细胞接种二十四孔板中生长至70%融合，弃培养液，用20mmol/L HEPES(140mmol/L NaCl,1mmol/L CaCl2,5mmol/L KCl,2.5mmol/L MgSO4,20mmol/L HEPES,0.1%BSA,pH 7.4)洗三次，加入1ml 1μCi/ml 2-deoxy-〔3H〕-D_Glucose的HEPES液，37?半小时，PBS洗三次，加1mmol/L NaOH作用两小时，盐酸中和至中性，加闪烁液5ml，液闪仪计数其cpm值。蛋白质浓度测定采用考马斯亮兰G250法。 结 果 一、大黄酸对生理葡萄糖浓度培养条件下系膜细胞葡萄糖摄入的影响 系膜细胞在生理葡萄糖浓度培养条件下生长至亚融和状态，分别加入50μg/ml和25μg/ml的大黄酸培养24小时，发现大黄酸对系膜细胞葡萄糖摄入无明显影响，与对照组葡萄糖摄入率(100%)相比则分别为90.39%及95.84%。 二、TGFβ1对肾小球系膜细胞葡萄糖摄入的影响 系膜细胞70%融合，用含1%血清培养液处理24小时，分别加0.5ng/ml,1.0ng/ml和2.0ng/ml的TGFβ1至1%血清的培养液中继续作用10小时，并以1%血清为对照，发现TGFβ1能显著增加系膜细胞葡萄糖摄入，以对照组摄入为1，则加0.5 ng/ml,1.0ng/ml,2.0ng/ml，各组葡萄糖摄入为2.82，2.87，4.28，其作用呈剂量依赖关系。