[DOC] 孕妇外周血中胎儿有核红细胞用于产前诊断的研究进展

[DOC] 孕妇外周血中胎儿有核红细胞用于产前诊断的研究进展 孕妇外周血中胎儿有核红细胞用于产前诊 断的研究进展 中国优生与遗传杂志2006年第14卷第6期?7? 孕妇外周血中胎儿有核红细胞用于产前诊断的研究进展 李芹.王建军(扬州大学医学院形态实验室,江苏225001) 摘耍:本文概述孕妇外周血中胎儿有核红细胞的分离与检测用于产 前诊断的研究状况,描述母体外周血中的胎儿细 胞的特点,胎儿有核红细胞的富集和分离方法,并对各方法的优点,缺 点,病理性妊娠的意义,临床应用,存在的问题及 研究进展作一综述. 关键词:孕妇外周血;胎儿有核红细胞;产前诊断 中围分类号:R714文献标识码:A文章编 9534(2006)06—0007—03 号:1006— Researchadvancesintheprenataldiagnosisbyseparatingfetalnucleatedredb loodcellfrommaternalperipheralblood. |L,Qin,WANGJian—jun.(MorphologicLaboratoryofMedicalCollegeofYangzhouUniversity,225001) Abstraet:Thearticlesummarlzestheinspectionstatusofseparatingfetalnucl eatedredbloodcellfrom.,maternalperipheralblood inprenataldiagnosis.Describesthefetalcellcharacteristicsinmaternalperip heralblood.methodsofenrichmentandisolation.And reviewstheadvantageanddisadvantageofinspectionmethod.Thesenseofpa thologicalpregnancy.Theusefulnessofclinicalappli- once.Theexistingproblemsandresearchadvances. Keywords:MatemalPeripheralBlood;Fetalnucleatedredbloodcells;Prenat aldiagnosis 产前诊断是对胚胎或胎儿在出生前是否患有某些遗传 病或先天畸形作出准确的诊断,目前所用产前诊断方法多属 于损伤性诊断方法,如绒毛取样和羊膜腔穿刺等.此种手段 对孕妇和胎儿具有潜在的危害性而不易为孕妇接受.多年 来,研究者们致力于寻找一种无创性的产前诊断方法,胎儿 细胞存在于母体外周血中已被许多学者证实,其中胎儿有核 红细胞(fetalnucleatedredbloodcell,FNRBC)用于产前诊断 成为医学病理学,医学优生与遗传学的重要目标之一,现将 这方面的进展综述如下. 1.母血中胎儿细胞的类型及其用于产前诊断的可能性 目前已知孕妇外周血中胎儿细胞的种类有:滋养层细 胞,胎儿淋巴细胞,胎儿粒细胞和胎儿有核红细胞. (1)滋养细胞:早在1893年德国病理学家Schmofl…在 死于子痫孕妇的肺毛细血管中发现滋养叶细胞,首次认识到 病理条件下胎儿母体细胞间的交通.有许多研究者证实在 母血循环中确实存在胎儿细胞.滋养细胞是理论上最容易 分离的胎儿细胞,但其入母血后多数被肺组织捕获,在外周 血中的数目既不多,也不恒定,故不适用于早期诊断. (2)胎儿淋巴细胞:在孕妇分娩后还能在母体外周血中 持续存在1—5年J,在多次妊娠的情况下,分离得到的胎儿 淋巴细胞可能不代当前妊娠的情况,而且胎儿淋巴细胞与 母体淋巴细胞不易区分,也使其在产前诊断中的应用受到了 限制. (3)胎儿粒细胞:1992年Weissman等用亲合素标记的 Y染色体特异性序列探针PY431进行非放射性同位素原位 杂交,发现在孕7周母胎之间就存在着粒细胞转移,认为可 以通过母血中的胎儿粒细胞进行性别诊断.但胎儿粒细胞 和母血粒细胞不易识别,也很少作为研究对象.目前有关胎 儿粒细胞在产前诊断中应用的研究较少. (4)胎儿有核红细胞:目前国内外学者的研究集中在胎 儿有核红细胞上并一致认为胎儿有核红细胞是最佳的靶细 胞.其主要原因有:1)胎儿有核红细胞含有完整的基因组 DNA,能用于胎儿遗传性疾病的分析.2)胎儿有核红细胞 生命周期短,约90天.产后在孕妇外周血中很快消失,用于 产前诊断时不受上次妊娠的干扰.3)有核红细胞(nucleated redbloodcell,NRBC)在正常成人外周血中较罕见,因而孕 妇血中的有核红细胞绝大多数是胎儿细胞.4)胎儿有核红 细胞在胎儿血液循环中比例较高.5)有核红细胞表面抗原 相对稳定,易于识别. 2.胎儿有核红细胞表面相对特异性的标记 (1)CD36即血栓敏感素(thrombospondin)受体,在孕早 期表达于胎儿有核红细胞表面,为红细胞早期分化标志J. (2)CD71即转铁蛋白受体(TfR),它存在于早期红细胞 以及单核细胞和激活的淋巴细胞的细胞膜上,但不存在成熟 的红细胞上.CD71虽为最常用的单克隆抗体,但母血细胞 也表达CD71,因而影响FISH结果J. (3)GPA即血型糖蛋白A(glycophorinA),是一种红细 胞系特异性唾液糖蛋白,不存在于白细胞上,作为阳性筛选 可以识别中,晚幼RBC,但可引起靶细胞凝集而影响分离效 果.抗转铁蛋白抗体CD71和抗GPA抗体是在磁激活细胞 分选法(MACS)法中最常用的单克隆抗体,它们随孕周而增 高,在胎儿NRBC上高度表达,最适宜于分离胎儿细胞之用. MACS法的磁珠小,能很好维持NRBC原来形态,便于作 FISH. (4)Zheng等还研究了2—6B/6,FB3—2,H3—3,CD36 等,这些标志物表达率也随孕周逐渐增高,FB3—2在早孕胎 儿细胞上有高度表达,与母亲非有核细胞交叉反应率低,利 用其单克隆抗体,理论上是较为理想的. (5)FernandezA等研究了2F6.3单克隆抗体在胎儿核 红细胞上的表达检出率远远高于CD71单克隆抗体在胎儿核 红细胞上的表达.Hengstsehlager等发现细胞内DNA前体 途径酶即腺苷嘧啶核苷激酶可能成为识别胎儿细胞的新标 志.目前用于识别胎儿细胞的标志还有胸腺嘧啶核苷激酶 和2,3二磷酸甘油酸(BPG)等. ? 8?中国优生与遗传杂志2006年第l4卷第6期 (6)一珠蛋白主要存在于胎儿血红蛋白(HbF)中(成 人血红蛋白中少于I%),于孕6周出现.虽然妊娠可以刺激 母体合成少量的HbF,但胎儿NRBC中一珠蛋白含量要多 得多.有研究表明83%,100%的一珠蛋白阳性的细胞为 胎儿NRBC,其细胞分离纯度可达45%. 3.母血中胎儿NRBC的分离与富集技术 在孕妇外周血中胎儿NRBC数量甚微.怎样将如此微 量的胎儿NRBC有效分离出来进行产前诊断分析是研究者 不可回避的一个重要问题,目前较常用的分离纯化FNRBC 的方法如下. (1)密度梯度离心法(densi~gradientcentrifuge) Ficoll—Hypaque梯度离心法Ficoll—Hypaque是聚蔗糖 和三碘化合物泛影葡胺按一定比例混合的细胞分离液,常用 于分离不同密度的细胞,特别是淋巴细胞. Percoll连续密度梯度离心法Percoll是包被聚乙烯吡咯 烷酮(PVP)硅胶颗粒,在溶液中性质稳定.高速离心时,可 形成连续密度梯度.加入细胞悬液低离心力时,可致不同密 度的细胞悬浮于与它们相等的密度层界面上. 密度梯度离心法操作较简单,细胞丢失少.细胞形态完 整,若改进方法,如采用多重密度梯度离心使样品检出率提 高,可能更具有优越性. (2)流式细胞技术(flowcytometry)和荧光激活细胞分选 法(fluorescence—activatedcellsorting,FACS)原理是通过流式 细胞仪测定流动着的细胞悬液中单个细胞所发出的散射光和 荧光等多种参数,然后通过细胞分选器将特定的细胞从整个 细胞群体中分离出来.乌晋芳等用GPA为识别标志对5 例l2—4o周的孕妇外周血进行密度梯度离心,并经流式细胞 仪分析,然后做遗传学分析,得到胎儿性别符合率为100%. 这种方法的富集纯度高,但价格昂贵,操作步骤较复杂,可导 致细胞的丢失,影响细胞的形态,而且以细胞的抗原抗体反应 为基础进行分选,增加了母体非特异性结合的可能. (3)磁激活细胞分选法(magnetically—activatedcellsot— ting,MACS)此方法是1992年Ganshirt—Ahlert建立的.其 原理为用结合磁性微粒的单克隆抗体标记细胞,在外加磁场 的作用下,磁激活细胞分选器可将样.品中带磁与不带磁的细 胞分开,以达到分离纯化的目的.依据细胞表面抗原不同. 磁激活细胞分选法可分为两种:阳性选择,直接根据NRBC 表面或胞内特异性抗原的单抗分离之,此种方法很少单独使 用:阴性选择,通过标记NRBC以外的抗原,从而分离出污染 的或需去除的细胞,留下所需要的纯化细胞.Busch等报道 了双MACS法即先用携带磁性微粒的CD45和CD12单抗作 标记,行阴性选择除去母体血中自细胞,再用带磁性微粒的 CDT1单抗作阳性选择富集胎儿NRBCs分离效果极佳.此 法简便,省时,而且可在短时间内分离大量及多个样品,但分 离效率不及FACS. (4)电荷流分离法(chargeflowseparation,cFs)这是近 年来发展起来的一种较新的方法,它可以区分不同的细胞类 型.其基本原理为利用细胞表面的电荷不同,在电场力的作 用下有不同的迁移速度而达到分离细胞的目的.1998年 Waehtel等首先应用此法16例孕妇外周血样进行初步分 离,发现每20TrIl血样中平均有2000个有核红细胞,均经与 染色体的荧光原位杂交(FISH)证实,此法优点:分离迅速,被 分离的细胞有活性,分离过程不需要抗体,但有报道表明通 过CFS分离的NRBC30%是胎儿的,因此欲得到纯的胎儿细 胞,还需与其他方法合用. (5)显微操作分离法日本学者Takabayashi在显微镜下 先从形态学上识别NRBC,并用微操作器将其逐个挑选出,然 后进行聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)检测, 产前预测胎儿性别准确率达99%.邹丽等研究表明:用 不连续密度梯度离心法富集胎儿有核红细胞,将分离后的细 胞制成涂片,用May—Giemsa复合染色法染色,光学显微镜 下识别并进行计数.然后用显微操作器将之获取,一2O 中保存备用,如此获取足够数量的有核红细胞.此方法的优 点显而易见,它不仅可获得的单个胎儿NRBC从而掌握全部 的遗传信急,而且更满足了单基因疾病诊断所需纯化细胞的 要求. 4.国内外学者用FNRBC作为产前诊断的现状 (1)预测胎儿性别 应用PCR和FISH方法,通过检测x或Y染色体特异序 列,可准确判断胎儿性别.其引物多种多样,检测结果也不 尽相同.1989年,IJ0等应用孕妇外周血胎儿细胞Y染色体 进行PCR分析,预测胎儿性别.1995年马旭等应用SRY基 因对大部分孕妇外周血中多核细胞及单个核细胞进行PCR 扩增,结果为阳性,与胎儿实际性别符合率分别为80.O%和 93.7%.国内徐可树,刘丽英等学者应用PCR和FISH方法 来判断胎儿性别的准确率较高. (2)预测Rh血型 多数情况下,Rh(D)阴性源于1号染色体Rh(D)基因缺 失,若从Rh阴性血液中检出Rh(D)基因,则提示胎儿Rh血 型阳性.1993年,lJoL】用PCR技术诊断9例胎儿Rh(D)基 因型.1996年,Geifman—Holtzman采用FACS法从Rh阴性 孕妇外周血分选到的FNRBC进行Rh位点的PCR扩增,预 测胎儿的Rh血型特异性和敏感性分别为100%和84%.国 内学者用孕妇血中的FNRBC预测Rh血型研究的较少. (3)基因水平上的遗传分析 单基因遗传病的诊断主要用PCR方法.1990年,Cam— asehella等首次应用PCR法从孕妇外周血中扩增父源性 血红蛋白I~pore基因特异性DNA,正确诊断2例胎儿血红 蛋白病.1998年Watanabe成功地用单个NRBC首次对有鸟 氨酸氨甲酰基转移酶缺陷的胎儿进行了产前诊断,显示出9 号染色体的一个位点突变.目前应用最多是在基因水平上 用PCR技术研究胎儿Rh血型,杜氏肌营养不良,HLA多态 性以及13一地中海贫血等.国内众多学者从母血中分离 FNRBC,用PCR方法进行性别检测,杜氏肌营养不良的基因 诊断.王陶然等从273例母血标本中分离胎儿有核红细 胞,并应用引物延伸预扩增(primerextensionpreamplification, PEP)和PCR方法检测巨细胞病毒(humancytomegalovirus. HCMV)的基因片段,以建立这种新的无创性产前诊断巨细 胞病毒宫内感染的方法.结果表明该方法的敏感性为 95.12%,特异性为100%,符合率为99.27%,是较为理想的 诊断方法. (4)染色体水平上的遗传学分析 中国优生与遗传杂志2006年第14卷第6期?9? 1991年Price等首次应用l8号染色体特异性探针对 母血中的胎儿细胞进行检测,诊断出1例l8三体胎儿,1992 年Bianchi等也用FISH技术从母血NRBC中成功地诊断出 21三体胎儿.1995年,Bischoff用FISH技术诊断1例46, XY/47,XXY.1998年,Oosterwijk等第一次用无创性的方法 诊断13三体胎儿,他们用Ficoll密度梯度离心法富集胎儿 NRBCs,然后用13染色体探针进行杂交分析,发现有48% NRBCs显示出三个13染色体的杂交信号.国内学者用13, l8,2l,x,Y染色体探针,已可对胎儿非整倍体染色体病进行 产前诊断,且准确率较高. (5)妊娠病理状态的分析 在某些病理妊娠状态下,如发热,缺氧,妊娠高血压综合 征,早产等,母血中有核红细胞数量明显增加.在非整倍体 胎儿的妊娠时有更多的胎儿有核红细胞渗透到母血循环中 去.母血中胎儿有核红细胞的数量可作为反映胎儿状态,母 体状态以及胎盘功能状态的一个指标.邹丽等报道在孕 早期,当孕妇外周血中NRBC数量超过正常范围时,可以作 为预测妊高征,先兆子痫病人的一项辅助指标;孕中,晚期, 孕妇外周血中NRBC计数可以衡量妊高征病情严重程度. 将母体外周血NRBC计数用于妊高征的临床监测有其不可 代替的优势. S.问题与展望 孕妇外周血胎儿细胞的发现为无创伤性产前诊断的建 立提供了一个新的发展前景.特别是胎儿NRBC已成为国 内外产前遗传性疾病研究热点,其基础研究已取得很大进 展,临床应用研究也取得了初步成功,但仍存在一些问题, 如:尚不明确影响胎儿细胞胎母间转移的因素及各因素影响 的程度;胎儿有核红细胞分离和富集过程中细胞的形态损 伤,母血污染,操作复杂,费用昂贵等问题.今后有望在以下 方面得到发展:1)逐步完善单个细胞水平的分离技术及基 因诊断技术,从而对更多遗传性状和遗传病作遗传分析.2) 寻找胎儿NRBC胞质内或核内专一性标记,以便在流式细胞 仪上直接识别,富集高纯度的胎儿NRBC.3)发展一种简 单,经济的分选技术.相信随着上述问题的解决,分子生物 学技术的发展,利用孕妇外周血中的FNRBC进行非损伤性 产前诊断必将代替传统的损伤性产前诊断技术. 参考文献 [1]SchmorlG.UberdosSehicksalembolischversehleppter[J].Pla— centarr~llenZentralblGynakol,1950,29:129. [2]BianchiDW,ZickwoffGK,WeilGJ,eta1.Malefetalprogenitor cellspersistinmaternalbloodforaslongas27yearspostpartum[J]. ProcNailAcadSciUSA,1996,93:705—708. [3]唐爱兰,张学,刘国仰,等.孕妇外周血中的胎儿有核红细胞在非 损伤性产前诊断中的研究进展[J].国外医学遗传学分册,2004, 27(2):81—84. 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