反相高效液相色谱法测定香砂养胃丸中γ-氨基丁酸含量

反相高效液相色谱法测定香砂养胃丸中γ-氨基丁酸含量 反相高效液相色谱法测定香砂养胃丸中γ- 氨基丁酸含量 2010年第l9卷第l5期药物鉴定 反相高效液相色谱法测定香砂养胃丸中一氨基丁酸含量 陈逸,陈文秋,余敏灵,余施筱,潘建 (1.四川省第四人民医院,四川成都610016;2.四川省乐山食品药品检验所,四川乐 山614000) 摘要:目的建立测定香砂养胃丸中一氨基丁酸含量的反相高效液相色谱法.在 碱性条件下,氨基酸与异硫氰酸苯酯反应生成异硫 氰酸苯一氨基酸的衍生物,采用Venusil—AA氨基酸分析柱(250mm× 4.6mm,5p,m),二元梯度洗脱方式,流动相A为0.05mol/L醋酸钠 溶液(pH=6.5)一乙腈(95:5),流动相B为乙腈一水(80:20),波长248nm.结果一 氨基丁酸质量浓度在2.252—13.512p.g/mL 范围内与峰面积有较好的线性关系,平均加样回收率为98.04%,RSD=0.97%(n=6).结论所用方法结果准确,被测溶液稳定性良好, 可用于香砂养胃丸中^v一氨基丁酸的含量测定. 关键词:柱前衍生;反相高效液相色谱法;香砂养胃丸;一氨基丁酸;含量测定 中图分类号:11284.1;R286.0文献标识码:A文章编号:1006—4931(2010)15—0025 —02 ContentDetermination0f—AminobutyricAcidinXiangshaYangweiPills ChenYi,ChenWenqiu,YuMinlingz,YuShixiao,PanJian (1.SichuanProvinc&lFourthPeoplesHospital,ChengduSwhua~China610016;2.Le shanInstituteforFoodandDrugContro1.LeshaSwhua~China614000) Abstract:ObjectiveToestablishthedeterminationmethodof一 aminobutyricacidinXiangshaYangweiPills.MethodsInalkalinecon— dition,aminoacidsreactedwithphenylisothiocyanatcandresultedinthederivativesofbenze neisothiocyanate—aminoacidcomplex.A Venusil—AAaminoacidanalysiscolumn(250mmx4.6mm,5lxm)wasusedandtheabsorbanceat248n mwasmeasured.Themobile phaseAwas0.05mol/Lsodiumacetatesolution(pH=6.5)一acetonitrile(95:5)andthemobilephaseBwasacetonitrile—water(80:20). ResultsIntherangeof2.252—13.512Ixg/mL,thecontentof一aminobutyricacidhadthegoodlinearrelationshipwiththeareaof elutedpeak,andtherecoveryratewas98.04%,RSD:0.97%(n:6).ConclusionThismethodisa ccurateandreproduciblefordeter- miningthecontentof^y—aminobutyricacidinXiangshaYangweiPills. Keywords:Pre—columnderivatization;RP—HPLC;XiagshaYangweiPills;一aminobutyricacid;contentdetermination 香砂养胃丸是收载于2005年版《中国药典(一部)》的中药成方 制剂,主要功效是温中和胃,用于胃阳不足,湿阻气滞所致胃痛,痞 满,症见胃痛隐隐,脘闷不舒,呕吐酸水,嘈杂不适,四肢倦怠….处 方中的法半夏是富含氨基酸的中药材,所含一氨基丁酸具有多 种生理作用,如临时性降压】,对胰腺癌细胞SW1990细胞生长及 血管内皮细胞生长因子(VEGF)达的影响[31,以及调控哺乳动物 袁4样品含量测定结果 酸的含量,其原理是鞣质和非鞣质都能与多种金属离子(如铅,铜, 铋等)生成沉淀(为多元酚与金属离子形成的多核络合物),其中锌 离子对鞣酸具有较高选择性,能与鞣质1:1生成沉淀,且锌和鞣 酸极易溶于水,故可以水为溶出介质,锌滴定液为沉淀剂,过量的 锌离子用EDTA—Na:作络合剂滴定,以铬黑T作指示剂,采用间 接络合滴定法测定鞣酸含量.鞣柳硼三酸散中水杨酸和硼酸难溶 于水,均不与沉淀剂,络合剂发生反应,笔者采用水溶解后络合滴 定的方法测定鞣酸含量,操作简单,结果准确. 鞣酸是多元酚,故应在碱性条件下进行沉淀反应,而锌与 EDTA—Na络合反应也应在碱性条件下进行.在络合滴定过程中, 随着滴定剂与金属离子反应生成相应的络合物,溶液的酸度会逐 渐增高,溶液pH的改变可能导致酸效应,影响主反应的进程;而络 合滴定中使用的金属指示剂的颜色变化也受溶液pH的影响,因此 络合滴定中常加入缓冲溶液,以维持滴定体系酸度基本不变.本试 中国药业ChinaPharmacecticals 的摄食和味觉"等.因此,一氨基丁酸含量的多少与香砂养胃丸的 药理作用有密切的关系,但在众多的文献中没有对其含量测定的相 关报道.笔者采用柱前衍生反相高效液相色谱法对该成药中的.y一 氨基丁酸含量进行测定,建立了较完善的测定方法,现报道如下. 1仪器与试药 美国Waters2695型高效液相色谱仪;2487型紫外检测器; 验采用pH为1O的氯化铵一氨水溶液缓冲体系控制酸度,沉淀稳 定,络合完全. 除一价的碱金属离子外,乙二胺四乙酸(EDTA)能与绝大多数 金属离子形成稳定的络合物.由于多数金属离子的配位数为4和 6,在一般情况下,EDTA与金属离子几乎都能形成1:1的络合物. 本试验中鞣酸与锌离子也发生1:1沉淀,鞣酸分子式是C,H:0, 相对分子质量为1701.23,因此0.05mol/L的锌滴定液对鞣酸的 滴定度为8.5059g/L.由于EDTA与金属离子可形成具有多个五 元环的螯合物,螯合物的稳定性高,从而保证了滴定反应很完全, 而且络合反应的速率快,除Al,cr,Ti等金属离子外,一般都能迅速 完成. 参考文献: [1]WS一10001一(HD一1007)一2002,国家药品?化学药品地方标准 上升国家标准(第十册)[s】.? 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(收稿日期:2009—08—13) ? 25? 药物鉴定 Empower色谱工作站;美国VarianCary100型紫外可见分光光度 计.香砂养胃丸样品(太极集团四川绵阳制药有限公司,批号分别 为55080001,55080007,55080011).一氨基丁酸(成都市科龙化工 试剂厂,批号为20021101,含量大于99.0%);异硫氰酸苯酯(北分 瑞利集团,批号为AAD06001);乙腈(上海陆都化学试剂厂,色谱 纯);其他试剂均为分析纯. 2方法与结果 2.1色谱条件 色谱柱:Venusil—AA氨基酸 分析柱(250mm×4.6mm,5p.m); 流动相:A为0.05mol/L醋酸钠溶 液(pH:6.5)一乙腈(95:5),B为 乙腈一水(80:2O),洗脱梯度见表1; 流速:1.00mL/min;检测波长: 248nm;柱温:25?;进样量:5L. 2.2溶液制备 表1洗脱梯度表 时in)塑 精密称取一氨基丁酸0.02252g,置200mL量瓶中,加盐酸 溶液(0.1mol/L)适量使溶解后,加盐酸溶液稀释至刻度,摇匀,作 为对照品贮备液I;精密量取25mL,置100mL量瓶中,加盐酸溶液 (0.1mol/L)稀释至刻度,摇匀,作为对照品贮备液?.取香砂养 胃丸样品(批号为55080001)适量,研细,精密称取10.0013g,置具 塞锥形瓶中,加80%的甲醇200mL,称定质量,5O?超声处理 30rain,放冷,再称定质量,加80%的甲醇补足减失的质量,摇匀, 滤过,取续滤液100mL,水浴蒸干,残渣加盐酸溶液(0.1mol/L) 适量溶解,并转移至5mL量瓶中,加盐酸溶液(0.1mol/L)稀释至 刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品贮备液.取除法半夏外的处 方量药材(由乐山康发药业股份有限公司提供),按上述方法操作, 即得阴性对照品贮备液. 2.3样品衍生化 精密量取供试品贮备液适量(20,400),置1mL量瓶中, 加异硫氰酸苯酯一乙腈溶液(25:2000,/V)200L,用三乙胺一 乙腈溶液(1.4:8.6)稀释至刻 度,摇匀,放置1h,转移至试管 中,加正己烷1mL,振摇,分取 下层液体,滤过,取续滤液作为 被测溶液. 2.4检测波长选择 取200乩对照品贮备液I, 按2.3项下衍生化后,取续滤液 于200—400I'lm波长范围内扫 描,结果该溶液在248nm波长 处有最大吸收,故选择248nm 为检测波长. 2.5方法学考察 系统适用性试验:分别取 400供试品贮备液I,8OL 对照品贮备液和400乩阴性对 照品贮备液,按2.3项下衍生 化后,取续滤液照2.1项下色 谱条件分别进样,高效液相色 谱图见图1.供试品溶液色谱图 中,有与对照品溶液色谱图中 ? 26? 0 O AU O15.030.045.0 A 0J5030.045.0 C 1.^y一氨基丁酸 A.阴性对照品溶液 B.对照品溶液 C.供试品溶液 图1高效液相色谱图 2010年第19卷第l5期 一 氨基丁酸色谱峰相对应的色谱峰,且与其他色谱峰的分离度大 于1.5,理论板数为31590.而阴性对照品溶液无此色谱峰. 线性关系考察:精密量取2O,40,80,100,120L对照品贮备 液I,分别置1mL量瓶中,按2.3项下衍生化后,取续滤液照上述 色谱条件测定,以一氨基丁酸质量浓度(c)与色谱峰峰面积(A) 进行线性回归,得回归方程A=5172C一107.5,r=0.9998(,I= 5).结果表明,一氨基丁酸质量浓度在2.252—13.512~g/mL范 围内,即进样量在0.O1127,0.06756g范围内与峰面积有较好 的线性关系. 精密度试验:精密量取200IxL对照品贮备液I,按2.3项下衍 生化后,取续滤液照上述色谱条件连续进样5次.测得峰面积平均 值为778523,RSD为0.8%(/7.=5). 重复性试验:精密量取400L供试品贮备液6份,分别置6个 1mL量瓶中,按2.3项下衍生化后,取续滤液照上述色谱条件测 定.结果平均峰面积为.339823,RSD为0.9%(n=6). 加样回收试验:取已知含量的香砂养胃丸样品(批号为 55080001)6份,每份约5g,精密称定,研细,转移至6个具塞锥形 瓶中,分别精密加入1.0,1.0,2.5,2.5,5.0,5.0mL对照品贮备液?, 照2.2项下供试品贮备液制备方法制备溶液,取400L,按2.3项 下衍生化后,滤过,照上述色谱条件测定,计算回收率.结果见表2. 表2一氨基丁酸的加样回收试验结果(n=6) 取样量(g)样品舍量()加入量(}培)剥得量()回收率(%)(%)脚(%) 稳定性试验:取同一供试品贮备液的续滤液,分别在O,2,6,12h 时进样,测得3组样品溶液在各时间点的色谱峰面积变化的RSD 值分别为0.5%,0.8%,1.1%,表明样品溶液在室温条件下12h 内稳定,能满足含量测定. 26样品含量测定 取香砂养胃丸样品适量,研细,照2.2项下供试品贮备液制备 方法制备溶液,取400,置1mL量瓶中,按2.3项下衍生化后, 取续滤液照上述色谱条件测定.结果批号为55080001,55080007, 55080017的3批样品中,一氨基丁酸含量分别为0.016,0.017, 0.019mg/g(n=3). 3讨论 在试验中加入正己烷的目的是除去样品提取和衍生化反应后 被测溶液中的脂溶性物质.该方法在一定质量浓度范围内,被测物 质溶液质量浓度与色谱峰面积有较好的线性关系,被测溶液稳定, 准确度高,可作为香砂养胃丸中一氨基丁酸的含量测定方法. 参考文献: [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M】.北京:化学工业出 版社.2005:525. 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