人胎盘来源的金属蛋白酶抑制因子—3的分离纯化及性质研究

人胎盘来源的金属蛋白酶抑制因子—3的分离纯化及性质研究 人胎盘来源的金属蛋白酶抑制因子—3的分 离纯化及性质研究 第3卷第3期 20O1年9月 沈阳医学院 JOURNALOFSHENYANGMEDICALCOLLEGE V0J3No3 Sep.2OO1 人胎盘来源的金属蛋白酶抑制因子-3的 分离纯化及性质研究 邹黎明徐军罗阳伊德林曾艳潘晓蔚王嘉伦 (沈阳医学院生物活性物质研究所.沈阳110031) 摘要目的首班从人胎盘中分离纯化了天然型T1MP一3,井建立了TIMP一3 酶联免疫洲定方法.方法人胎盘来镡的TIMP-3的纯化,首先利用4MoI/L尿素 T血缓冲液(pH8.0),在除去多数水溶性蛋白的胎盘匀泉液中提取难溶性蛋白,掉 后经过CM52阳离子交换树脂和Sephac叫S-200凝胶过遣二步柱层析.结果 SDS聚丙酰胺耗肢电泳显示最后分离鲒果,分别为27KD和24KD的两务蛋白带. Westernblotting鲒果明,分子量为27KD蛋白为N末端糖化的TIMP-3,分子量为 24KD的蛋白为非糖化的T1^?3,两者的比例约为1:3.对比尿素抽提液TIMP一3 的纯化产率为24%,纯化倍数约为3200倍.结论纯化的天然型TIMP-3对 MMP-I有明显的抑制活性.非糖化的TIMP一3IC?为1.1x10,M,糖化的TIMP-3 Tc为12xl0.M,显然比重组TIMP-3对MMP-1的押制活性要高许多(rTIMP-3 的Ic为12×10.1M).研究表明,TIMP-3对某些肿瘤转移有明显的抑制效应. 此项研究对进一步阐明MMPs和TIMPs在机体内平衡关系的改变对肿瘸浸润转 移的影响作用有着重要的意义. 关键词组织金属蛋白酶抑制日子;基质金属蛋白酶;蛋白纯化 基质金属蛋白酶(matrixmetalloprotei? lqase$,MMPs)是一类编码基因同源依赖金 属zn并以胞外基质(extracellularmatrix, ECM)成分为特异性底物的蛋白分解酶家 族.现已证实,在多种肿瘤组织中,MMPs 的表达明显增加而且与肿瘤的生长转移呈 正相关'.所有MMPs的家族成员都被一 组称为组织金属蛋白酶抑制因子(dssue inhibitorofmetalloproteinases.TIMPs)的蛋 白所抑制.在机体内,活化的MMPs和 TIMPs之问存在一种平衡关系,这一平衡 关系的改变将影响细胞问的浸润.现 在有四种人TIMPs已被克隆,TIMP-1, TIMP-2,TIMP-3和最新发现的TIMP-4. TIMP-1和TIMP-2在体液和组织抽提液中 均有发现,也可为许多培养细胞所分泌. 而TIMP-3却是唯一在胞外基质EMC存在 的成分,不仅数量相对较少而且可能只在 特殊的细胞生理过程中表达.实验表 明,TIMP.1和TIMP-2对肿瘤的生长和转 移具有明显的抑制作用.最近的研究还证 实重组TIMP-3有重要的抗肿瘤作用.既 然TIMP-3是唯一的TIMP家族中的ECM 成分成员,那么分离纯化天然的人 TIMP.3并且对其性质及抗肿瘤作用机制 进行研究就势在必行,这也是本研究进行 的宗旨. 1和方法 1.1材料人胎盘来自沈阳医学院附属 ? l25? 沈阳医学院第3卷 中心医院妇产科;CM52cellulose来自Bio- Rad公司;Sephac~-]S-200来自pharrnacla 公司:抗合成TIMP-3多肽(c末端R179— 188swYRGwAPPDKsIINATDP)的克隆抗 体来自日本富士药品株式会社;MMP一1来 自富士药品研究所;其它试剂均为分析试 剂. 1.2方法人胎盘来源的TIMP-3的纯化 1.2,14M尿素从人胎盘匀浆液中抽提 TIMP一3绞肉机绞碎750g解冻人胎盘,加 人3倍体积含有0.1MNaCI,5mMCaC1:的 30mMTrls—HCI缓冲液(pH8.0),匀浆机 10000r/min匀浆3mln,匀浆液在9000 rpm离心30rain,弃去上清液.继续沉淀 匀浆,再同样方法离心,保留沉淀.此步骤 至少需重复五遍.以除去ECM中可溶性蛋 白组分.随后在沉淀中加人2倍体积的含 有4M尿素的上述缓冲液,用匀浆机匀浆3 min后,在玻璃搅拌器下搅拌过夜.第2 天样品在9000rpm下离心3Omin,弃去沉 淀保留上清,然后透析24h,其间换液3 次.EIA测定含有约2mgTIMP-3.此上 清液称为ECM抽提液.ECM抽提液不能 保存过夜,直接进行下步柱层析. 1.2.2CM52cellulose柱层析CM52层 析柱(4cmXi8cm)均衡后.加人15000 抽提液,流速为100ml/h.样品加毕后 使用相同缓冲液冲洗,直至流出的A低 于0.05.然后使用1MNaCI的样品缓冲 液洗脱该柱.分步收集器收集洗脱液(10 ml/管).每管样品测定A的光吸收并使 用EIA测定每管中的TIMP-3的含量.合 并含有TIMP-3的收集试管,超滤浓缩收集 液至少3O倍. 1.2.3SephacrylS-200柱层析浓缩样 品直接加到sephac~'lS-200层析柱上,该 柱事先已使用0.5MNaCI,5mMCaCI,, 0.叭%B35,30mMTrls—HCI(pH8.0)缓 ? l26? 冲液均衡.A和EIl^检测每一收集试管 (4ml/管).合并含有TIMP一3的蛋白峰的 样品.Centricon一10浓缩最终样品.最后 SDS.PAGE检查纯度.EIA和Western blotting检查TIMP-3的含量及对TIMP-3 定性. 2结果与讨论 2.1CM52Cellulose的洗脱曲线(图1) 1MNaC1洗脱后收集含有TIMP-3的试管 40,50Centncon一10浓缩后加人到 SephacrylS-200柱上.图2表示的是 SephacrylS-200的结果,收集EIA测定. TINP一3含量部分65,95号管,为收集第1 部分.40,6o号管为第2收集部分.分 别浓缩后,进行SDS一聚丙酰胺凝胶电泳和 Westernblotting测定.图3表示的是SDS— PAGE(A)与Westernblotting(B)的结果. Lane1是SephacrylS-200第1收集部分结 果,显示的分子量为24KDa一条蛋白带. Lano2是第2部分收集结果,是分子量为 27KDa的一条蛋白带.Westernblotting实 验结果(B)证明24Kda蛋白带为非糖化的 nTIMP-3,27KDa是糖化的nTIMP-3. 圈1nlaTIMP-3在CM52~tll-al~s~柱层析的诜脱曲线 拄尺寸为4cm×18girl,样品为1,5O0ECM萃取 蒗.洗脱蒗使用1Ml'{aCI的30mMTris?HCI疆冲液(pH 80),从150开始洗脱 ,,一 第3期邹黎明等人胎盘来源的金属蛋白酶抑制N-T--3的分离纯化及性质研究 20406080100 F眦Bol1Nm啪 图2mttlt~,iP-3在sepha唧I8-200凝胶过滤的洗髓曲 娃 柱尺寸为1595cm.样品为6,来自CM52 柱层析洗涤渣的浓缩样品.缓冲浪为含有05MNaCI 5ramCaCI2,0.o】%B8的30ramTfis?BC1(pH8.0) 的缓冲浪~-Az~表示蛋自古量0-^裹示E方法 T1MP.3古量 ?一 '一 '一 ?一 一 ^? 12, 雷317,%SI)S?聚丙醴胺凝胶电泳对纯化TIMP-3的 分析结果 A为12%SOSaPAGE结果B为免疫印迹分析结果 2.2整个分离纯化TIMP-3过程的 (表1) 2.3纯化的TIMP-3对MMP一1的抑制活 性人胎盘来源纯化的nTIMP-3对MMP?1 有明显的抑制活性.使用荧光测定技 表1^眙盘来源的l~,lP-3的分离纯化 术J,非糖化TIMP-3对MMP一1的IC?= 1.2×10.M ,而糖化TIMP一1的IC5.=1.1 ×10...M.它们对MMP一1的抑制作用明 显大于重组TIMP一1的抑制作用(IC=8. 0×10M). TIMPs家族由四个成员组成:l983年 发现的TIMP.1;1989年发现的TIMP-2; 1992年发现的TIMP-3;和一个最新成员 TIMP-4.四种TIMPs成员可与MMPs形 成牢固的复台物,从而抑制MMPs的活性. 与其它水溶性TIMPs不同,TIMP-3是唯一 的与ECM结合的TIMP本研究实验就是 从人胎盘ECM中完全纯化分离了nTIMP一 3.证明人胎盘来源的TIMP一3是由两种分 子量为24KD的非糖基化蛋白和分子量为 27KD的糖基化蛋白组成.同时制备了 TIMP-3单克隆抗体并建立了TIMP-3酶联 免疫测定方法. 纯化的糖基化与非糖基化TIMP-3对 MMP.1均有明显的抑制活性并大于重组 的TIMP-3.其等电点pI为9.0左右.实 验证明,重组基因的肿瘤细胞植人动物体 内后,肿瘤细胞分泌的TIMP-3抑制该肿瘤 的生长.推测其抑制机理可能是TIMP-3 阻止了ECM生长因子的释放或抑制了肿 瘤的生长部位的新血管生成,因为TIMP-3 的表达并不能抑制在体外培养的此种肿瘤 的生长. 此项研究对进一步阐明MMPs和 TIMP-3在机体内平衡关系的改变对肿瘤 浸润转移的影响作用有着重要意义. ? l27. 沈阳医学院第3卷 参考文献 IRayJMSk'_j_steWCTh*eofmatrixmet- 且u.pl恤imandtheirinhIt.碍inmrinv~ion, metastasisandaaglogenesisEurResplrJ.1994;(7): 2062 2ApteSS,01啷IBR.MurphyG"rhee咖c仙陀0f tissueinhihitc~0fmetalloproteinases"dilzis}fihltory aetlvid~definethedistinct"lIMPgenere,rally.】Bid Chem.1995;270:14313 3D曲DA.sIIiYE.SangQ^conIpDsid.n一 quen~ana]ysisofthetissueinh[bit~mek,dlovrotein— asefianily.JProChem.1997;16:237 4SunY.HegamyerC.KimH.da1.Moleealarcloning0f m0uBe6esIIeinhthit~0fmets]]oproteinoze-3andits promoterJBiMChm.1995;270:19312 5sleller-Stevem~onWC.AmavomSaS.UouaLA TuroOIl!cellinnl一ththeextm:dlularmatrix daringinv~ionaadmetastasis.^nTIuRevCellBld 1993;(9):541 6OhuehiE,I?啪L.FujiiY.眈81Memba~etypel rMxmetalloprotelm~~dminterstitialcollagensm otherextraeellul~T口xmaer~moleeules.JBiolChem 1997;272:2440 7TameiH,^zu一0I.1wataK.et81One-Btepsand一 ,,ichenzymei舢删yBforhumanragtfixmebPo^ teln~el3usingtao~loml衄bo出.C"/'is— Bue.1998;30:l5 (2001一?一2l收稿) PurificationandCharacteristicSmdyofNativeTissuelnhibRorsof Metalloprotelaase-3fromHumanPlacenta Zou肪,lg,XuJun,Luo,lg,etal (h~tituteofBi~ctiwtyMatefi~.Shenya~gMedicalCdlege.Sheny~ngl10031) Abslra~tObjecljveThenativetissueinhibitorofmetalloproteibase?3(nTIMP-3)WSflpar/il ealfmmhu- mplacentaandnhTIMP?3EnzymeImmurtoassaymfomadedMethodnhTIMP一 3purifiedbyusingan ureaextractiontechniquefoUowedbysaceessivecllro盯l憎 toI;aphyinCM52ceUoseandS~phactylS.200col- umn.Results1hepooledfractionsgave98%purityofnhTIMP-3willlm.lecularwei#t24Kdai nSDSaPAGE andgave3200puriliedfoldand23.4%recovery.Andalsogavea~otherproteinbandthmW'27 KdsinSDS? PAGE.Westernblottingverifiedthatproteinwith24KdsisungtyeosylatednhTIMP-3,27Kd sisglyoc~ylated nhTIMP?3.Cone.h~onsItmeansthatnhTIMP-3isoltek/ridofproteinwithpa~ial出 eosylatlon.Bothofnh "lIMP?3are曲 Ietobedet.dbyzm(Emelmmurtoassay).ThepuriiiednhTIMP-3evidenflyinhibitedMaa trixMetalloproteibases一 1(MMP-1)aetivltyanditsinhibitionm.qumttitatlvelythanp~fiedthTIMP-3. Keywordstissueinhibitomofmeta]loproteinases(TIMPs);mflllrixmetalloproteirmses(MMPs);pro- teibpurification ? 128?