应用固相核酸杂交检测口蹄疫病毒

应用固相核酸杂交检测口蹄疫病毒 拳试验省工省时,在一天内就能得出结累.煮沸能消睬尿液中可能干扰扩增的抑制 物.但PCR敏感性很高以致于通过简单的稀释就能排除高浓度尿液的抑制现象;本研究 使嗣的屎样贮存数月,贮存和冻融可能影响DNA的覆量,但这不蟛响扩增作用,该法 显着优于只能捡出活钩端螺旋体的培养方法. 依靠对靶DNAfl,~同源性和退火温岌做【物的退火效粜试验确定PCR试验的特异性. 退火温度增加能陵f物和靶DNA之闽产生很少钟错配现象,并将增加退火的特异性.随 着扩塔周期的增加.不需要品的合成讥会也随之增加.因此,袭们选择了很高的退火 温度(85,~C)和中等数量的扩增周期,根据基因组DNA的Souther~转印试验赛若, .Poloniea,istrlea,baleaJaiea,dikkeni和牛型暗勒焦呈现强烈扩增,而其它血清变 种扩增,程度低或不扩增.在所述条件下,使甩引物可获得实验的特异 性.甚至仔细挑 选引物tb不能排斥与牛型哈勒焦靶DNA无同源性均DNA的扩增.琼脂糖凝胶上带的密 变只反映引物和靶DN之问钓同源性程度.Southem转印提供了关于扩增的DNA和衍 生引物?DNA克隆有同源性雒嚣息,很显然特异性程度主要取如于引物.但迄今 . 为止,还不能选出对牛型哈勒焦有完全特异性钧引物. 辖果明,对于钩端螺旋体病的诊断,PCR是一个很有价值的补充方法.尿样的贮 存和送样似乎不是哭键,制备样品和试验撵作能在一个工作日里完成.本试验特异性 - 珏甚至可通过便新型更具皿海变神特异性扮寡核管酸引物加以提高.这些特性表 踞CR可以用于钩端螺旋体瘸的诊断和流行病学研究, 齐镞葵摘译自J.Clinica1.Mieriglo}Y,I989,27(坤)橱艟来莜 -- ... . 应用固相核酸杂交捡测日蹄痰病毒 {,I, :’’’’(薨]RobinG:~cFarlane等 _Il!..…-,-’_lI. ‘旦壁芝《呈,,是由微小RNA病毒引一起假蹄兽的急性高度佳銎焦塞凰由于发病 率高,经济顽袋天,’此旃被称为垒世界家奢中最可怕韵痰病. 大多数营家实施严格髓进既收疫措施以防FMDVl的侵进.有许多诊断方法用来 监测和控制此病的流行:FMDV有七个血清型:(即A0,?翌亚洲一型sAT一 1.型,SAT一2型和T一3型).,其中复有若币亚型.此病辱发时,墼与韭型的鉴别 碾复杂面通过塌蔼动物接种可疑病料’策观察临床症状,或进行组鳃培养分博病毒, 艇瘟目l辛反,酶联晓痕甓附试验等椽铡病毒抗凰免疫学方法在病毒定型时氍快速又实 用难i是最敏度不如病毒势商..!’... 毽旦奎基检.铡病毒的具有较矗灵敏度和特异鞋鳟擐落.日前gNRNAtt台 酶基因片段eDNA探针来检测食道探环液的传代细胞中FMDV--DNA.本文报道了应 用固相RNA—DNA杂交检测FMDV以及应用13种重组eDNA探 针鉴别各型FMDV. qi 一 . . . I方法’. , 嫡毒疃的提取{.各型FMDV在古5晒蹰牛血猎与抗生素的幼苍鼠肾(BHK一21) 细胞上继代接种0.1MOL的毒液出现病变时,收壤感染细胞.再嗣0一.Q5呖 -20? Triton,x100消化感染细胞,聚乙二醇(PEG)沉淀,氯化铯梯度离心纯化病毒.然 后用0.5%SOS裂解病毒粒子,苯酚抽提,乙醇沉淀核酸,经凝胶电泳分析,病毒RNA 约为8000个核苷酸. 组织和细胞培养物中的病毒核酸提取:所有操作均在冰浴上进行.将样品溶于 20mMHepes—KOI{(pH7.6),50mMKC1和5ram硫苏糖醇(DTT)的溶 液中,并 加入50U/ml昀RNAasin.然后用蛋白酶K(50U/m1)消化,苯酚抽提,乙醇沉淀核 酸.如收集不含DNA的RNA,则样品中加入不古RNA酶的DNA酶(0.5g/rag的 DNA);如只收集DNA,样品用RNaseA}i~”化(30I-t~/rn1),同样再用苯酚抽提,乙 醇沉淀核酸. 质粒与囊切片段的{目备:重组质粒的构建(略).重组质粒经大肠杆菌扩增,无离 子去污剂溶解,纯化后,进行氯化铯一澳化乙锭梯度离心,收集质粒DNA,透析后用 乙醇沉淀.然后酶切,用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收插入片段. 重组休PTz经Pst!消化詹产生三个片段(丁.L,TzM和TzS).重组体 PvvLP与PT..经ScaI和SstI消亿后均产生一个禽143bp的片段,称此片段为探针HV, 用低熔点琼脂糖电泳回收酶解片段,然后用P通过缺口翻译或随机引物标记成FMDV 探针.F 点样与杂交;一般用10ramTris—Hcl(pH8.0),lrnMEDTA稀释样品核酸,然 后点至含电荷的尼龙膜上,漂洗后,室温干燥然后将点样膜置于lM 醋酸钠,50%甲 酰胺,%SDS和1oqo硫酸葡聚糖的溶液中,58?预杂交15分钟,然后加入1Opglml的 探针和100gg/ml的鲑精DNA,杂交过夜.杂交温度通常为58?,即低于FMDV eDNA/RNA的解链温霞25~(3,杂交完后用2×.SSC(0.3M氯化钠,0.0aM柠檬酸钠 H7.0),室温洗二次;再在2×SSC/1%SDS溶液中60?洗二次,然后在0.1×SSC/ . 1%SDS溶液中60C洗二次,每次均为15分钟.膜干后予70?放射自显影. 一 结果 RNA转移,结合和杂交效果与所应用的缓冲液有关,FMDV—RNA经系列稀释点 胰后,在严格条件(Tm一25)下与探针Lp杂交,其杂交信号受缓冲掖中的成份影响. RNA样品预先用RNaseA(30gg/rnI)处理时,不出现杂交反应. 为了检测低拷贝数FMDVRNA,须除去大量宿主细胞核酸.当往FMDV—RNA 样品(圃定为1g)中加入的牛胸腺DNA量超过5ttg时,探针LP-与 FMDV的杂交信 号也随之减弱,这与膜结合能力的饱和态有关. 打点杂变的最大曼敏度;当杂交与洗膜温度低于解链温度25X;(Tm一25)时, eDNA探针与同源RN,A最易杂交,能检出1pg的全基因FMDV--RNA(或能检出100fg 与探针互补的RNA片段). 快速检测法曲曼敏度:采甩同样严格的条件(Tm一25)来简化杂交程序即杂交 2小时后于2~SSC/1%SDS和0.1×ssc/o.I%SDS60?洗30分钟,最小检测量可达lOpg 的全基因FMDV—RNA.’ 全细胞抽提物的灵敏度:抽提已知感染量的猪肾细胞(PK--15)中的FMDV一 . 2i. RNA..能检出TCIDn的FMDV. 探针的特异性.探针与宿主细胞以及其它病毒之间存在一定的交叉反应.当杂交与 洗膜条件不太严格时,A.型重组体探针与牛的DNA和RNA,猪和幼苍鼠肾细胞,甚 至多聚腺苷酸(1p.g/m1)有交叉反应.如甩酶切片段作探针,在严格条件(Tm一25) 下杂交,刚所有非特异性带均可消除,此外在此条件下标记的牛胸腺DNA也不与 FMDV—cDNA杂交(5~tgeDNA).Al2型探针与10TCID0的猪肠遭病毒RNA有交 叉反应.除探针T.L外,其它探针均不明显.非特异性的产生是由于3末端的37个腺 苻酸残基与RNA杂交. 血清型的鉴剐:当杂交与冼膜条件严格控制在Tm-25时,At:型的七个探针与 Al2A5,A.?,A(Saban~).A(vencelau),ct(Oberbayern)和Ol(Ka一 ~fbeurea)产生很强的杂交反应当用HV探针时.与C和O型不出现明显妁杂交反 应而仅与所有A型出现很强的杂交反应.’ 计奄 此检测方法既灵敏又可重复.样品用低盐缓冲液(TE一1)稀释时,较易结合在尼龙 膜上.为了使待检RNA完全与探针杂交,每个斑点核酸量不宜超过5g(83~g/em) 我们知道.核酸序列间的重新退火的比率和程度与杂交条件密切相关.这是探针间 的复性与洗腆条件相互作用的结果.由于搽针的复性作用.至少有20—30%的探针没有 参与杂交反应.为了让探针充分在膜上扩散,不让其形成复性双链,剐应选择适宜的反 应条件.如甩浓度的探针(小于10ug/m1),杂交液不超过l0mJ,在较高的温度 (58)下杂交此外加入硫酸葡聚糖有助于杂交双链的形成. 试验表明,Az型探针与A,O,C型充分杂交后以温度Tm一4o冼膜则出现很 强的交叉反应.因而如要减少探针与其它序列如其它微小RNA病毒间的交叉反应,则须 以Tm一25条件进行杂交与洗膜.试验又表明,聚台酶片段(Tzt.M)的cDNA为A, O,C型的保守区而肠道病毒.猪水泡病病毒以及与鼻病毒之间并不存在这种情况. 更为重要的是所有Az型探针均不与猪水泡病病毒发生交叉反应.在严格的条件下,所 有探针均不与细胞ONA和RNA发生反应.. 探针的灵敏度与各种因素有关.当LP探针及RNA的杂交时间缩短至2小时,其灵 敏度瞻湿下降(10至100倍). F觏DV粒子由3l嘶RNA和69嘶蛋白构成.其中RNA分子量约为 2.6×10.遭尔顿, 则检测lpg的FMDV—RNA相当于2—3X10病毒粒子.这种方法较补体结合反应和酶 联免疫吸附试验灵敏., 可甩不同型的探针区分A,OC型,此病暴发时,用此法定型较为方便,编码VP 高度可变区的HV探针,能特异地区分其它血清型.然而HV探针还不能区分亚型之间 的罄别.预计在不久的将来可合成寡核苷酸探针来区分亚型之阊的差别.? (参考文越略) 蒋正军摘译自《J.Viro,Methods》l990,27(2),175—188富云浩校 ?22?