医学毕业论文地塞米松、苯巴比妥钠和利多卡因对昆明种小鼠肝p4503a酶的影响

医学毕业论文地塞米松、苯巴比妥钠和利多卡因对昆明种小鼠肝p4503a酶的影响 X X 大学 毕业论文 地塞米松、苯巴比妥钠和利多卡因对昆明种小鼠肝P4503A酶 的影响 姓 名:__________ 2014年6月25日 地塞米松、苯巴比妥钠和利多卡因对昆明种小鼠肝P4503A酶的影响 作者:李平 程建峰 陈东鸿 贺建荣 藤树宝 仲崇华 刁亚英 贺平 【关键词】 地塞米松 关键词: 地塞米松;苯巴比妥钠;利多卡因;肝P4503A酶;小鼠 摘 要:目的 研究地塞米松、苯巴比妥钠和利多卡因预处理的昆明种小鼠 P4503A酶有无诱导作用及其作用机制. 方法 给昆明种小鼠腹腔注射常用量地 塞米松、苯巴比妥钠或利多卡因1wk后，观察MEGX累积排泄量、P4503A酶 蛋白含量及其mRNA达的改变. 结果 与正常对照组相比，地塞米松组小鼠 MEGX累积排泄量增加35.0%(P0.05)，P4503A酶蛋白含量增加147.1%(P0.01); 苯巴比妥钠小鼠MEGX累积排泄量增加23.4%(P0.05)，酶蛋白含量增加43.6% (P0.01);各组间P4503A酶mRNA表达无明显差别. 结论 地塞米松和苯巴比 妥钠对昆明种小鼠肝P4503A酶有诱导作用，该作用位于转录后水平;利多卡因对 昆明种小鼠肝P4503A酶无影响. Keywords:dexamethasone;phenobarbital;lidocaine;hepatic P4503A enzyme;mice Abstract:AIM To study the induction of dexamethasone，phenobarbital and lidocaine on hepatic P4503A enzyme in Kunming mice.METHODS After administering ip a non-toxic dose of dexamethasone，phenobarbital or lidocaine to Kunming mice for7d，the urinary recovery of MEGX，a spe-cial lidocaine metabolite catalyzed by hepatic P4503A en-zyme，the content of hepatic P4503A enzyme and its mRNA expression were analyzed by TDX，ELISA and RT-PCR techniques.RESULTS In comparison with mice as control，the urinary recovery of MEGX increased by35.0%and23.4%(P0.05);and the content of hepatic P4503A en-zyme increased by147.1%and43.6%(P0.01)in mice pretreated with dexamethasone or phenobarbital， respective-ly，but not mRNA nor the pretreatment with lidocaine.CONCLUSION The pretreatment with dexamethasone and phenobarbital may induce hepatic P4503A enzyme，which oc-curs at post-transcription level，but lidocaine did not. 0 引言 地塞米松和苯巴比妥钠是经典的肝微粒体P450氧化酶诱导剂，对人体及 多种实验动物肝药酶具有诱导作用.但是，近年来的研究发现，在不同实验动物， 甚至是同一动物的不同种系，其诱导作用不尽相同.另外，肝药酶诱导剂的作用 机制在不同动物也不相同，有的在转录水平，有的则在转录后水平，或者只是改 变原有酶蛋白的空间构象，影响其活性,1, . P4503A酶是肝脏中含量最丰富的P450形式，可高达P450总量的60%. 主要通达C-或N-脱烃、C-羟化反应，参与药物、毒物和致癌物的代谢.绝大多数 有首过效应药物的代谢涉及P4503A酶,2, ，利多卡因代谢产物单乙基甘胺酰 二甲苯胺(MEGX)是P4503A酶的特异性代谢产物,3, ，但是，利多卡因、 地塞米松和苯巴比妥钠对昆明种小鼠肝P4503A酶有无诱导作用，机制何在，未 见报道.我们采用利多卡因试验、肝P4503A酶含量及其mRNA表达为指标，研 究了地塞米松、利多卡因和苯巴比妥钠对昆明种小鼠肝微粒体P4503A酶的诱导 作用及其作用机制. 1 和方法 1.1 材料 苯巴比妥钠，上海新亚药业公司生产，批号9501121;利多卡因， 上海旭东海普药业有限公司生产，批号9802022;甘草酸，江苏天晴制药厂生产， 批号9608071;CYP4503A酶ELISA试剂盒，购于Amer-sham Pharmacia Biotech UR公司;PCR试剂盒，购于MRI公司;柱离心式胶回收试剂盒，购于华顺生物试剂公 司;MEGX第二军医大学药学院药化教研室李克教授馈增;PCRmark，购于华美生物工程公司，其余试剂均为国产分析纯或优级纯.P/ACE5000型毛细管电泳仪，美国Beckman公司制造;GA2400型PCR仪，PE公司制造;EL-808型酶标仪，美国Bio-Tek公司制造;SCR-300型电泳仪，上海万达生物工程公司制造;ZF-1型紫外透射分析仪，上海长明电子仪器厂生产.昆明种小白鼠，雄性，体质量(20?2.0)g，购于中科院上海实验动物中心，清洁级，证书号:005.给予标准化光照及饮食.毛细管:长57cm，有效长度50cm，直径59μm;电解液;50mmol L-1 硼酸缓冲液(pH=8.4);电压:1500V;电流:9.4,11.6μA;温度:23?;检测波长:214nm;内标:氨茶碱. 1.2 方法 1.2.1 利多卡因试验 小鼠36只，随机分成4组，每组9只.A组给予2g L-1 苯巴比妥钠0.5mL，B组给予0.8g L-1 利多卡因注射液0.5mL，C组给予0.2g L-1 地塞米松0.5mL;D组为正常对照组，给予等量生理盐水，ip，1次/d.连续诱导1wk后，ip2g L-1 利多卡因40mg kg -1 ，将小鼠置于玻璃代谢笼中，收集5h尿液.测量尿液体积后，-20?保存.解剖肝脏，分成二等份，-80?保存.取尿液0.2mL，加0.1mol L -1 醋酸钠缓冲液(pH=5.0)0.18mL，8.33g L-1 氨茶碱10μL和β葡萄糖醛酸-硫酸酶20μL，37?反应18h.加甲醇0.2mL，10000g离心15min，取上清液，高效毛细管电泳测定MEGX含量. 1.2.2 小鼠肝微粒体P4503A酶含量测定 取-80?保存的肝组织0.30g，加TMS缓冲液1.7mL，匀浆，10000g离心15min;取上清液，加适量TMS，100000g，4?，离心60min;取沉淀，加TMS缓冲液后，匀浆，1mL含肝组织0.1g，-20?保存.用CYP4503A ELISA试剂盒测定P4503A酶蛋白的含量. 1.2.3 小鼠肝P4503A酶mRNA表达研究 取-80?保存的小鼠肝组织约0.5g，用文献报道方法,4, ，抽提肝细胞总mRNA，逆转录cDNA，PCR扩增目的片段.20g L-1 琼脂糖电泳，紫外透射仪下比较0.7kb条带的亮度，并回收该 性内切酶酶解，再次20g L-1 琼脂糖电泳后，观察0.7kb的片段.用PST1限制 条带是否被分解成300和400bp的二条带. 统计学处理:所有定量资料用x ?s表示，采用单因素方差分析和Duncan法组间两两比较，进行显著性检验. 2 结果 经地塞米松、苯巴比妥钠和利多卡因预处理1wk后，地塞米松组和苯巴比妥钠组小鼠5h尿液中MEGX累积排泄量和肝微粒体P4503A酶含量明显增加，与正常对照组相比，差别显著(P0.05)或非常显著(P0.01).利多卡因组小鼠MEGX和肝P4503A酶含量无明显改变(Tab1).正常对照组小鼠肝P4503A酶mRNA含量与其余3组小鼠无明显差别(Fig1)，经PST1限制性内切酶水解后，目的片段分解成300与400bp二个片段，证明与P4503A酶基因序列一致(Fig2). 表1 地塞米松、苯巴比妥钠和利多卡因预处理对昆明种小鼠MEGX和P4503A酶含量的影响 略 图1 略 3 讨论 MEGX是肝微粒体P4503A酶的特异性代谢产物.腹腔或静脉注射利多卡因后，其经血流至肝脏，在肝微粒体混合功能氧化酶3A催化下，氧位去乙基，生成MEGX，然后经肾脏排出体外.因此，小鼠腹腔注射利多卡因后，测定比较尿液中MEGX含量，能反映小鼠肝微粒体P4503A酶的活性. 图2 略 苯巴比妥钠和地塞米松作为诱导剂，在肝药酶研究中应用十分广泛,5, .但用于昆明种小鼠，研究肝微粒体P4503A酶活性和基因表达，作者未见有文献报道.我们分别用地塞米松、苯巴比妥钠和利多卡因进行预处理，研究其对昆明种小鼠利多卡因代谢、P4503A酶蛋白含量及其mRNA表达的影响.实验结果显 示，与正常对照组相比，利多卡因组小鼠MEGX累积排泄量和P4503A酶蛋白 含量均无明显改变，说明利多卡因不是昆明种小鼠P4503A酶诱导剂，无代谢自 诱导作用，苯巴比妥钠使昆明种小鼠尿液中MEGX含量增加23.4%，肝P4503A 酶含量增加43.6%.地塞米松预处理后，尿液MEGX累积排泄量增加35.0%， P4503A酶含量增加147.1%.上述结果表明，地塞米松和苯巴比妥钠能促进昆明 种小鼠对利多卡因的代谢，其诱导作用不仅是增强P4503A酶的活性，而且增加 了肝微粒体P4503A酶蛋白的含量. 另外，实验结果还表明，昆明种小鼠在非诱导状态下，其P4503A酶mRNA 呈高表达，无论使用地塞米松还是苯巴比妥钠诱导，其mRNA表达并不增加， 说明地塞米松与苯巴比妥钠对昆明种小鼠P4503A酶的诱导作用在转录后水平. 参考文献: ,1,Frank J G.Molecular genetics of the P-450superfamily ,J,.Pharm Ther， 1990;45:1-38. ,2,Ju MH，Li Y.Effects of cytochrome P-450isoenzyme in the metabolism course of exogenous ,J,.Guowai Yixue Yaoxue Fence(For Med Sci Pharm)， 1998;25(4):218-224. ,3,Reichel C，Nacke A，Sudhop T，Wienkoop G.The low-dose monoethylglycinexylidide test ,J,.Hepatology，1997;25(6):1323-1327. ,4,Goodwin B，Liddle C，Murray M.Effects of metyrapone on ex-pression of Cyps2C11，3A2and other3A，genes in rat hepato-cytes cultured on matrigel ,J,.Biochem Pharm，1996;52(2):219-227. ,5,Nelson DR.Koymans L，Kamatahi T.P450superfamily，up-date in new sequences，gene mapping，accession numbers and nonenclature ,J,.Pharmacogenetics，1996;6(1):1-42. 编辑 王小仲 1 第四军医大学唐都医院药学部，陕西西安710038， 2 第二军医大学东方肝胆外科研究所，上海200438 作者简介: 李 平(1952-)，女(汉族)，黑龙江省呼兰县人.副主任药师.Tel. (029)3577716 研究原著 地塞米松、苯巴比妥钠和利多卡因对昆明种小鼠肝P4503A酶的影响 李平 程建峰 陈东鸿 贺建荣 藤树宝 仲崇华 刁亚英 贺平 关键词: 地塞米松;苯巴比妥钠;利多卡因;肝P4503A酶;小鼠 摘 要:目的 研究地塞米松、苯巴比妥钠和利多卡因预处理的昆明种小鼠 P4503A酶有无诱导作用及其作用机制. 方法 给昆明种小鼠腹腔注射常用量地 塞米松、苯巴比妥钠或利多卡因1wk后，观察MEGX累积排泄量、P4503A酶 蛋白含量及其mRNA表达的改变. 结果 与正常对照组相比，地塞米松组小鼠 MEGX累积排泄量增加35.0%(P0.05)，P4503A酶蛋白含量增加147.1%(P0.01); 苯巴比妥钠小鼠MEGX累积排泄量增加23.4%(P0.05)，酶蛋白含量增加43.6% (P0.01);各组间P4503A酶mRNA表达无明显差别. 结论 地塞米松和苯巴比 妥钠对昆明种小鼠肝P4503A酶有诱导作用，该作用位于转录后水平;利多卡因对 昆明种小鼠肝P4503A酶无影响. Keywords:dexamethasone;phenobarbital;lidocaine;hepatic P4503A enzyme;mice Abstract:AIM To study the induction of dexamethasone，phenobarbital and lidocaine on hepatic P4503A enzyme in Kunming mice.METHODS After administering ip a non-toxic dose of dexamethasone，phenobarbital or lidocaine to Kunming mice for7d，the urinary recovery of MEGX，a spe-cial lidocaine metabolite catalyzed by hepatic P4503A en-zyme，the content of hepatic P4503A enzyme and its mRNA expression were analyzed by TDX，ELISA and RT-PCR techniques.RESULTS In comparison with mice as control，the urinary recovery of MEGX increased by35.0%and23.4%(P0.05);and the content of hepatic P4503A en-zyme increased by147.1%and43.6%(P0.01)in mice pretreated with dexamethasone or phenobarbital， respective-ly，but not mRNA nor the pretreatment with lidocaine.CONCLUSION The pretreatment with dexamethasone and phenobarbital may induce hepatic P4503A enzyme，which oc-curs at post-transcription level，but lidocaine did not. 0 引言 地塞米松和苯巴比妥钠是经典的肝微粒体P450氧化酶诱导剂，对人体及 多种实验动物肝药酶具有诱导作用.但是，近年来的研究发现，在不同实验动物， 甚至是同一动物的不同种系，其诱导作用不尽相同.另外，肝药酶诱导剂的作用 机制在不同动物也不相同，有的在转录水平，有的则在转录后水平，或者只是改 变原有酶蛋白的空间构象，影响其活性,1, . P4503A酶是肝脏中含量最丰富的P450形式，可高达P450总量的60%. 主要通达C-或N-脱烃、C-羟化反应，参与药物、毒物和致癌物的代谢.绝大多数 有首过效应药物的代谢涉及P4503A酶,2, ，利多卡因代谢产物单乙基甘胺酰 二甲苯胺(MEGX)是P4503A酶的特异性代谢产物,3, ，但是，利多卡因、 地塞米松和苯巴比妥钠对昆明种小鼠肝P4503A酶有无诱导作用，机制何在，未 见报道.我们采用利多卡因试验、肝P4503A酶含量及其mRNA表达为指标，研 究了地塞米松、利多卡因和苯巴比妥钠对昆明种小鼠肝微粒体P4503A酶的诱导 作用及其作用机制. 1 材料和方法 1.1 材料 苯巴比妥钠，上海新亚药业公司生产，批号9501121;利多卡因， 上海旭东海普药业有限公司生产，批号9802022;甘草酸，江苏天晴制药厂生产， 批号9608071;CYP4503A酶ELISA试剂盒，购于Amer-sham Pharmacia Biotech UR公司;PCR试剂盒，购于MRI公司;柱离心式胶回收试剂盒，购于华顺生物试剂公 司;MEGX第二军医大学药学院药化教研室李克教授馈增;PCRmark，购于华美生 物工程公司，其余试剂均为国产分析纯或优级纯.P/ACE5000型毛细管电泳仪，美国Beckman公司制造;GA2400型PCR仪，PE公司制造;EL-808型酶标仪，美国Bio-Tek公司制造;SCR-300型电泳仪，上海万达生物工程公司制造;ZF-1型紫外透射分析仪，上海长明电子仪器厂生产.昆明种小白鼠，雄性，体质量(20?2.0)g，购于中科院上海实验动物中心，清洁级，证书号:005.给予标准化光照及饮食.毛细管:长57cm，有效长度50cm，直径59μm;电解液;50mmol L-1 硼酸缓冲液(pH=8.4);电压:1500V;电流:9.4,11.6μA;温度:23?;检测波长:214nm;内标:氨茶碱. 1.2 方法 1.2.1 利多卡因试验 小鼠36只，随机分成4组，每组9只.A组给予2g L-1 苯巴比妥钠0.5mL，B组给予0.8g L-1 利多卡因注射液0.5mL，C组给予0.2g L-1 地塞米松0.5mL;D组为正常对照组，给予等量生理盐水，ip，1次/d.连续诱导1wk后，ip2g L-1 利多卡因40mg kg -1 ，将小鼠置于玻璃代谢笼中，收集5h尿液.测量尿液体积后，-20?保存.解剖肝脏，分成二等份，-80?保存.取尿液0.2mL，加0.1mol L -1 醋酸钠缓冲液(pH=5.0)0.18mL，8.33g L-1 氨茶碱10μL和β葡萄糖醛酸-硫酸酶20μL，37?反应18h.加甲醇0.2mL，10000g离心15min，取上清液，高效毛细管电泳测定MEGX含量. 1.2.2 小鼠肝微粒体P4503A酶含量测定 取-80?保存的肝组织0.30g，加TMS缓冲液1.7mL，匀浆，10000g离心15min;取上清液，加适量TMS，100000g，4?，离心60min;取沉淀，加TMS缓冲液后，匀浆，1mL含肝组织0.1g，-20?保存.用CYP4503A ELISA试剂盒测定P4503A酶蛋白的含量. 1.2.3 小鼠肝P4503A酶mRNA表达研究 取-80?保存的小鼠肝组织约0.5g，用文献报道方法,4, ，抽提肝细胞总mRNA，逆转录cDNA，PCR扩增目的片段.20g L-1 琼脂糖电泳，紫外透射仪下比较0.7kb条带的亮度，并回收该片段.用PST1限制 性内切酶酶解，再次20g L-1 琼脂糖电泳后，观察0.7kb的条带是否被分解成300和400bp的二条带. 统计学处理:所有定量资料用x ?s表示，采用单因素方差分析和Duncan法组间两两比较，进行显著性检验. 2 结果 经地塞米松、苯巴比妥钠和利多卡因预处理1wk后，地塞米松组和苯巴比妥钠组小鼠5h尿液中MEGX累积排泄量和肝微粒体P4503A酶含量明显增加，与正常对照组相比，差别显著(P0.05)或非常显著(P0.01).利多卡因组小鼠MEGX和肝P4503A酶含量无明显改变(Tab1).正常对照组小鼠肝P4503A酶mRNA含量与其余3组小鼠无明显差别(Fig1)，经PST1限制性内切酶水解后，目的片段分解成300与400bp二个片段，证明与P4503A酶基因序列一致(Fig2). 表1 地塞米松、苯巴比妥钠和利多卡因预处理对昆明种小鼠MEGX和P4503A酶含量的影响 略 图1 略 3 讨论 MEGX是肝微粒体P4503A酶的特异性代谢产物.腹腔或静脉注射利多卡因后，其经血流至肝脏，在肝微粒体混合功能氧化酶3A催化下，氧位去乙基，生成MEGX，然后经肾脏排出体外.因此，小鼠腹腔注射利多卡因后，测定比较尿液中MEGX含量，能反映小鼠肝微粒体P4503A酶的活性. 图2 略 苯巴比妥钠和地塞米松作为诱导剂，在肝药酶研究中应用十分广泛,5, .但用于昆明种小鼠，研究肝微粒体P4503A酶活性和基因表达，作者未见有文献报道.我们分别用地塞米松、苯巴比妥钠和利多卡因进行预处理，研究其对昆明种小鼠利多卡因代谢、P4503A酶蛋白含量及其mRNA表达的影响.实验结果显 示，与正常对照组相比，利多卡因组小鼠MEGX累积排泄量和P4503A酶蛋白 含量均无明显改变，说明利多卡因不是昆明种小鼠P4503A酶诱导剂，无代谢自 诱导作用，苯巴比妥钠使昆明种小鼠尿液中MEGX含量增加23.4%，肝P4503A 酶含量增加43.6%.地塞米松预处理后，尿液MEGX累积排泄量增加35.0%， P4503A酶含量增加147.1%.上述结果表明，地塞米松和苯巴比妥钠能促进昆明 种小鼠对利多卡因的代谢，其诱导作用不仅是增强P4503A酶的活性，而且增加 了肝微粒体P4503A酶蛋白的含量. 另外，实验结果还表明，昆明种小鼠在非诱导状态下，其P4503A酶mRNA 呈高表达，无论使用地塞米松还是苯巴比妥钠诱导，其mRNA表达并不增加， 说明地塞米松与苯巴比妥钠对昆明种小鼠P4503A酶的诱导作用在转录后水平. 参考文献: ,1,Frank J G.Molecular genetics of the P-450superfamily ,J,.Pharm Ther， 1990;45:1-38. ,2,Ju MH，Li Y.Effects of cytochrome P-450isoenzyme in the metabolism course of exogenous ,J,.Guowai Yixue Yaoxue Fence(For Med Sci Pharm)， 1998;25(4):218-224. ,3,Reichel C，Nacke A，Sudhop T，Wienkoop G.The low-dose monoethylglycinexylidide test ,J,.Hepatology，1997;25(6):1323-1327. ,4,Goodwin B，Liddle C，Murray M.Effects of metyrapone on ex-pression of Cyps2C11，3A2and other3A，genes in rat hepato-cytes cultured on matrigel ,J,.Biochem Pharm，1996;52(2):219-227. ,5,Nelson DR.Koymans L，Kamatahi T.P450superfamily，up-date in new sequences，gene mapping，accession numbers and nonenclature ,J,.Pharmacogenetics，1996;6(1):1-42.