佛手柑黄龙病发生初报

佛手柑黄龙病发生初报 佛手柑黄龙病发生初报 植物病理 ACTAPHYTOPATHOLOGICASINICA35(2):190—192(2005) 佛手柑黄龙病发生初报 贺红,张桂芳,潘超美,黄海波,林小桦 (广州中医药大学中药学院,广州510405) NewrecordofHuang10ngbingonCitrusmedicavar.sarcodactylis(Noot.)Swingle inGuangdongHEHong,ZHANGGui—fang,PANChao—mei,HUANGHai—bo,LINXiao—hua(co1一 legeofChineseMateriaMedica,GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicaland PharmaceuticalSciences,Guangzhou 510405,China) 文章编号:0412-0914(2005)02-0190-03 佛手柑『Citrusmedicavat.sarcodactylis (Noot.)Swingle]为芸香科柑桔属植物,其干燥果 实入药,具有舒肝理气,和胃止痛的功效,为常用中 药材.佛手柑在广东栽培历史悠久,主产于广东德 庆,高要,云浮,四会和郁南等地,俗称"广佛手", 以区别于"川佛手"和"金佛手",广佛手为广东道 地药材,"十大广药"之一.近年来,广东肇庆地 区的德庆县和高要市的佛手柑发生一种毁灭性病 害.发病初期,新抽出的枝梢,其叶片不能正常转 绿,表现斑驳或均匀黄化症状,直至全株枯黄死亡, 且逐渐蔓延,从症状上看,类似柑桔黄龙病的症状, 但以前未见有关佛手柑黄龙病的报道,且由于生理 性的缺素也会导致黄化症状.为此,我们进行了调 查研究,为病害的防治提供依据. 1材料与方法 1.1样品的采集 表现黄化,斑驳症状的佛手柑叶片及健康的叶 片,均采自广东省德庆县;感染了黄龙病的甜橙作 为正对照,采自广州市罗岗镇;健康1年生柠檬实 生苗作为负对照,采自广州中医药大学药圃. 1.2样品的电镜观察 分别取佛手柑病叶与健叶的叶脉部分,切成 lilllnx(3,5)illln的小块,按常规方法在5%戊 二醛及2%锇酸中固定,经酒精系列脱水,包埋 于Epon8]2中,包埋块用JUM一5型超薄切片机切 片.切片经铀盐和铅盐双染色后,在电子显微镜 (HITACHIH-600ElectronMicroscope)下观察. 1.3样品的DNA提取及PCR检测 1.3.1引物的根据柑桔黄龙病病原亚洲株 系In_2.6(质粒M94319)的序列设计引物.引物l (P1)与In-2.6的DNA序列的134,153位核苷酸 同源,碱基序列为5一GcGTTcATGTAGAAGTT— GTG-3;引物2(P2)与In-2.6的DNA序列的514 , 533位核苷酸互补,碱基序列为5'-CTTACAG— GTGGcTGAcTcAT0,其扩增片段大小为400 bp.引物由上海生物工程公司合成. 1.3.2模板DNA的提取采用CrAB法提取 DNA.取新鲜叶脉约2g于液氮中研磨,成糊状或 粉末;转入离心管,管内先加入CTAB缓冲液混 匀,分装于Eppendorf管中;用氯仿/异戊醇抽提2 次,取上清,加入1/2(1/5)体积的NaC1,再加入2/ 3体积冰冷的异丙醇,一20?30min或过夜;于 4?下16000r/min离心15min,去上清(收集沉 淀);分别用70%和95%的乙醇洗沉淀各1次, 50?左右烘干;加入100TE溶解DNA沉淀. 收稿日期:2004-07—18;修回日期:2004—10-26 基金项目:广东省自然科学基金项目(020792);国家中医药管理局研究课题 (02-03ZP48) 2期贺红,等:佛手柑黄龙病发生初报191 1.3.3PCR扩增反应所用的试剂为广州华美 生物工程公司的产品.PCR反应体系的总体积为 50L,包括:10×PCR缓冲液5.0L,1.5mmol/ LMg",0.2mmol/LdNTPs,引物各26pmol,30 ng模板DNA和3.0UTaqDNA聚合酶.混合后 置于PCR仪(PERKIN—ELMERGeneAmpPCR System2400)上进行扩增反应.反应条件为:94? 预变性5min后,94?变性45S,55?50S,72? 1.5mill,35个循环后,72?延伸10min.取8L PCR产物于1.2%琼脂糖TBE胶上电泳,紫外灯 下观察照相. 1.4茎尖微嫁接 1.4.1砧木的培养从成熟柠檬果实中取出种 子,表面消毒后,剥去种皮,接种于MT培养基上, 黑暗培养14d,温度保持在26—28?. 1.4.2接穗的准备采摘l一2cm的佛手柑嫩 芽,剥去较大叶片,切取0.5一lcm茎尖,用蒸馏水 冲洗几次,75%酒精浸泡约30S,0.1%HgC1消毒 6min,无菌水冲洗4—5次后,在双目显微镜下将 嫩芽剥至带2—4个叶原基茎尖作为接穗. 1.4.3嫁接方法将茎尖接到砧木的倒"T"字形 切口上,外缠Parafilm膜,再将整株移人带滤纸桥 的液体培养基中进行培养. 2结果与分析 2.1发病症状 近年来,广东肇庆地区德庆县和高要市的佛手 柑出现成片黄化死亡的现象,严重时,整园一片黄 化,以秋,冬干旱季节发病最重.症状为抽出的新 梢,其叶片不能正常转绿,表现斑驳或均匀黄化症 状,与柑桔黄龙病典型症状相同.一般从树的顶端 或其外围开始先受害,手摸受害叶片有一种粗糙, 似皮革样硬质的感觉,质硬且脆,容易脱落,叶脉呈 肿胀状突起,逐步使全株黄化和大小根系腐烂,直 至全株枯黄死亡.本病可通过嫁接及木虱传染. 2.2病原鉴定 2.2.1电镜观察在电镜下观察表现斑驳和黄化 可以看到菌体多形态, 的佛手柑叶片的样本切片, 呈圆形和椭圆形,大小为(100—500)nl/l×(170一 looo)llm,菌体的外围包被由3层单位膜构成,厚 度为l7—30nm(图1).健康样本切片未观察到 有这样的菌体出现.这种病原物在形态,大小及构 造上均与以前报道的柑桔和蜜柚的黄龙病病原基 本相同.,. Fig.1PathogensindiseasedleafofCitrus medicavar.sarcodactylis 2.2.2PCR检测根据柑桔黄龙病亚洲株系In一 2.6所设计的引物P和P,应用PCR技术检测了 表现斑驳,黄化症状的佛手柑,健康的佛手柑,感染 了黄龙病病原的甜橙(正对照)和1年生柠檬实生 苗(负对照).结果表明:感染了黄龙病病原的甜 橙及表现感病症状的佛手柑样品中,在预计的4OO bp扩增出特异的电泳谱带,而在柠檬实生苗及健 康的佛手柑样品中均未扩增出特征带(图2),表明 佛手柑的感病症状是由黄龙病病原引起的. 2.3病害防治 对佛手柑黄龙病的防治,要及时挖除病株,集 中烧毁;并在新梢抽发l一2cm长时,全面喷洒l 一 2次杀虫剂防治木虱,控制病害的传播.由于佛 手柑在生产上是采用扦插和嫁接繁殖,病原体逐代 传递;佛手柑产区的扩大,使得接穗和苗木在不同 地区间传送,又加剧了病害的扩散和蔓延,因此预 防该病的有效措施之一是无病苗木的培育.茎尖 微嫁接技术可以脱除黄龙病病原,这项技术已在柑 j92植物病理35卷 2 1 l 12345673 Fig.2Detectionofpathogensfr0mCm. var.sarcodactylisbyPCR 1-DNAmarker;2—4:InfectedC帆var.sarcodactylis; 5:HealthyCm.var.sarcodactylis;6:CsinensisOsbeck withHuanglongbing;7:Lemonseedling 桔,沙田柚上获得成功,并逐步在生产上应用.,. 我们对佛手柑也开展了茎尖微嫁接试验,并获得了 茎尖微嫁接成活苗(图3),为消除黄龙病病原体, 培育无病苗奠定了基础.有关这方面的深入研究 还在进行之中. Fig.3Shoot—tipgratfingplantletsofCm_ var.sarcodactylis 讨论 黄龙病最初在柑桔中报道,其发生的原因开始 曾被认为是水害,镰刀菌危害或土肥管理不当等 引发烂根,导致植株地上部黄化.20世纪50年 代,试验证实该病可通过嫁接传染,因而被认为是 一 种病毒病害.70年代中后期,根据电镜下的病 原形态特征以及对四环素,青霉素的敏感性,黄龙 病病原被认为是一种寄生于韧皮部的类细菌.70 年代试验证明,柑橘木虱的成虫和高龄若虫能传播 此病,而嫁接传病也是一个重要的传播途径.目前 的研究表明,黄龙病病原为原核生物界薄壁菌门韧 皮部杆菌属中的一种细菌,学名为Liberobacter asiaticum.黄龙病菌属专性寄生菌,目前尚不能 人工培养.本文首次报道了佛手柑黄龙病,有助于 药农认识黄龙病及其危害,并作好相应的预防措 施,以利于佛手柑生产的发展. 参考文献 [1]贺红,徐鸿华.广佛手化橘红广陈皮规范化栽培技 术[M].广州:广东科技出版社,2003.24—25. [2JMurryMG,ThomposonWF.Rapidisolationofhigh molecularweightplantDNA[J].NucleicAddsRes., 1985,8(12):4321—4324. [3]柯冲.柑桔黄龙病病原研究与防治建议[J].中国柑 桔,1979,34(3):29-32. [4]田亚南,柯穗,李滔.应用电镜与PCR技术检测官溪 蜜柚黄龙病病原[J].植物病理,2000,30(1): 76—81. [5]蒋元晖,赵学源,苏维芳,等.通过茎尖嫁接脱除柑桔 黄龙病病原体[J].植物保护,1987,14(3): 184. [6]董高峰,李耿光,张兰英,等.提高沙田柚茎尖嫁接成 活率的研究[J].广西植物,2001,2(3):273-276. [7]JagoueixS,BoveJM,GamierM.Thephloem—limited bacteriumofgreeningdiseaseofcitrusisamemberof thesubdivisionoftheproteobacteria[J].International JournalofSystematicBacteriology,1994,44(2):379 — 386. 责任编辑:杨晓昱