中药复方及单味药材中淫羊藿苷的大鼠体内药动学分析

中药复方及单味药材中淫羊藿苷的大鼠体内药动学分析 中药复方及单味药材中淫羊藿苷的大鼠体 内药动学分析 2009年7月第6卷第19期?药理与毒理? 中药复方及单昧药材中淫羊藿苷的大鼠体内药动 段旭光,周崇文,陈科,曾雷 (湖南环境生物职业技术学院,湖南衡阳421005) [摘要】目的:利用反相高效液相色谱法,分别比较复方与单味药材提取物中淫羊藿苷在大鼠体内的药代动力学(药 动学’)参数差别,探讨配伍对药效成分体内过程的影响.方法:实验大鼠分别灌胃复方及单味药材提取物后,测定不 同时间点血浆中淫羊藿苷的浓度,采用药动学程序3P97对数据进行统计学处理,进行药动学模型拟合并计算相关 药代动办学参数.结果:复方及单味药材中淫羊藿苷在大鼠体内分别呈二室和一室模型,主要药代动力学参数为: 复方组 Cm=(3.133+0.290)~g/hal,tlt2(1~.=(0.753~0.809)h,(2.089~0.144)h,AUC~u=(30.839~3.680)?h/ml. 单 味药材组e(23l趾0.218)~g/ml,Tm=(1.497~0.521)h,AUCo-~--(19.947~2.555)g?h/ml.结论:与单味药材相比, 复方中淫羊藿苷在大鼠体内吸收增加,消除及达峰时间延长,血浆清除率减少.因此复方配伍对淫羊藿苷体内过程 有显着影响. 【关键阑I莼代动力学;淫羊藿;淫羊藿苷;HPLC 【中匝分类号lR965陂献标识码1A【文章编号】1673—7210(2009)07(al_081—04 analystsoficariininratscomingfromChinesemedicine compoundrecipeandsinglemedicinalmaterials DUAx鼍Ii帕ll岛翻oUC啊tg他CHENKe’zENGLei llllanEnvironmentandBiologicPolytechnic,Hengyang421005,China) [Ahstrad]Objeelive:Tocomparethedifferenceofkineticparameterof’碰噼d目IlIion—metabolisminratsoftheicarrin. whichconicfromcompoundrecipeandsinglemedicinalmaterialsusingttP-~anddisseusstheinfluence ofeompati. bi]itrofmedicinestobody.Methods:Theratswereintragastrieadmln;gtere~[舶compoundrecipeandextractiveof Lon~purimediumrespectively.ebloodconcentrationofdifferenttimepomts.Weretestedbyproposede stablished RP—I ?.LC.Dataweredealedwithpharmacokineticprogramme.andfittedtokineticparameter.Itshowedthati carrinin thecompoundrecipewasintwo—chamberinmouse.andsin#emedicinalmaterialsinone—chamber.Results:Main kineticparameterswerethatcompoundgroupwasCl衄=(3.133~-0.290)ml,lt,2(=(0.753~0.809)h,(2.089i-0.144) h,AUCo一(30.839~3.680)tzg?h/m1.SinglemedicinalmaterialsgroupwasC2.318~0.218)gl,(1.497~-0.521)h, A=(19.947~2.555)g?h/m1.Conclusion:Theresultsshowtbattherearesomesignificancedifferencesof ieariinbe. tweenthecompoundrecipeandsingleberber.rheelimination,absorption,peaktimeofieariininthecomp oundrecipe arehigerthaninLongspurEpimedium. 【Keys]Pharmaeokineties;LongspurEpimedium;Ieariin;HPLC 复方肝康颗粒(以下简称为”复方”)是在”乙肝汤剂”的 基础上,经过拆方解方和剂型研究改进而来,长期临床疗效 表明,该复方能明显改善慢性乙肝患者的症状和体征,具有 护肝和抗病毒的作用口1.淫羊藿苷是淫羊藿的主要有效成分. 是一种分子式为CH0(),的异戊烯基黄酮醇苷类化合物.近 年来的研究表明,淫羊藿苷具有多方面药理作用.主要包括: 心血管方面,在降低心肌耗氧量的同时降低外周阻力,减轻 心脏后负荷,对心肌缺血和心律失常等心血管疾病有改善作 用[21,扩张血管平滑肌,改善微循环,对脑部缺血,低氧有保护 作用;内分泌方面表现为性激素样作用,具有补肾壮阳作用; 促进体外培养成骨细胞增殖和分化;能增强免疫功能,起到 免疫调节作用,抑制肿瘤细胞增殖,促进凋亡13l,还具有延缓 衰老,抗疲劳和耐低氧作用,促进蛋白质合成与核酸代谢,对 肝细胞具有保护作用. 【作者简介】段旭光,男,副教授,长期从事植物化学成分分离与鉴定研究 工作. 1试验材料 1.1仪器 北京西东电子高效液相色谱仪LC5500(SPD一10AVP紫 外检测器.LC—IOATVP泵,CBM一102CommunicationBus Module工作站,HT一230A柱温箱);WH一2微型漩涡混合仪 (上海沪西分析仪器厂有限公司);TGL16M高速冷冻离心机 (长沙英泰仪器有限公司);AFX2—1001一P艾科浦超纯水系 统(重庆颐洋企业发展有限公司);HZ一9811K双层双速振荡 器(上海康华生化仪器制造厂);CH1050超级恒温槽(上海恒 平科学仪器有限公司);SKG一02400电热恒温干燥箱(黄石市 恒丰医疗器械有限公司);XS105DualRange万分之一电子天 平(ME1]【’LERTOLEDO,瑞士);BCD一179KHaier冰箱. 1.2试药 复方肝康颗粒(批号为060305),复方所用药材及淫羊 藿(均购自邵阳药材公司,淫羊藿批号为070208),淫羊藿药 材提取物(自制);淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定 CHINAMEDICALHERALD巾置医药异擅81 ? 药理与毒理? 所,批号为110737—200312);苯甲酸对照品(中国药品生物 制品检定所,批号为100419—200301);肝素钠(南京新百药 业有限公司);乙腈(美国TEDIA公司,色谱纯);冰醋酸(天 津化学试剂有限公司,分析纯);乙酸乙酯(天津化学试剂有 限公司,分析纯);甲醇(天津化学试剂有限公司,分析纯);重 蒸水(自制). 1.3试验动物 健康SD大鼠,雄性,体重(200~20)g,由湖南环境生物 学院医学部实验动物中心提供,动物自由摄食自来水和普通 饲料. 2方法与结果 2.1方法 2.1.1色谱条件色谱柱为Shim-packVP-ODS(4.6mmxl50mm. 5.0m),流动相为乙腈一3%醋酸(30:70),检测波长为 270nm,流速为1.0ml/min,内标为苯甲酸,柱温为室温,进 样量为201. 2.1.2血浆样品的处理方法大鼠灌胃前尾静脉取血1ml置 于预先肝素化的试管中,离心(3000r/rain,10min),取上层 血浆作为空白血浆;取3份空白血浆样品0.5ml于10IIll具 塞离心管中,加入同浓度的淫羊藿苷对照品溶液100漩 涡混合均匀,分别比较乙酸乙酯萃取,甲醇和乙腈沉淀法的 色谱图和回收率,最后确定使用乙酸乙酯萃取法处理. 具体步骤如下:取样品加入2.5Il1l乙酸乙酯.振荡萃取 3rain,离心(5000r/min,5min),移取上清液,于37?水浴氮 气吹干,残渣加入100l甲醇漩涡振荡1min溶解,高速离 心(10000r/min,2min),取上清液20l进样. 2.1.3药动学研究取SD大鼠110只.随机分为22组.每组 5只,其中,11组给予复方,另11组给予淫羊藿提取物.实验 前禁食(不禁水)12h,第2天按体重灌胃给予复方(4.30g,kg) 和淫羊藿提取物[1.64g(生药)/kgl,相当于淫羊藿苷4.36ms/ks, 灌胃后于0.25,0.50,0.75,1.00,1.50,2.00,4.00,6.00,8.00,12.00, 24.00h尾静脉采血1ml,置于预先肝素化的试管中,离心(3 000r/min,10min),取上层血浆0.5ml放入一20?冰箱保存备 用,每个时间点取5只大鼠.按”2.1.2”项下的方法处理后测 定. 2.2分析方法验证 2.2.1系统适用性试验理论塔板数按淫羊藿苷计算不小于 3000,该峰与其相邻色谱峰的分离度大于1.5,对称因子小 于1.O50 2.2.2方法专属性0.5ml空白血浆不加样.0.5ml空白血浆 中加入淫羊藿苷和内标物苯甲酸标准品及0.5ml给药后大 鼠血浆,按照”2.1.2”项下方法处理血浆样品后,分别观察其 色谱行为.结果表明血浆中内源性物质不干扰淫羊藿苷和内 标物的测定.并且二者峰形良好.淫羊藿苷和内标物苯甲酸 的保留时间分别为7.1,5.8min,见图1. 2.2I3标准工作曲线及最低检测限测定分别精密量取淫羊 藿苷贮备液适量.用甲醇稀释制成10.2000,5.1000,1.0200, 0.5100,0.2550,0.1280,0.0638咖l的淫羊藿苷系列对照 品溶液.于4~C保存备用. 标准工作曲线的绘制:取500空白血浆7份,分别加 82巾田医药异擅CHINAMEDICALHERALD 2o09年7月第6卷第l9期 时I11Ill【.4 图1典型色谱图 (A.空白血浆;B.空白血浆+淫羊藿苷+内标苯甲酸;C.大鼠灌胃复方后的 血浆样品;D.大鼠灌胃单味药材提取物后的血浆样品) Fig.1Representativechromatograms (A.Blankplasma;B.Blankplasmawithicariinstandardandintemalstandard benzoicacid;C.Plasmasampleofratintragastricadministeredwith compoundrecipe;D.Plasmasampleofratintragastrieadministeredwith extractiveofLongspurimedium.) 入不同浓度的淫羊藿苷系列对照品溶液100Ixl及内标溶液 501,漩涡振荡混匀后,按”2.1.2”项下操作,分别记录色谱 图.以淫羊藿苷与内标物的峰面积比值为纵坐标(Y),淫羊 藿苷浓度为横坐标(,l~g/m1)作图进行线性回归,得标准 曲线和回归方程为Y=0.0413X+0.0006.r=0.9997,表明淫 羊藿苷在0.0638-10.2000~g/ml范围内线性良好.以信噪 比S/N?3时的浓度为最低检测浓度,得方法定量限为 0.0638I~g/ml. 2.2.4精密度试验分别取空白血浆500Ixl.精密加入高,中, 低3个浓度(浓度分别为l0.20,5.10,O.51g,rn1)的淫羊藿 苷标准品1001,同时加入5Ol内标溶液,按”2.1.2”项下 处理,每一浓度进行6个样本分析,连续测定3d,与标准工 作曲线同时进行血浆样品的浓度计算,求得方法的日内与日 间精密度RSD.日内RSD分别为2.33%,3.11%,2.42%;日间 5分别为3-36%,1.98%,2.75%. 2I2.5提取回收率分别取空白血浆500l,精密加入高,中, 低3个浓度(浓度分别为10.2O,5.10,0.51~g/m1)的淫羊藿 苷标准品100l,每个浓度各6样本,按”2.1.2”项下操作, 测得血浆样品浓度.以样品经提取后的色谱峰面积与未经 提取直接进样获得的色谱峰面积之比.考察样品的提取回 收率及其兄.高,中,低3个浓度的回收率分别为93.88%, 90.82%,87.42%;RSD分别为2.17%,lI49%,1.84%. 2.2.6稳定性试验取空白血浆500txl,精密加入高,中,低 3个浓度(浓度分别为10.2O,5.10,0.51g/m1)的淫羊藿 苷标准品1001及内标溶液50,每个浓度各6样本, 按”2.1.2”项下操作,进样20l记录样品的峰面积,剩余 2009年7月第6卷第l9期 样本置于室温保存(约28oC),于6,12,24h后重新测定, 将3个浓度各时间点测得的峰面积比进行对照,计算 RSD(%).测得10.20,5.10,0.51~glml样品的RSD分别为 2.43%,5.36%,7.73%.实验结果表明,血浆样品经处理于 室温保存24h后,血浆中淫羊藿苷浓度仍可被准确测 定. 2.3药动学研究结果 将测得的血药浓度数据采用3P9实验药动学计算机程 序,对血药浓度一时问数据进行拟合,根据AIC最小的原则选 取房室模型,两组闻的药动学参数比较采用两样本总体均数 t检验.复方及淫羊藿中淫羊藿苷在大鼠体内分别呈二室和 一 室模型,主要药代动力学参数见表l,其平均药一时曲线见 图2. 裹1大鼠口服复方和淫羊藿提取物后的主要药动学参数In=5) Tal~lMainpharmacokineficparametersofcompoundrecipeand extractivedLong,spurEpitu,dium(n--$) 与复方组比较,.P<O.05,0.O1 Comparedwithcompoundgroup,尸_<O.05,_P<O.O1 35 3口 ,, 25 一 ? ‘5 矗’ 口蓐 D口 口51a1521125 时间(hr) 图2复方及淫羊藿中淫羊蕾苷药一时曲线 Fig:~Theconcentration-timecurveoftheplasmaafterintragastric administeredwithcompoundrecipeandextractiveofLongspur Epiraedium ? 药理与毒理? 3讨论 3.1血浆样品的处理 先后采用乙酸乙酯萃取.甲醇,乙腈沉淀来处理样品,发 现与甲醇和乙腈沉淀处理相比,用乙酸乙酯处理的样品所含 内源性干扰物少.样品的回收率较高.结果与文献报道一 致,有研究者曾用甲醇提取获得了理想的结果罔,但使用甲醇 沉淀易出现乳化现象.对乙酸乙酯使用量和萃取次数的考察 中,曾用0.5ml血浆加入1.5,2.5,3.0IIll进行1次及2次萃 取,结果发现,用2.5rIIl及3.0ml的提取率高于1.5IIll,但 2.5IIll与3Hl1之间几无差别,分1次和2次萃取提取率差别 不大,因此选用乙酸乙酯1次萃取.既方便又节省溶剂且挥 干时间较短.经方法学证实,该方法确有较高的灵敏度和专 属性,以及良好的精密度和准确度,符合生物样品分析方法 的要求. 3.2淫羊藿苷的药动学特点 各时间点血药浓度数据经3P97药动学软件拟合分析 后,得出复方中淫羊藿苷在大鼠体内均呈二室模型,淫羊藿 提取物中淫羊藿苷在大鼠体内呈一室模型.药动学参数分 析:复方和淫羊藿提取物大鼠灌胃后.淫羊藿苷在大鼠体内 的吸收滞后时间(Lagtime)分别为0.347,0.271h.动物给药后 复方组吸收入血的速度较慢;两组药物的吸收速率常数l(1 分别为1.119,2.192,说明淫羊藿提取物组吸收的速度较快, 而复方组吸收的速度较慢;两组消除半衰期比较,服用复方 组动物体内的淫羊藿苷消除相对较慢;血浆药物峰浓度() 分别3.133,2.318,曲线下面积uc)值分别为30.839,19.947, 复方组的吸收程度较淫羊藿提取物组好;血浆清除率(CL), 表观分布容积(Vd).淫羊藿提取物组相对较大.两组间的差 别经t检验得出,Cl腽,AUC,CL,Vd,疋,t(P<0.O1),(P< 0.05),说明复方与淫羊藿提取物的存在显着性差异,在 Cm,AUC,CL,,疋,’I傩之间有非常显着性差异.此结果显 示.复方中淫羊藿苷在大鼠体内较淫羊藿提取物的吸收明显 增加,药物峰浓度增高,消除及达峰时间延长,血浆清除减 少,药物体内作用的时间延长,单味药提取中的淫羊藿苷体 内分布较广.据文献报道,淫羊藿苷的生物利用度仅为12%, 随着灌胃剂量的增加,并不能明显提高其血药浓度,且吸收 情况较差,原因可能是由于高剂量时淫羊藿苷的溶解度降 低,药物难以经胃肠道吸收.赵艳红等[10-11研究了淫羊藿苷大 鼠肠内吸收的机制,表明淫羊藿苷先被水解再吸收,高剂量 灌流时有少部分以原型形式吸收;另有学者[121将淫羊藿总黄 酮制成磷脂分散物后.使淫羊藿苷在大鼠体内的吸收增加, 药时曲线下积分面积似wc)提高2.5倍,峰浓度提高3倍.本 研究的结果表明通过改变剂型,增加总黄酮的溶解,提高亲 脂性,将有效提高淫羊藿苷在体内的吸收,由此推测复方本 身存在,或是在煎煮制备的过程中产生了某些新成分,这些 成分与淫羊藿苷作用后.增加了淫羊藿苷的溶解度及亲脂 性,使得其在大鼠体内的吸收增加,生物利用度提高,具有协 同增效的作用. 上述研究证明.中药复方成分在体内的变化是一个复杂 的过程.复方中各成分对淫羊藿苷在体内有促进吸收,协同 (下转第87页) CHINAMEDICALHERALD巾—蜃药弓曩83 2009年7月第6卷第19期 3.O,4.O,5.0ml置于1Oml容量瓶中,分别加5%NaNO2溶液 0.1ml,摇匀,放置6min,加1%A1C13溶液0-3IIll,摇匀,放置 6min,加4%NaOH溶液4ml,摇匀.放置15min,加60%乙 醇溶液至刻度后.以第1份为空白,在246am波长处测定吸 光度,以芦丁对照品的质量浓度(o为横坐标,吸收度)为纵 坐标,得回归方程A=0.1452C+0.1156,r=0.9996,表明芦丁 对照品在l_oooo,5.ooooIxg/ml范围内线性关系良好. 2.2.5样品含量的测定精密吸取”2.2.2”项下的各供试液 1ml于10m1容量瓶中.按”2.2.4”项下的方法显色.再加入 60%乙醇溶液稀释至刻度,摇匀,在246am波长处测定吸光 度并计算芦丁的含量(表2),进行方差分析(表3). 表2正交设计及结果 Tab.2Orthogonalandresults 由直观分析和方差分析可以得出.影响提取效果的主次 因素依次为D>A>C>B,其中料液比影响最显着.综合分析, 得出最佳提取工艺条件为A:B,C,D,,即用30倍原料药的 70%乙醇溶液提取3次,每次3h,提取效果最好.按此条件, 进行3次平行实验,得芦丁的平均含量为0.3976%,说明上 述工艺达到了优化的目的.稳定性好. ? 制剂与技术 表3正交试验方差分析 Tab.3Varianceanalysisoforthogonalexperiment 表明有显着性差异 3讨论 本试验采用乙醇回流法提取红花中黄酮类化学成分.以 提取得到的芦丁含量为考察指标.由表2的R值和表3可以 得出结论,各因素对实验结果有显着影响的是D料液比.由 表2和表3的结果可以推断出最佳提取工艺为AB3C,D,,即 用30倍原料药的70%乙醇溶液提取3次,每次3h,提取效 果最好,含量高阎.此工艺简便易行,可以将红花中黄酮类化 学成分充分提取出来.为充分利用红花资源提供了重要的理 论依据. 【参考文献】 …1江苏医学院.中药大词典fM1.上海:上海人民出版社,1971:902. 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