海岛棉抗枯萎病性的遗传分析及遗传连锁图谱加密（可编辑）

海岛棉抗枯萎病性的遗传分析及遗传连锁图谱加密（可编辑） 分类号: S332.2 学校代码: 10758 密 级: 公开 学 号: 09020048硕 士学位 论文 海岛棉抗枯萎病性的遗传分析及 遗传 连锁 图谱加密 Genetic Analysis of Sea Island Cotton Resistance to Cotton Fusarium Wilts and Linkage Map Encryption研究生姓名 陈磊 导 师 姓 名 及 职 称 曲延英 教授 合 作 导 师 姓 名 及 职 称 陈全家 教授 学位门类级别 农 学 硕士 专业名称 作物遗传育种 研究方向 棉 花 分子 育种 所在学院 农学院 新疆?乌 鲁木齐 二? 一二 年 六月 独 创 性 声 明 本 人 声 明 所 呈 交 的 论 文 是 我 个 人 在 导 师 指 导 下 进 行 的 研 究 工 作 及 取 得 的 研 究 成 果 。 尽 我 所 知 , 除 了 文 中 特 别 加 以 标 注 和 致 谢 的 地 方 外 , 论 文 中 不 包 含 其 他 人 已 经 发 表 或 撰 写 过 的 研 究 成 果 , 也 不 包 含 为 获 得 新 疆 农 业 大 学 或 其 他 教 育 单 位 的 学 位 或 证 书 而 使 用 过 的 材 料 。 与 我 一 同 工 作 的 同 志 对 本研究所 做的任何 贡献均已 在论文中 作了明确 的说明并 表示了谢 意。 研究生签 名: 时间:年 月 日关于学位论文使用授权的说明 本 人 完 全 了 解 新 疆 农 业 大 学 有 关 保 留 、 使 用 学 位 论 文 的 规 定 , 即 : 新 疆 农 业 大 学 有 权 保 留 并 向 国 家 有 关 部 门 或 机 构 送 交 论 文 的 复 印 件 和 电 子 文 档 , 可 以 采 用 影 印 、 缩 印 或 扫 描 等 复 制 手 段 保 存 、 汇 编 学 位 论 文 , 允 许 论 文 被 查 阅 和 借 阅 。 本 人 授 权 新 疆 农 业 大 学 将 学 位 论 文 的 全 部 或 部 分 内 容 编 入有关数 据库进行 检索,可 以公布( 包括刊登 )论文的 全部或部 分内容。 (保密的 学位论文 在解密后 应遵守此 )研究生签 名: 时间 :年 月 日 导 师签名: 时间 :年 月 日 海 岛 棉抗 枯 萎病 性 的遗 传 分析 及 遗传 连 锁图 谱 加密 摘 要 发 展 高 密 度的 遗 传 连 锁图 谱 对 于 棉花 这 种 重 要的 经 济 作 物而 言 具 有 重要 的 意 义 。本 试 验 就 是在 课题组前期构建的遗传图谱以及借助 F 田间抗病性调查进行抗病 QTL 初步定位的基础上 ,继续探 2 索 海 岛 棉 枯萎 病 的 抗 性遗 传 , 增 加标 记 以 期 实现 遗 传 图 谱的 加 密 , 并在 加 密 的 图谱 上 结 合 田间 的 后 续世代的田间病情调查 ,进行抗病性 QTL 重定位。本试验的研究主要包括以下几个方面 : 1 . 以海岛棉抗病材料 06-146 和海岛棉 感 病材料新海 14 的杂交 群体, 考察该群体的亲本,F 以 1 及 F2~F 代 , 借助显著性分析得到了 海岛棉枯萎病病害对农艺性状和产量的影响, 结果显示, 随着 2:5 海岛棉 枯 萎病 病 级 的 增加 , 株 高 、果 枝 数 等 农艺 性 状 有 减少 的 趋 势 ,并且与 反应产 量 相 关 的指 标 有 明显的下降趋势。 反映了海岛棉枯萎病的致萎缩 、减产的危害。 2 . 运用相关 性和主成分分析, 得到了影响 海岛棉产量因素的相关性以及在 海岛棉增产中所起的 作 用 。 结 果显 示 海岛棉产 量 与 单 株成 铃 数 和 单铃 重 呈 显 著的 正 相 关 ,同 时 显 示 海岛 棉 产量与海岛棉 枯 萎 病 病 级呈 显 著 的 负相 关 , 而 且枯 萎 病 病 级还 与 那 些 与 海岛 棉 产 量呈 正 相 关 的指 标 比 如 果枝 数 和 株高呈负相关,也 反应出,枯萎病对海岛棉 具有减产的作用。 3 . 遗传力分 析得出单株成铃数和单铃重的遗传力低, 适宜在后期世代中选择, 枯萎病的遗传力 中等 ,适宜在中后期世代选择。 4 . 运用365 对引物, 对亲本进行筛选, 共得到157 对多态性 引物, 对F 群体遗传连锁图谱构建整 2 合, 构建了一个 全长为872 cM , 包含 的标记数为67 个, 平均遗传距离为13 cM 的图谱。 覆盖海岛棉基 因组9 条染色 体, 较之之前的遗传图谱 , 其中的3 、5 、8 、12 、16 、18 、25 、26 号染色 体被再次定位 , 验证了之前结果的 可靠性。 另外的1 号未被定位出, 新定位20 号染色体。 每条染色体上的连锁群数发 生一定的变化。26 号染 色体由之前的一个连锁群, 增加到2 个。16 号染 色体由原来的一个连锁群增加 到两个,两个连锁群的标记数也与之前定位到16 号染色体上 的标记一致。 5 .利用 WinQTLCartV 2.0 软件,采用复合区间作图法进行抗病性 QTL 定位,LOD 值为 2.5 , 共检测到 8 个可能的 QTLs , 分别位于 LG1 (Chr.16 ) 、LG5 (Chr.26 ) 、LG8 (Chr.3 ) 、 LG10 (Chr.8 ) 、 LG11 (Chr.12 ) 。 定位在 3 号染色体上 的 种植在阿拉尔的 F 群 体成株期的贡献率为 10.88% , 定位 2:5 I 在 16 号染色 体上的阿拉尔 F 剖杆和 库尔勒 F 成 株, 贡献率分别 为 :21.73% 、20.25% , 定位在 26 2:5 2:4 号染色体上的库尔勒 F 剖杆贡献率 为 69.01% , 定位在 8 号染色体上的库尔勒 F 剖杆贡献率为 2:4 2:4 67.53% , 定 位在 12 号染 色体上的库尔勒 F 剖杆 、 库尔勒 F 成株和剖杆, 贡献率分别为 :61.42% 、 2:4 2:5 61.42% 和 34.33% 。由表 4-2 可知 qFw4 、qFw5 、qFw6 、qFw7 是 主效基因。由于其加性效应值均为 负值,说明其增效等位基 因来自抗病亲本,因而在分子标记辅助育种中具有利用价值。 关键词 :海 岛棉; 枯萎病;遗传分析;连锁图谱;加密 IIGenetic Analysis of Sea Island Cotton Resistance to Cotton Fusarium wilt and Linkage Map Encryption Abstract The building of the high density of genetic linkage map was of great significance for cotton which was an important economic crop.This study was carried out under the result that the construction of genetic map and the preliminary QTL positioning by disease resistance investigation in the field with F population.In 2 the study,the resistance inheritance of sea island cotton fusarium wilt was studied intensively.What’s more,more markers were used to encrypt the gentic linkage map and further to posite the disease resistance QTL newly by way of the disease resistance survey in the field in later populations on the new encrypted map.The following aspects were mainly included in this research 1.The hybrid group of the disease-resistant sea island cotton 06-146 and the feeling sick sea island cotton xinhai14 was studied to investigate the parents and the descendant of F and F to F .The effect of cotton 1 2 2:5 fusarium wilt on the agronomic character and yield was achieved by significance test.The result showed that the agronomic character of the plant height and branch number was decreased with the increase of the grade of cotton fusarium wilt.Also,the same trend was showed on the index of yield.It also reflected that the fusarium wilt of cotton caused atrophy and the reduction of output2.The correlation of the yield factor and the role playing in the cotton production was achieved by correlation and principal component analysis.The result showed that the yield of cotton had significant positive correlation with the number of the cotton boll and the weight per plant.Also,the significant negative correlation was showed between the yield and the degree of cotton fusarium wilt.What’s more, the significant negative correlation was showed between the index that had significant positive correlation with the yield,the number of the cotton boll and the plant height.This also reflected that crop failure of cotton caused by the cotton fusarium wilt3. The low heritability of the cotton boll and the weight per plant was showed by the heritability analysis.It was better to select on the later descent. Also, the heritability of pathography was low and it was suitable for the later descent selectionIII 4.365 pairs of premiers were used to screen in the parents,and 157 pairs of them were gained.And then they were used to screen in its F descent in order to construct linkage map.And then a map was 2 constructed.it had a distance of 872 cM,with 67 markers,a 13 cM mean genetic distance.The map covered the nine chromosomes of the cotton genome.Also the chromosome of 3,5,8,12,16,18,25,26 were sited again relative to the previous map.It also confirmed that the correctness of the previous result.The Chr.1 was not gained,while the Chr.20 was newly sited.The number of linkage group on each chromosome had changed.Such as,the linkage group was one on the foregone map but two in the new one.Also the same in the chromosome 16,furthermore,they had the same markers5. Eight feasible QTLs were detected on the resistance QTL positioning with the software WinQTLCart V 2.0 by the composite interval mapping method,with the value of LOD 2.5.They were sited on the chromosome of 3,8,12,16,26 ,respectively.The contribution rate of the QTL sited on the chromosome 3 using the F population on the heading stage in Alaer was 10.88%,and the value sited on chromosome 16 2:5 using the F population on the period of dry period profile in Alaer and the heading stage in Korla was 2:5 21.73% 、 20.25%,respectively.The contribution rate of the QTL sited on the chromosome 26 and 8 using the F population on the dry period profile in Korla was 69.01% and 67.53%,respectively.The value of the 2:4 QTLs sited on the chromosome 12,using the F in Korla on the period of dry period profile and F in 2:4 2:5 Korla on the period of heading stage and dry period profile were 61.42%,61.42% and 34.33% individually.The QTLs of qFw4,qFw5,qFw6,qFw7 were the major gene according to the table 4-2.The value of the additive effect of them were negative value.This also illustrated that the synergia allelic genes were come from disease-resistant parents.So the four QTLs had great value in use in molecular marker-assisted breeding Key words: sea island cotton ; fusarium wilt ; genetic analysis ;encryption IV缩 略 词 Abbreviations 缩略词 英文全称 中文释义 MAS Marker Assisted Selection 分子标记辅助选择 SRAP Sequence Related Amplimed Polymerase 相关序列扩增多态性 RGA Resistance Gene Analog 抗病基因类似物 SSR Simple Sequence Repeats 简单序列重复 β-ME Mercaptoethanol β- 巯基乙醇 CTAB Cetyl Triethyl Ammonium Bromide 十六烷基三甲基溴化胺 ddH O Double Distilled Water 双蒸水 2 EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸 SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠 Tris Trishydroxymethylamino Methane 三羟甲基氨基甲烷 PVP40 Polyvinylpyrrolidone 聚乙烯聚吡咯烷酮-40 TEMED N , N , N’ , N’-Tetramethylene Diamine N ,N ,N’ ,N’- 四 甲基乙 二胺 Acr Acrylamid 丙烯酰胺 APS Ammonium Persulfate 过硫酸铵 bp Base Pair 碱基对 Kb Kilo base pair 千碱基对 BSA Bulked Segregant Analysis 集团分离分析法 cM Centi-Morgan (s ) 厘摩 CIM Composing Interval Mapping 复合区间作图法 DH Doubled Haploid Lines 单倍体加倍系 LG Linkage Group 连锁群 LOD Logarithms of Odds Ratio 似然比对数 QTLs Quantitative Rait Locus 数量性状基因座 V 目 录 第 1 章 绪论. 1 1.1 棉花枯 萎病研究进展2 1.1.1 棉花枯萎病的分布与危害2 1.1.2 棉花枯萎病菌生理小种以及枯萎病的症状类型3 1.1.3 棉花枯萎病的致病机理. 4 1.1.4 棉花对枯萎病的抗性机理5 1.1.5 棉花抗枯萎病性状遗传规律 6 1.2 棉花分 子标记的研究6 1.2.1 棉花分子标记类型7 1.3 棉花遗 传连锁图谱构建. 8 1.3.1 海陆种间遗传连锁图谱. 8 1.3.2 陆地棉种内遗传连锁图谱9 1.3.3 海岛棉种内遗传连锁图谱9 1.4 棉花 QTL 定位研究10 1.4.1 QTL 定位原理 10 1.4.2 QTL 定位的主要 10 1.4.3 棉花主要性状QTL 定位 11 1.5 新疆海 岛棉育种现状以及抗病育种展望. 12 1.5.1 育种现状 12 1.5.2 抗病育种展望13 1.6 本研究 的目的与意义 13 第 2 章 海 岛棉枯萎 病抗性遗 传分析. 15 2.1 试验材 料与方法15 2.1.1 试验材料 15 2.1.2 方法. 15 2.2 结果与 分析. 16 2.2.1 田间性状表现16 2.2.2 海岛棉枯萎病病害对农艺性状的影响 17 2.2.3 海岛棉枯萎病病害对产量指标性状的影响18 2.2.4 海岛棉产量性状的相关分析和主成分分析18 2.3 讨论. 21 2.3.1 海岛棉抗枯萎病性能力 21 2.3.2 海岛棉抗枯萎病性遗传力. 21VI2.3.3 海岛棉抗病性与产量的关 系21 2.3.4 海岛棉抗枯萎病性育种的选择策略22 2.4 结论. 22 第 3 章 海 海杂交枯 萎病遗传 图谱的加 密. 24 3.1 材料与 方法. 24 3.1.1 试验材料 24 3.1.2 试验方法 25 3.2 结果与 分析. 30 3.2.1 杂交亲本抗病性分析30 3.2.2 遗传连锁图谱构建. 30 3.3 讨论. 37 3.3.1 遗传图谱构建中标记的影响因素. 37 3.3.2 偏分离对于遗传连锁图谱构建的影响 39 3.4 结论. 40 3.4.1 连锁图谱构建40 3.4.2 标记类型和多态性引物筛选标准对连锁图谱构建的影响40 第 4 章 遗 传图谱加 密效果的 应用-QTL 的重 定位 42 4.1 试验材 料与方法42 4.1.1 试验材料 42 4.1.2 试验方法 42 4.2 结果与 分析. 43 4.3 海岛棉 枯萎病基因间遗传连锁分析的验证 BSA 法. 45 4.3.1 抗、感基因池的建立46 4.3.2 抗、感池多态性引物筛选. 46 4.3.3 遗传的连锁分析 47 4.4 讨论. 47 4.4.1 定位结果比较47 4.4.2 QTL 定位的影响因素 48 4.4.3 QTL 定位在育种上的应用50 4.5 结论. 50 第 5 章 全 文结论52 附录54 VII 参 考文献. 58 致谢64 作 者简介. 66VIII 新 疆 农 业 大 学 硕 士 学 位 论 文 第 1 章 绪论 海岛棉原产于南美洲、 中美洲及加勒比海诸岛, 因 曾 大 量 分 布 于 美国 东 南 沿 海 及 其 附 近 岛 屿 , 故 称 海 岛 棉 。 近 年 来 有 一 些 以 海 岛 棉 为 父 本 、 陆 地 棉 为 母 本 的 杂 交 品 种 , 纤 维 较 长 , 但 细 度 、 强 度 达 不 到 海 岛 棉 指 标 , 俗 称 陆 地 海 岛 棉 。 海 岛棉纤 维 [1] 具有长、细、强等突出特点,在栽培种中品质最优,其产品的经济价值很高 ,是纺 织 高支精梳纱和特种织物不可缺少的原料 。同时海岛棉生产对于提高我国纺织产品档次 , 增强行业竞争力发挥了重要作用。 [2] 新疆目前是我国惟一的海岛棉产区。 据孔庆平 报道自引种成功以来,新疆海岛 棉 自育出了许多综合性状较为优良的海岛棉新品种 , 形成了具有区域生态特 点的育种技术 体系 ,为新疆海岛棉生产发展发挥了重要作用。在生产上 ,经历了成长、萎缩与停滞、 [3] 2 徘徊与发展这样曲折的历程 。 近几年 , 新疆海岛棉种植面积每年基本稳定在 6617 khm 2 左右,单产皮棉 1350 kg/hm 左右 ,较 20 世纪 80~90 年代提高了 50% 。 新疆棉花产业是新疆国民经济的支柱产业, 棉花在新疆总的农作物的种植面积所占 份额中, 近年来呈现连续增长态势,1995~2010年间从14.61% 增加到了30.69% , 增长了 一倍多。 棉花在新疆种植的区域主要集中在南疆的阿克苏地区, 其次是喀什 、 巴州、 吐 鲁番地区, 以及东疆的哈密地区, 北疆的伊犁 、 塔城、 昌吉、 博尔塔拉 、 石河子都有种 植。 海岛棉 方面主要集中在南疆的阿克苏地区,尤其是阿瓦提县,种植面积达到56.97 2 khm ( 参照2010 年 数 据 ) , 其 次 是 北 疆 的 察 布 查 尔 县 , 霍 城 县 以 及 塔 城 地 区 的 托 里 县 都 2 有零星种植。2010年新疆的棉花种植面积达到了1460.6 khm , 其中 海 岛棉 的种植面积达 2 到了96.79 khm 。1978到2010年间经历了逐年增长后又趋于稳定,其中2006~2008年 种 2 2 植面积达到了历史新高,维持在1600 khm 。 后两年略有下降 ,达到1400 khm 左右。其 2 中 海岛棉的种植面积也是在2006~2008 年间达到了历史新高, 达到100 khm 以上, 其他 2 2[4-5] 时间 均在100 khm 以下 ,其中1995 年种植最低,达到8.35 khm 。近年来棉花单产也 2 2 是屡创新高,其中2010年自治区地方为2515.5 kg/hm ,兵团的更是达到了3465 kg/hm , 2 2[6] 新疆整 体平均水平2545.5 kg/hm 。 全国平均水平为1843.5 kg/hm 。新疆的单产比全国 平均水 平 高 出3 成 。 新 疆 海 岛 棉 作 为 全 国 唯 一 的 海 岛 棉 产 区 , 海 岛 棉 的 发 展 趋 势 更 是 备 1海 岛 棉 抗 枯 萎 病 性 的 遗 传 分 析 及 遗 传 连 锁 图 谱 加 密 受关注。 随着新疆棉花种植面积的扩大,各棉区常年连作,各种病虫害有逐年加剧的趋势, 特别是落叶型枯萎病迅速蔓延 , 新疆 海岛棉产区80% 以上的棉田都存在因枯萎病危害而 减产的问题 , 其中有15% 的棉田为重病田, 还出现绝产绝收的情况, 而生产中又急需长 势稳健、 抗性好、 适应性强的海岛棉品种。 再者 , 新疆目前育成的海岛棉品种均不抗 棉 铃虫, 有部分年份出现棉铃虫大发生而影响了新疆海岛棉生产的发展 , 同时蚜虫、 红蜘 蛛等害虫为害严重 , 也对生产构成重大威胁, 因此, 开展分 子生物学研究 , 培育抗病 虫 [7] 品种已成为新疆海岛棉育种的核心内容 。 作物基因组研究, 包括基因或数量性状位点 (QTL ) 定位 、 图位克隆以及物理图谱 [8] 构建等,首先必须建立具有丰富标记信息的高密度遗传连锁图谱 。较高密度的分子 图 谱已有效的应用于数量性状基因定位、 图位克隆等研究中。 然而与水稻、 番茄、 玉米等 其它作物相比 ,棉花遗传连锁图谱的构建 由于棉花中高质量 DNA 的快速提取技术不成 熟, 加上 DNA 标记多 态性低 , 更 重要的是 基因组大而复杂等原因而造成研究比较滞后 。 [9] 从而造成棉花遗传图谱饱和度低 。对于棉花这种具有重要经济价值的农作物来说,构 [10] 建 高密度的遗传连锁图谱有重大意义 。为了 适应需要,周斌等利用 SSR 标 记对大豆 [11] 重 组 自 交 系群 体 NJRIKY 遗传图谱进行了加密并进行了应用效果的分析。李艳秋等 利用 SSR ,EST-SSR 标记对小麦品种 “京花 1 号/ 小白冬麦” 的双单倍体 (DH ) 群体 和 “ 农大 015/ 复壮 30”的重组自交系 (RIL )群体为作图群体,进行了遗传图谱的加密。 [12] 齐靖等 利用 AFLP ,RAPD 标记 完成了对枣高密度遗传图谱的构建与树干直径的 QTL [13] 分析。 辛翠花等 利用 AFLP 标记 对桃遗传连锁图谱进行了加密并对 加密前后连锁图作 了比较分析。 1.1 棉 花 枯 萎 病 研 究 进 展 1.1.1 棉 花 枯 萎 病 的 分布 与 危 害 棉花枯萎病是棉花生长过程中全球性的危险性病害, 是棉花病害防治的一大技术难 题, 对棉花生产造成严重危险 。 Atkinson1891 年在美国亚拉巴马州首次报道棉花枯萎病 , 2 新 疆 农 业 大 学 硕 士 学 位 论 文 随后很快就在其他几个州发现,后来发展到整个棉花带。到 21 世纪初,棉花枯萎病发 [14] 病地区已遍及亚洲、 非洲、 北美、 南美及欧洲等地, 几乎已遍及世界各植棉国家 。 我 国于 1931 年冯肇传首先在华北地区发现该病 ,现已扩展到东北、西北、黄河流域和长 江流域的 20 个省、自治区、直辖市 ,其中以陕西、四川、江苏、云南、山西、山东、 河南等省为害严重。 除江西、 浙江等少数地区为纯枯萎病区, 多数地区为枯萎病和黄萎 病混发区。 该病具毁灭性, 一旦发生很难根治。 重病株于苗期或蕾铃期枯死, 轻病株 发 育迟缓,结铃少,吐絮不畅,纤维品质和产量均下降。 新疆位于欧亚大陆腹地, 植棉历史悠久, 是中国古老的植棉区之一。 新疆棉区枯萎 病始发于1963年莎车县农科所的个别棉田,1979年基本上控制在5 ~6个植棉县的少数田 2 块。80年代 以后, 枯萎 病扩展蔓延十分迅速,1983年枯萎病田面积为4000 hm 。1986年, 农 一 师 三 团 大 面 积 棉 田 因 枯 萎 病 而 绝 产 。 据 自 治 区 植 保 站1991 年 调 查 统 计 , 枯 萎 病 在7 个地 (州)的25个植棉县,129个乡, 兵团的一、 三、 七 、 八共4个师的20多个团场发病 , 2 2 2 发病面积7280 hm , 其 中重病田1304.5 hm , 毁种55.3 hm 。 由于从 疫区调种引种, 导致 枯萎病在北疆棉区在80年代末至90 年代, 每年以几倍甚至几十倍的速度传播。 枯萎病的 发 病 面 积 在 北 疆 部 分 团 场 到1996 年 在 团 场 总 的 棉 田 面 积 份 额 中 占 到 了5% , 团 场 下 的 个 别 连 队 枯 萎 病 田 的 发 病 更 是 达 到 了 当 地 棉 田 面 积 的 20 ~30% , 伴 随 有 大 片 枯 死 田 出 现 [15] 。据2010 年且末县农业技术推广站植保组对棉花的枯萎病发生测报 显示, 由于当年降 [16] 雨多,土壤湿度大,气温下降,造成棉株大面积青枯死亡,预计是发生偏重的年份 。 1.1.2 棉 花 枯 萎 病 菌 生理 小 种 以 及枯 萎 病 的 症状 类 型 棉花枯萎菌生理分化很大, 目前世界上已报道的仅 8 个小种, 美国的 Armstrong 等 最早于 1958 年报道有 4 个小种,1966 年 Ibrahim 发现 了 5 号小种,1978 年 Armstrong 和 //.strong 又在 巴西发现了 6 号小种。 [17] 1986 年开始,陈其英等 研 究发 现 我 国 的 棉 花 枯 萎病菌致病力与当时国际上 报 道 的 6 个小种有区别。为此,将我国的棉花枯萎病菌分为 3 个生理 小种,其中 7 号、8 号 小种是首次报道,7 号小种是我国的优势 生理小种,广泛分布于国内的各主产棉区。 棉 花 枯 萎 病 菌 能 在 棉 株 整 个 生 长 季 节 侵 染 危 害 。 在 自 然 病 田 , 棉 花 播 种1 个 月 左 右 3海 岛 棉 抗 枯 萎 病 性 的 遗 传 分 析 及 遗 传 连 锁 图 谱 加 密 即 可 观 察 到 发 病 病 株 , 在 重 病 田 发 病 比 轻 病 田 早 , 重 病 田 在 植 株 子 叶 期 或1 片 真 叶 期 即 可发病并造成死苗。 棉苗4~5片真叶期为发病高峰期。 棉花枯萎病危害虽有其自身的典 型症状, 但由于棉花品种抗病和感病特性不同, 棉株生育阶段和时期不同, 病原菌致病 力强弱不同以及其他环境因素的作 用影响, 又常表现出不同的症状类型, 因此棉花枯萎 病的症状较为复杂。常见的症状见表1-1。 表1-1 棉花枯萎病常见的症状类型及表现 Table1-1 Common symptoms type and performance of cotton fusarium wilt 症状类型 特点子叶期或者 1 片真叶期即 可发病 , 病苗从子叶或真叶边缘开始局部或全部 苗期 黄化型 变黄,最后叶片萎蔫,干枯脱落剖开茎部,维管束为深褐色。 子叶或者真叶, 病苗从叶缘或叶尖开始, 叶脉褪绿变成黄白色, 而叶肉仍 黄色网纹型 保持绿色, 呈现黄色网纹状斑块, 可扩大到整个叶片, 最后干枯脱落, 棉 苗死亡。叶柄,茎部维管束变成深褐色。 青枯型 病株苗期的子叶或者真叶突然失水, 变软下垂, 叶色稍显深绿, 最后病株 青枯干死,但叶片不脱落。剖开茎部,维管束变成深褐色 紫红型 病苗子叶或真叶部分或全部变成紫红型, 叶脉多呈现紫红色, 随着病情发 展,叶片枯萎脱落,棉苗死亡。茎部维管束变成深褐色。 皱缩型 棉株现蕾前后, 顶部叶片可能发生皱缩、 畸形, 叶片暗绿变厚, 棉株节间 缩短,病株比健株明显变矮,但不枯死。 成株期 症状表现颇不一致。常见的是枯萎病病株 矮缩。 混生急性 多在铃期发生, 在同一病株上表现有枯萎病和黄萎病两种症状; 病株发病 枯、黄 凋萎型 快,病势猛,叶片迅速脱落,植株死亡。 混生慢性 在同一棉株的苗期出现枯萎病症状, 症状呈现矮缩, 有些叶片呈现黄色网 萎病菌 凋萎型 纹。而至蕾铃期,又出现黄萎病症状,叶片呈黄色斑块。病程发展缓慢, 植株一般不会迅速枯死。 复合侵 病株低矮,高度只有 30 ~40cm ,上 部叶片皱缩,变厚,叶片浓绿,茎部 矮生枯萎型 节间变短,变粗,有时发生扭曲。 染症状 温室接种苗期症状 枯萎病症状简单, 发病时子叶或者真叶部分或者整 个叶片褪绿, 变软, 变 薄,病叶一般不脱落。 1.1.3 棉花 枯 萎 病 的 致病 机 理 对 于 棉 花 枯 萎 病 菌 致 病 机 理 , 存 在 两 种 学 说 :1 、 导 管 阻 塞 学 说 : 菌 丝 体 与 小 孢 子 的大量繁殖导致病株导管堵塞, 并使水分和养分输导受阻, 同时导管因为果胶物质被多 酚 氧 化 而 变 成 褐 色 。2 、 毒 素 学 说 : 叶 肉 细 胞 原 生 质 膜 的 透 性 被 病 菌 产 生 的 毒 素 破 坏 , 植株吸水变的非常难, 因为蒸腾作用丢失的水分没法得到有效的补充, 使植株 叶片褪绿 4 新 疆 农 业 大 学 硕 士 学 位 论 文 变黄。 棉花枯萎病菌是从根部侵染的病菌, 到目前为止, 认为枯萎病菌主要通过分泌毒 素和酶类完成侵染。 棉花枯萎病菌具有分泌镰刀菌酸的能力, 这 种物质对棉花就有使其 枯萎的作用。 但是在镰刀菌酸对棉枯萎病的发生以及发展的影响问题上, 近些年来研究 者研究结果不尽相同。 一部分学者 认为病原菌分泌的镰刀菌酸的数量的多少决定了致病 能力强弱, 另一部分学者 认为镰刀菌酸对于植物的病害蔓延并没有直接显著的影响, 病 [18] 原菌致病活性的大小与其分泌的镰刀菌酸数量并没有必然的关系。 仇元等 认为 不同菌 [19] 株的枯萎菌, 其培养所得的滤液的致枯萎能力存在相当程度的差异 ; 王纯利等 、 王贺 [20] 祥等 研究 认为镰刀菌酸是枯萎病菌分泌的一种非寄主性质的特异性致病类毒素, 而且 产量差异很大, 且与 致病活性大小无关。 国内外学者对棉花黄萎病菌的毒素化学成分进 [21] 行了深入研究。 吕金殿等 采用亲 和层析的方法来纯化毒素, 研究证实棉花黄萎病菌的 毒 素 , 其 起 作 用 的 成 分 是 一 种 酸 性 的 糖 蛋 白 , 蛋 白 质 和 糖 的 含 量 分 别 为 85.26% 和 14.74% , 并 得出病原菌毒素的糖蛋白是导致棉花黄萎病菌发病的关键因素。 总之, 导致 棉花发生萎蔫的因素很多, 应该综合考虑病原侵入棉花后, 病原、 寄 主、 环境三者之间 的复杂作用,不能把它看成单一的导管堵塞或病菌产生的毒素所致。 1.1.4 棉 花 对 枯 萎 病 的抗 性 机 理 植物抵御病原物的侵染,保卫自身,主要依 靠被动(即存)和主动(侵染后诱发) 保卫系统。 棉花即存的抗病性包括植物与病原菌接触以前存在的抗病因素, 有物理的 (组 织学) 和化学的 (抗菌化合物) 因素。 一般认为, 棉花对枯萎病的抗性是由于物理阻 碍 [22] 和化学抑菌作用所致。 但化学抑菌起主导作用。 吕学莲等 研究认为侵入后前期, 抗病 材料被侵入细胞中有细胞壁加厚现象 ; 侵入中期, 在越过了表皮层, 病菌开始侵入感病 材料薄壁组织, 然而仅仅只能侵入到抗病材料皮层组织 ; 侵入的后期, 大量寄主细胞的 降解物质或分泌物出现在了抗病材料中, 进而菌丝被包围, 病菌扩展得到抑制。 就抗侵 入, 抗扩展的能 力而言, 抗病材料比感病品种强很多。 棉花的诱导抗病性主要是植物受 到侵染后被激活, 形成的物理障碍能起到延缓真菌扩展的作用, 以便有时 间进一步激活 生理生化的保护机制。 用非致病菌诱导所引起的交互保护现象能够诱发棉株产生抗性物 质, 从而抑制枯萎菌的侵染。 此外由于棉花枯萎病是典型的土传病害, 枯萎菌生活在土 5海 岛 棉 抗 枯 萎 病 性 的 遗 传 分 析 及 遗 传 连 锁 图 谱 加 密 壤中, 由根部侵入, 因此寄主植物根分泌物及土壤微生物对枯萎菌的侵染会产生一定的 影响。 棉花抗枯萎病的机制比较复杂, 涉及的因素也较多。 除受抗性差异影响外, 还受病 菌毒力强弱和环境的影响,因此必须把这些因素综合起来,加以系统的研究 。 1.1.5 棉 花 抗 枯 萎 病 性状 遗 传 规 律 [23] 王振山 的 研究得出, 枯萎病的混合病圃中, 棉花枯萎病抗性受多对基因控制, 各 [24] 基因在其中所起的作用比较复杂 ; 任爱霞等 认为棉花抗枯萎病的特性可能是因为隐性 基因决定, 或者因为隐显各一个的主效基因和多个微效基因一起决定。 另 外 , 在棉花枯 萎病抗性基因型与环境互作方差检测中, 显示为显著 , 说明棉花枯萎病抗性受到环境因 [25] 素的较大影响。 此外 , 沈其益 研 究得出 , 棉花抗枯萎病性的遗传呈不完全显性, 由双 [26] 亲决定的;郑泗军等 分析 F 资料结果类似。但是,多年来的研究结果特别 是近几年 1 [27] 更倾向于陆地棉抗枯萎病性是受单个基因决定。 冯纯大等 的研究结 果认为陆地棉对 7 [28] 号 枯 萎 病 小 种 的 抗 性 呈 不 完 全 显 性 , 受 一 对 基 因 控 制 。 朱 永 军 等 研 究 认 为 海 岛 棉 HK237 对 枯萎病的抗性遗传受显性单基因控制,表现为质量性状的遗传规律。 1.2 棉 花 分 子 标 记 的 研 究 随着生物技术的发展, 所采用的遗传标记也在逐步深入, 从形态标记、 细胞学标记、 生化标记,直到 二十世纪 80 年代以来兴起的分子标记。分子标记 (molecular markers ) 首先是以 DNA 变异为 基础的的一种新型遗传标记类型。基因组 DNA 的变异导致分子 标记呈现遗传多态性。 分子标记原理就是借助核酸分子的杂交, 聚合酶链式 反应 (PCR ) , 或者是两者相结合的手段。 较之早期的形态学、 细胞学、 生化标记这些标记类型, 分子 [29-32] 标 记 具 备 无可 比 拟 的 应用 性 。 分 子 标 记 因其 存 在 形 式为 DNA , 不 因 为 组 织、 发 育 时期、 生长季节的不同而结果有异, 都可以检测; 多态性丰富、 信息量足; 不受外界 环 境以及其它各种因素影响, 不影响目标性状表达, 而且与不良性状也无必然的连锁。分 [33] 子标记的数量极为庞大, 可以覆盖一套基因组 。 同时也 可以反映因选择、 漂变、 突变 6 新 疆 农 业 大 学 硕 士 学 位 论 文 导致形成的变异类型。 大多数的 分子标记为共显性标记, 能够区分出基因型的纯合还是 [34] 杂合,并就此提供完整的遗传信息 。 1.2.1 棉 花 分 子 标 记 类型 1.2.1.1 SSR分子标记 SSR 为简单 序列重复, 是一类由几个核苷酸构成重复单元组成简短串联重复序列 , 其重复次数会因为物种、 品种、 甚至个体的不同而表现出 很大的差异 , 进而可以根据这 类重复两个边界的那些相对保守单拷贝序列来进行引物设计, 进而实现借助PCR 技术研 究串联重复单元数目差异性。1982 年,遗传研究在人类中首先发现SSR 的存在, 继而又 于1992年在大豆中得到验证。 借助PCR 扩增得 到的SSR 可 以用来作为植物分子标记。 1994 年 , 在拟南芥的植物遗传图谱构建中,SSR 得到了成功的应用。 在大量分子标记中,SSR 标记被认为是在棉花遗传连锁图谱的构建中最有效的标记, 这主要是源于以下几点: 首 先是SSRs 在棉花的基因组中分布广泛 。再者,该标记大多数为共显性,并有信息量高、 简单、 快捷的优点。 然后, 该标记为锚定标记, 进而可以整合不同的遗传图谱从而获 得 一张全面的遗传连锁图。 最后而且更重要的是像棉花这种 双子叶植物基因组序列, 其表 达序列标签 (ESTs ) 里面 (Saha 等,2003) 含有大量的以EST 为基 础公认 的高密度分子 标记图谱 (consensus maps ) , 是分析连锁群和比较QTL 的前提。 所以 ,SSR 的 分子标记 在不同的连锁图谱的整合、QTL 定 位, 进行进化相关的比较作图方面, 具有独特的应用 优势。 鉴于此, 可以看出棉花这样的大基因组生物更是适用这种标记 (Tani 等,2003) 。 1.2.1.2 EST-SSR分子标记 EST (expressed sequence tags ) 是 一段长大概为 150~400 bp 的基因表达序列。EST 技术就是将 mRNA 反转录成 cDNA ,然 后借助载体如质粒,噬菌体,在 cDNA 文库 构 建成 后,随机的大量的挑选单个 cDNA ,借 助一步法对 其 5’或 3 ’端测序,获得序列 后再与相关基因数据库中存在的已知序列分析比较, 进而可以获取有关生物体生长、 繁 [35] 殖 、 代 谢 、 发 育 、 衰 老 、 死 亡 等 一 整 套 的 生 理 生 化 过 程 的 认 识 技 术 。 根 据 建 立 SSR 标记中序列性质的不同,SSR 标记又有基因组 SSR (genomic SSR , 简称 gSSR ) 和表达 序列标签 SSR (expressed sequence tags SSR , 简称 EST-SSR ) 之分, 相 对于借助小片段 7海 岛 棉 抗 枯 萎 病 性 的 遗 传 分 析