乳酸菌细菌素分类与作用机制

乳酸菌细菌素分类与作用机制 乳酸菌细菌素分类与作用机制 贡汉生,孟祥晨 (东北农业大学乳品科学教育部重点实验室/食品学院,哈尔滨,150030) 摘要乳酸菌细菌素作为天然的食品防腐剂,可抑制或杀灭食品中致病微生物和腐 败微生物从而保护食品的 安全.文中介绍了乳酸菌细菌素传统分类方法和新提出的分类方法,并且综述了乳 酸菌细菌素的作用机制. 关键词乳酸菌,细菌素,分类,作用机制 许多乳酸菌除产生乳酸,乙酸和双乙酰外,还能 产生细菌素,可抑制或杀灭多种致病菌和腐败菌.细 菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机 制产生的一类具有生物活性的蛋白质,多肽或前体多 肽,这些物质可以杀灭或抑制与之相同或相似生境的 其他微生物_1J. 迄今已发现了几十种乳酸菌细菌素,但真正应用 于商业化生产的却很少.为了开发高效,稳定的乳酸 菌细菌素,加速细菌素在食品工业中的应用,阐明乳 酸菌细菌素的基本结构和作用机制是非常必要的. 随着新的乳酸菌细菌素分离和鉴定出来,其分类也在 不断变化.确定细菌素所属类别,对开发新型乳酸菌 细菌素,确定它们的生物学特性具有指导意义.研究 乳酸菌细菌素的作用机制,对评价细菌素的安全,开 发现有细菌素应用于工业,选择与其他灭菌方式一起 作为栅栏技术共同保护食品安全也是十分重要的. 1乳酸菌细菌素分类研究进展 1.1乳酸菌细菌素传统分类方法 根据乳酸菌细菌素的组成,大小,热稳定性,作用 为3类,4类或5类[2"]. ClassI:羊毛硫抗生素(1antibiotics),是小的热 稳定肽(分子质量<5ku). ClassII:小的热稳定的不含羊毛硫氨酸残基的 膜活性多肽(分子质量<lOku). Classm:热敏感的大分子蛋白类细菌素(分子 质量>30ku). Class?:复合细菌素,活性除需蛋白部分外还需 其他化学成分(如类脂,碳水化合物)的作用. ClassV:环形乳酸菌细菌素. 1.2新提出的分类方法 2005年,Cotter等[5建议重新修订分类规则,并提 出了1个修订建议,见表1.这一建议把细菌素分为2 个确定的种类:含羊毛硫氨酸细菌素/羊毛硫抗生素 (Class1)和不含羊毛硫氨酸细菌素(Class1]),把大的热 稳定胞壁质水解酶(从前的Classm细菌素)重新定名为 "溶菌素(Bacteriolysins)".Cotter等建议把环形乳酸菌 细菌素划分在不含羊毛硫氨酸细菌素(Class1])里. ClassIV是一个细菌素保留的分类,它们的活性需要非 蛋白质成分起作用,但是这一类物质没有得到充分的 方式,输出机制和抑菌谱等,乳酸菌细菌素先后被分证明,所以没有包含在新建议 的分类中. 表1Cotter等建议的乳酸菌细菌素分类方法 注:1)不包括没有完全证明的Class?(有非蛋白成分起作用)细菌素;2)建议其不再 属于乳酸菌细菌素. 第一作者:博士研究生. *国家"十一五"863科技计划(2006AA102344)资助项目. 收稿日期:2007—06—26,改回日期:2007—09—2o 1.2.1含羊毛硫氨酸细菌素/羊毛硫抗生素(Class I) 羊毛硫抗生素(LABlantibiotics)最初根据结构 和作用方式的不同,分为2个亚类:A类为延伸的螺 生蔓查蔓塑!璺蔓丝塑I105 OODANDFERMENlAlIONlNDUblK 旋状结构,带正电荷,两亲性,能在细菌质膜上形成电 位依赖性的孔洞;B类为球形,带负电荷或不带电荷, 能抑制细菌细胞壁合成,为酶抑制物.近年来,基 于作用方式的分类遇到了挑战,首先发现Nisin通过 2种机制发生作用,除了形成孔洞外,也能结合类脂 ?抑制细胞壁的生物合成.其次,许多双肽链羊毛硫 抗生素通过2个肽链组合形成活性的功能进一步增 加了这些细菌素分类的混乱.考虑到群内的差异性, 根据肽链的保守序列把羊毛硫抗生素重新分为11个 亚类].每一亚类的命名都反应它们的特性,11个 亚类分别为Nisin,epidermin,streptin,pep5,lacti— cin481,mersacidin,LtnA2,cytolysin,lactocinS, cinnamycin和sublancin. 1.2.2不含羊毛硫氨酸细菌素(ClassII) 新的分类方法中,第2类细菌素(classII)中第1 亚类(?a)为类片球菌素(pediocin—like),这类细菌素 有很强的抑制单核细胞增生李斯特氏菌的能力,成熟 的细菌素N一末端都含有YGNGVXC这样的结构,其 中X代表任意氨基酸.第2亚类(IIb)为含有2个 不同肽链的寡聚体,需要2个肽链共同作用发挥抑菌 活性,虽然这些亚类中每一种都具有特异性,但仍然 把它们细分为E类(增强型)和S类(增效型)l_7].第 3亚类(IIc),即原来的ClassV,它们的N一末端和C_ 末端以共价键相连,形成环状结构,虽然这类细菌素 只鉴定出很少的几种,但还是有人根据氨基酸序列的 相似百分比把这些细分为2个亚类:第1亚类(sub= classc(i)):包含AS48和non—LABcircularinA,第2 亚类(subclassc(ii)):包括gassericinA,reutericin6, thenon—IABbutyrivibriocinAR10和acidocinBE8]. 第3亚类(?c)细菌素gassericinA和reutericin6是 乳酸菌细菌素中仅有的两个含有D一氨基酸的非羊毛 硫抗生素!.第4亚类(?d)是其他细菌素或单肽链 非类片球素的组合,根据它们的前导序列也可以近一 步分类. 1.2.3溶菌素 溶菌素(bacteriolysins)即原来的第3类(class UI)细菌素,是热敏感的大分子抗菌蛋白,它们具有区 域型结构,不同的区域有易位功能,结合受体和致死 活性. 2细菌素的作用机制 乳酸菌细菌素可通过不同的机制产生抑菌效果, 通常其目标是细胞膜.细菌素作用的最初动力是靶 106Jl::!!!l 细胞膜和细菌素之间的静电引力.不同类型的细菌 素作用机制是不同的. 2.1羊毛硫抗生素作用机制 虽然不是每一种羊毛硫抗生素的作用机制都很 清楚,但一般含有"入坞分子"或靶位点. 2.1.1A类羊毛硫抗生素的作用机制 2.1.1.1形成孔洞和抑制细胞壁合成 羊毛硫抗生素中Nisin,Pep5,subtilin,lacti— cin3147和streptococcinFF22可以在敏感微生物细 胞膜上形成短时,非选择性的孔洞,抑制氨基酸的运 输并且导致小分子如氨基酸,离子和ATP的释放. 在体内没有发现形成孔洞机制的推定目标蛋白受体, 却发现脂质体与形成孔洞有关.形成孔洞是一个耗 能的过程,现在大部分知识来自Nisin对人工膜系统 作用的研究. Nisin具有双重作用机制(见图1):Nisin形成孔 洞引起跨膜电势消失使质子动力(PMF)丧失,由于 细胞内外pH值不同而导致离子的泄漏和ATP的水 解,从而导致细胞死亡;Nisin也可以结合肽聚糖前体 类脂?从而干扰细胞壁的生物合成.双重机制使 Nisin在nmol浓度即能发挥作用. Wiedemann等人口阳研究发现,Nisin可以使细胞 膜形成直径2,2.5nm的孔洞,从而使膜的通透性 增加导致PMF丧失,pH梯度(ApH)和跨膜电势 (Aqo)全部消散引起所有合成进程的终止.细胞膜组 成是Nisin形成'孔洞的重要影响因素,体外研究表 明,类脂?是Nisin特异性结合细胞膜的"入坞"分 子.遗传工程改造的Nisin变体帮助鉴定了其与类 脂?相互作用时需要的结构[1.变体改变了Nisin N一末端的构象,导致结合减少并使穿孔需要的Nisin 浓度增加.变体的结合常数为0.043×10/moI,而 正常Nisin为2×10/moI,引起穿孔最小浓度则从2 nmoL上升到50nmoI.变体的弹性铰链区在穿孔 中完全失去作用.在体内测定抑菌效果,它们的活力 没有完全丧失,未丧失的活力来自未失去结合类脂? 能力的变体.Nisin结合类脂?可抑制其进入到肽聚 糖网络中.Nisin的N一末端可以在细胞膜上结合细 胞壁合成前体类脂?抑制肽聚糖的合成.与Nisin 诱导的没有入坞分子形成的孔洞相比,膜表面负电荷 不是必需的.然而,NisinC一末端的正电荷在与阴离 子细胞壁聚合体结合时是非常重要的,因此可以在体 内产生抑菌活性uJ. 2.1.1.2A类羊毛硫抗生素的其它作用机制 C~UlIIIlla群?I {s 图1乳酸菌细菌素的作用方式j 除了形成孔洞和抑制细胞壁合成外,Nisin和理的细胞细胞质中的肽聚糖前体发现,最终可溶的肽 Pep5还可诱导敏感的葡萄球菌细胞自溶,导致整个聚糖前体UPD-MurNA—pentapeptide不受细菌素的 细胞壁的降解,这一反应主要发生在分化子细胞的分影响],这说明mersacidin抑制合成途径中接近最 隔区.细菌素能释放两种细胞壁水解酶,N一乙酰胞后的与膜相关的一步.在巨大芽孢杆菌中是在转糖 壁酸一L,丙氨酸酰胺酶和N一乙酰葡萄糖苷酶,它们是基作用这一步,或者是第一步聚合反应(图2).后来 很强的阳离子蛋白,经静电相互作用与细胞壁中带负的研究显示这一抑制作用的分子基础是mersacidin 电荷的物质结合.阳离子肽与细胞壁内抑制物通过与类脂?的相互作用,并不是糖基转移酶的作用,与 一 个类似阳离子交换的过程把后者取代,然后酶激活Nisin一样,Mersacidin也结合类脂?,但与Nisin的 并快速裂解细胞.结合位点不同,而且不能形成孔洞.一些抗生素如万 2.1.2B类羊毛硫抗生素的作用机制古霉素通过在这一分子肽的侧链结合类脂?抑制转 B类羊毛硫抗生素主要包括肉桂霉素(cinnamy一糖基作用.但mersacidin并不与这一侧链结合,也不 cin)和mersacidin两类,通过结合特异性膜脂发挥活与其他抗生素结合位点结合.到目前为止,还没有见 性,它们也是酶抑制剂.肉桂霉素类细菌素通过与脑到有关其确切结合位点的报道. 磷酯结合形成复合物抑制磷酸解作用.2.2第2类~ttilti素的作用机制 Mersacidin的抑菌机制既不同于A类羊毛硫抗第2类细菌素主要通过形成孔洞,引起细胞膜溶 生素,也不同于其他的B类羊毛硫抗生素.用解,消耗细胞内ATP并导致氨基酸和离子的泄漏而 mersacidin处理敏感细胞可使其生长终止和缓慢裂杀死敏感细胞(见图1).第2类细菌素对单核细胞 解.除了肽聚糖合成外,其他大分子合成不受影响,增生李斯特氏菌的敏感性可能与其磷酸转移酶系统 另外细胞壁变薄.因此,抑制细胞壁的生物合成是EIIan中的甘露醇透性酶有关,磷酸转移酶系统 Mersacidin最主要的作用方式.比较mersacidin处 2008年第34卷第1期(总第241期 OODAL】}EKMEN【A【IUNINUU5【K 转糖基作用 C:】I C? ?=j? 细胞质 +卜PEP UDP—MurNAc, …jr一-{P?uDP.MurNAcLD_Ah—D- 图2细菌细胞壁的合成图,mersacidin可能抑制 细胞壁合成的位点m ElitMan是1个糖摄取/磷酸化系统,现在已有多条证 据证明其中的甘露糖透性酶是第2类细菌素1个推 定的受体.这一理论最初得到肯定是由于细菌素天 然抗性突变株在这一系统中的一个特定单元表达减 少,即在具有leucocinA抗性的单核细胞增生李斯特 氏菌中不产生IIA"],同时另1株抗mesentericin YIO5的单核细胞增生李斯特氏菌中编码ElltMan 另1个亚单元的mptD也不产生IIAj.具有 mesentericinY105和leucocinA抗性的单核细胞增 生李斯特氏菌的突变株同时显示编码这一透性酶的 mptACD基因表达减少[1. 2.3溶菌素的作用机制 溶菌素(bacterio1ysins),即从前的细菌素classl— II的作用机制与其他细菌素溶解敏感细胞细胞膜完 全不同,它能促进细胞壁的溶解(见图1).这些蛋白 也是构建细胞壁的成分而且在N一末端具有反应区 域,它们具有相同的肽链内切酶,并且C一末端可能具 有目标识别位点. 3我国乳酸菌细菌素研究现状 1989年,中科院微生物所开始对Nisin进行基础 研究,经过中科院微生物所与浙江银象生物工程有限 公司"八五","九五","十五"科技攻关,2004年,Nisin 在银象生物工程有限公司全面投产. 1990年,国内学者开始对其他乳酸菌细菌素的 研究.除nisin外,我国乳酸菌细菌素的研究主要集 中在菌株筛选,细菌素分离纯化和一般特性,通过优 化发酵条件和诱变细菌素产生菌提高细菌素产量等. 对乳酸菌细菌素的分类及作用机制研究很少,当前见 到的只有周伟等报道了植物乳杆菌素L一1对单核细 胞增生李斯特氏菌作用机制的研究o].我们在筛选 108I2008VOI.34NO1(Total241) I 新型乳酸菌细菌素时,要加强对获得的细菌素的深入 研究,确定其结构及作用机制,使之尽快应用于食品 工业,保证食品的安全. 4结束语 随着乳酸菌细菌素研究的深入,其分类也在不断 变化.Cotter等的分类方法中提出了许多新的概念, 如把Class?重新命名,使名称与抑菌机制更为符合. 但新分类方法被认可还需要较长时间,另外随着新型 乳酸菌细菌素不断出现,很可能被更新的分类方法取 代,乳酸菌细菌素分类将不断完善.确定细菌素的作 用机制,可以采用与之具有相似作用的杀菌方法协同 杀灭致病菌和腐败菌,而且对研究细菌素毒性和细菌 素抗性也具有重要意义.目前只有羊毛硫抗生素和 Class11a类细菌素的作用机制研究的比较深入,但仍 有许多谜团没有解开;对其他细菌素作用机制的研究 基本上处于空白.我国具有丰富的乳酸菌资源,可以 从中筛选稳定,高效的乳酸菌细菌素,同时我们要对 获得的细菌素进行透彻地研究,确定细菌素的分类并 解析其作用机制,使乳酸菌细菌素更好得为人类饮食 安全服务. 参考文献 1DeeganLH,CotterPC,HillC,eta1.Bacteriocins:Bio— logicaltoolsforbio—preservationandshelf-lifeextension. 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Keywordslactisacidbacteria(LAB),bacteriocin,classification,mechanismofaction 2008年第34卷第1期(总第241期)109