神经生长因子对兔脊髓前角运动神经元保护作用的定量研究

神经生长因子对兔脊髓前角运动神经元保护作用的定量研究 1222 张王婷婷石玉秀王占友开 ( 1 中国人民解放军 202 医院病理科 沈阳 110003 )2 中国医科大学组织胚胎学教研室 沈阳 110001 【摘要】钳夹损伤兔右坐骨神经 , 于损伤处注射蛇毒 N GF 400Bu/ kg/ 日 , 损伤术后 1 , 3 , 7 天 4 , 6 , 8 周动态观察脊髓腰段伤侧第 IX 板层外侧的大型运动神经元的 ACPase 活性改和 2 , 3 , 变并应用图像分析仪对其进行定量研究 。结果表明术后 1 , 3 天实验组和对照组 ACPase 活性均增加 ; 术后 3 周实验组 AC Pase 活性达高峰 , 溶酶体数目及溶酶体 、高尔基复合体上的电子密度 ( ) 也明显增加 , 对照组酶活性不如实验组高 , 组间差异显著 P < 0101。术后 6 周实验组 ACPase 活性恢复至正常水平 , 而对照组 ACPase 活性才开始回降 。本研究显示蛇毒 N GF 对坐骨神经损 伤后脊髓前角运动神经元 ACPase 活性恢复有促进作用 , 从而对运动神经元可起一定的保护和促 进恢复的作用 。 关键词 神经生长因子 ; 坐骨神经损伤 ; 脊髓前角运动神经元 ; 酸性磷酸酶 ; 图像分析 Quant itat ive study on the protect ive eff ect of nerve gro wth factor ( NGF) on motor neurons of anterior horn in ra bbits 1222W a n g T i n gt i n g S hi Y u x i u W a n g Zha nyou Zha n g Kai (1 Dep t . of Pat hology , 202nd Hospital of PL A , Shenyang 110003 ; )2 Dep t . of Histology and Embryology , Chinese Medical U niversity , Shenyang 110001 Abstract The right sciatic nerves of rabbit s in experimental and co nt rol gro up s were crushed. The () animals of t he experimental gro up were locally injected wit h snake veno m N GF 400 Bu/ kg/ day, 1 , ( ) 3 ,7 days and 2 ,3 ,4 ,6 ,8 weeks af ter nerve crush , t he changes of acid p ho sp hatase ACPase activit y i n moto r neuro ns of t he lumbar spinal co rd were o bserved under L M and EM . The changes of ACPase o n L M sectio ns were detected wit h an image analyso r and t he data were analyzed statistically. The ACPase activit y in t he experimental and co nt rol gro up was increased during 1 ,3 days af ter nerve in2 jury. But t he ACPase activit y of t he experimental gro up was increased to t he highest values 3 weeks af ter nerve injury , and t here was significant difference bet ween experimental gro up and co nt rol gro up ( ) P < 0 . 01, and t he number of lyso so mes increased co nsiderably. Meanw hile , t he elect ro n density in lyso so mes and Golgi apparat us was increased remar kably. As co mpared wit h ACPase activit y of co nt rol gro up , t he enzyme activit y of experimental gro up was lower . The ACPase activity of t he experimental ( ) gro up declined to t he baseline 6 weeks af ter nerve injury P < 0 . 01. Ot herwise , t he ACPase activity of t he co nt rol gro up just began to subside gradually. The result s indicate t hat snake veno m N GF co uld p ro mote t he recovery of t he enzyme activit y of ACPase of t he moto r neuro n in t he anterio r ho r n of t he spinal co rd following sciatic nerve crushed. Therefo re . snake veno m N GF may play an impo rtant role i n p rotecting t he moto r neuro n and accelerating t he recovery of t he injured moto r neuro n . Key words : nerve growt h f acto r ; sciatic nerve injury ; moto r neuro n of anterio r ho r n in spinal co rd ; acid p ho sp hatase ; image analysis ( ) 神经生长因子 N GF是最早被纯化并确定, 同样时间孵育做切片置于去除底物后的孵育液中 1 ) 分子结构的典型神经营养因子。现已证明 N GF为阴性对照, 反应后 01ymp us 光镜观察 。 能通过轴突逆行运输转运至脊髓前角运动神经11213 电镜酶组织化学方法2( 取右 侧 脊 骨 髓 前 角 , 用 振 动 切 片 机 laser , 。本研究采用光 、电镜相结合的酶组织化学元) μU SA将其切成 40 ,50m 厚的切片 , 置于上述 方法 及 图 像 分 析 技 术 , 探 讨 坐 骨 神 经 损 伤 后 ,ACPase 孵育液中 80 min 后 , 1 %锇酸 4 ?后固定 ( M GF 对脊髓前角运动神经元酸性磷酸酶 AC260 min , 行常规透射电镜样品包埋块制作 , 醋酸双 ) Pase活性变化的影响 , 旨在证实 N GF 对神经元 氧铀单染 , J EM - 1200 EX 透射电镜下观察 。 的保护作用 , 为阐明 N GF 对运动神经元的潜在生 113 神经元酶活性观察 物效应提供形态学依据 , 并为在临床上应用 N GF依呈色深浅及颗粒多少将 ACPase 活性分为三 治疗外周神经损伤提供理论依据 。( ) 个等级 ; 弱阳性 + : 浅棕色 , 颗粒较少 ; 阳性 ( ) ( ) : 棕黄色 , 颗粒较多 ; 强阳性 : 棕 1 + + + + + 材料与方法 褐色 , 颗粒多而密集 ; 阴性 : 不显色 。111 动物与分组 114 图像分析及定量方法 选用体重为 2 .5 kg 左右的纯种大耳白兔 56光镜 ACPase 细胞化学染色图片经 L U ZEX - F ( 只 , 雌雄兼用 , 分笼饲养 。随机分成实验组 24型图像分析仪分析 , 光镜 10 ×40 倍的视野下 , 测 ) () () 只。对照组 24 只和正常组 8 只; 前两组再 量各组脊髓前角第 IX 板层外侧群大型运动神经元 随机分成 8 个不同时间给药 。 的 ACPase 反应产物的灰度值 , 用灰度值表示 AC2对实验组和对照组大耳白兔同时进行定位 、定 Pase 活性 。各组随机抽取 8 张切片 , 测 50 个细胞 ,量和定时的坐骨神经钳夹手术制作神经损伤模型 。 对所得数据作 t 检验 。用氯胺酮以 20 mg/ kg 耳缘静脉注射麻醉动物 , 无 菌条件下找到坐骨神经 , 用小号去齿持针器在右侧 2 实验结果股中部钳夹坐骨神经 5s , 压力为 512 kg , 损伤面积 2 为 118 mm, 缝合切口 。实验组于损伤处注射蛇毒 211 光镜下脊髓前角运动神经元 ACPase 活性的 () ()N GF 400Bu/ kg/ 日 由大连司威特制药公司提供, 改变 表 对照组用等量生理盐水代替 , 术后两周内每天腹腔 注射青霉素 80 万 u/ 只 , 预防感染 。正常组不做任 表 兔脊髓前角运动神经元内 ACPase 活性定量检测结 果 ( x? ?S) 何处理 。 112 标本制作及酶组织化学Quantitative results of ACPase activity in motor Ta b neuron of anterior horn in ra bbit spinal cord 11211 取材 各组实验动物在术后 1 、3 、7 天 ,2 、3 、4 、6 、 术后时间正常组对照组实验组 P 值 5145 ?1105 0 天() 8 周取材 正常组动物随实验组一同取材。乙醚吸入 5150 ?0187 153 ?1120 105 5p > 01 天( 麻醉动物 , 用 011 Mol/ L 二甲砷酸缓冲液 p H 714 , 5170 ?01455178 ?0171p > 0105 3 天) 含 8 %蔗糖缓冲配制的 2 %多聚甲醛和 0125 %戊二 p < 0101 5176 ?11006127 ?01937 天 p < 0105 6110 ?01926142 ?01212 周醛混合固定液进行心脏灌流固定 60 min 。切取腰 4 - 6 p < 0101 6130 ?01236173 ?01373 周节段脊髓 , 保留右侧脊髓 , 上述固定液中 4?继续固定 6160 ?01676114 ?0190p < 0101 4 周 1h 后 , 同种缓冲液漂洗 2h 。 p < 0101 6 周6121 ?01735150 ?0122 5155 ?0155 5147 ?0178 p < 0105 11212 酶组织化学方法 8 周 () 用恒冷箱切片机 J U N GCM 1800制作冰冻 3μ 切片 , 厚 15m , 将切片置于采用 Go mo ri′s 铅法ACPase 阳性反正常组兔脊髓前角运动神经元 ( 应 , 反应产物呈均匀一致的棕黄色颗粒 , 分布于细配制的孵育液中室温孵育 80 min 正常组的部分 胞质内 , 细胞核酶反应阴性 。术后 1 天 、3 天 , 实, 术后基复合体上呈高电子密度的反应产物均增加 验组和对照组神经元 ACPase 活性均开始增强 , 两 7 天 、2 周 、3 周 , 实验组呈高电子密度的溶酶体 ( ) 组酶活性差异不显著 P > 0105 。术后 7 天,3 及高尔基复合体阳性反应部位明显增多 , ACPase (( ) 周 , 实验组 ACPase 活性呈明显递增趋势 , 并于 3 在溶酶体 图 2及高尔基复合体大部分板层 图 ) 周增加到高峰 , 呈强阳性反应 , 比对照组增高的迅 3呈均匀分布 , 而对照组神经元内呈高电子密度 速 。术后 4 周 , 实验组 ACPase 活性趋向恢复 , 对 的溶酶体不如实验组多 , 高尔基复合体板层 AC2 ( 照组酶活性仍呈继续升高状态 。术后 6 周 , 实验组 Pase 阳性反应部位少 , 反应产物呈点状分布 图 ) ACPase 活性已恢复到正常水平 , 对照组酶活性才 4。术后 4 周 , 实验组溶酶体上 ACPase 反应产物 较 3 周时减少 , 电子密度开始回降 , 对照组溶酶体 开始回降 。术后 7 天,6 周 , 两组神经元酶活性差 ( ) 异均有非常显著的意义 P < 0101。 上 ACPase 反应产物增多 , 电子密度高于实验组 。 212 电镜下脊髓前角运动神经元 ACPa se 的改变术后 6 周 , 实验组神经元内溶酶体数目及电子密度 电镜下正常组脊髓前角运动神经元内 ACPase 已接近正常 , 对照组神经元内溶酶体数目略多于正 阳性反应产物呈高电子密度磷酸铅沉淀颗粒分布于 常 , 电子密度略高于正常 。实验组溶酶体数目 、高 ( ) 溶酶体及高尔基复合体的部分板层结构 图 1 。 尔基复合体板层结构阳性反应部位的增多 、AC2 术后 1 、3 天实验组及对照组神经元溶酶体及高尔 Pase 反应产物电子密度的增高均较对照组提前 。 图 1 电镜下 ACPase 反应产物呈现高电子密度的沉淀图 2术 后 3 周 , 实 验 组 ACPase 反 应 产 物 在 溶 酶 体颗粒 , 于正常兔脊髓前角运动神经元内分布 于 ( ?) 上密度增高 , 溶酶体数量增多 。 溶酶 ( ?) 及高尔基复合体的部分板层 ( ?) N : 细胞核×30 000 Fig 2 3 weeks af ter nerve injury , the ACPase positive N : 细胞核×42 000 products in lysomoes and the number of lysosome Fig 1 ACPase positive products , sho wing high electron density under the electron microscope , are located increased in the experimental group. ?)( in lysosomes ( ?) and Golgi a pparatus ( ?) of a N : Nucleus ×30 000normal motor neuron of the ra bbit spinal cord N : Nucleus ×42 000 ACPase 是溶酶体的标志酶 , 参与许多代谢活 3 讨论动 , 反映细胞物质代谢磷酸水解的主要酶 。已有文 311 NGF 对 ACPa se 活性变化的促恢复作用 献报道 N GF 能提高溶酶体内 ACPase 等多种水解 4 酶活性 , 并促进溶酶体数目增多。本研究结果经元的尽早恢复 。目前已经知道在轴突反应期间神 , 优先多制造 经元内的蛋白质和酶的合成活动增加 与上述报道相一致 。并且高尔基复合体的板层大都 8 形成新轴突所需的结构蛋白和膜的成分。庞清 分布均匀一致的酶反应颗粒 , 表明此时高尔基复合 江等证实坐骨神经损伤后 N GF 能加强受伤运动神 体加工合成的 ACPase 增多 , 不断向溶酶体传递 , 经元的 r RNA 的转录功能 , 从而对神经修复所需的 6 以备溶酶体的需要 。溶酶体在维持细胞代谢上起着 蛋白质合成有促进作用, 推断 ACPase 的升高可 重要作用 , 它能分解潜在的毒性物质 , 帮助抵抗损 能也与 N GF 促进酶合成增加有关 , 促进神经元的 恢复 , 有关 N GF 促 ACPase 升高的具体机理还有 伤带来的后果并修复损伤 。因此 , 溶酶体数目及 待于进一步研究 。 ACPase 活性的提高表明溶酶体在损伤细胞中的作 用加强 ,并增强了胞内磷酸水解活动 , 促进损伤神 图 3术后 3 周 , 实验组 ACPase 反应产物在高尔基复图 4术后 3 周 , 对照组 ACPase 反应产物在高尔基复 合体部分板层 ( ?) 上散在分布 。 ×34 000合体部分板层 ( ?) 上分布增多 。N : 细胞核 ×30 000 Fig 3 3 weeks af ter nerve injury , the ACPase positive 3 weeks af ter nerve injury , a f e w ACPase positive products increased in Golgi a pparatus ( ?) in the Fig 4 products spora dically located in Golgi a pparatus experimental group. ×34 000( ?) in the control group. N : Nucleus ×30 000 312 NGF 对运动神经元具有生物活性作用的探讨 , 打破了以逆行运输可转运至脊髓前角运动神经元 许多研究已经证实 N GF 能在交感 、感觉性轴 往认为 N GF 不能经运动神经元轴突逆行运输到胞 突中逆行运输 , 从而发挥其对交感 、感觉神经元的 体的看法 。本研究从酶细胞化学和图像分析两方面 促神经突起生长和神经元营养的作用 。以往认为运 证实钳夹损伤兔坐骨神经 3 周时 , 实验驵 ACPase 动性轴突不能逆行运输 N GF , 但近年来许多学者 活性比对照组提前到达高峰 , 同时在电镜下观察到 在体内实验中强调 N GF 对面神经运动轴突再生有 溶酶体数目及溶酶体 , 高尔基复合体上的电子密度 7 潜在的影响作用。Rende 等人证实 , 大鼠坐骨神 也明显增加 , 并于术后 6 周提前恢复至正常水平 , 经切断后 , 腰 4 - 6 脊髓节段 N GF 受体免疫反应阳 这些均为证实 N GF 对脊髓前角运动神经元有保护 8 性的运动神经元数目在伤后第一天即可达高峰。 作用提供了直观的形态学依据 。 () 下转第 95 页 方煌等运用化学发光检测手段验证 N GF 通过轴突 Glazyrin AL , Kolesni kov SI , Saf ro nov A YU . Histochemi2 st udy of post mat ure placentas fixed by dual perf usio n. Am 14 J Obstet Gynecol ,1995 ;172 :500 . cal localizatio n of o xidized glutat hio ne - catalysing en2 陶雯琪 ,刘伯宁. 胎儿生长迟缓孕妇胎盘微绒毛的体视 zymes in human term placenta . Histochem J , 1993 ; 25 : 7 学研究. 中华妇产科杂志 ,1995 ;30 :326 . 45 . Teasdale F , J acques GJ . Morp ho met ric evaluatio n of 8 15 Kitawdki J , Inoue S , Tamura T. 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