【论文范文】川芎嗪对青霉素致痫大鼠神经元Bcl-XL 基因表达的影响

【范文】川芎嗪对青霉素致痫大鼠神经元Bcl-XL 基因表达的影响 论文范文 目:川芎嗪对青霉素致痫大鼠神经元Bcl- XL 基因表达的影响 编辑:司马小 【摘要】 目的:通过免疫组织化学方法来探讨川芎嗪(TMP)对青霉素致痫大鼠大脑神经元内Bcl-XL基因表达的影响。方法: 使用青霉素致痫大鼠模型, 采用BL-410生物机能实验系统记录双侧大脑皮层痫样放电, 待癫痫样放电稳定后, 腹腔注射不同剂量的TMP, 待其抑制作用最明显时, 取大脑切片,采用免疫组织化学方法观察大脑神经元内Bcl-XL基因表达的变化～利用计算机图像技术测量不同时期血管瘤组织和正常皮肤组织Bcl-XL 基因表达的平均光密度和平均阳性面积。结果: A组(手术对照组)与B组(青霉素致痫组)、C 组(TMP10mg〃kg-1治疗组)之间Bcl-XL基因的平均光密度及阳性面积率有显著性差异,P,0.01)～A 组(手术对照组)与D组(TMP20mg〃kg-1治疗组)、E组(TMP40mg〃kg-1治疗组)之间Bcl-XL基因的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性,P,0.05,～B 组(青霉素致痫组)与C组(TMP10mg〃kg-1治疗组)之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性,P,0.05,～D组(TMP20mg〃kg-1治疗组)与E组(TMP40mg〃kg-1治 疗组)之间Bcl-XL基因的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性,P,0.05,。结论: TMP可抑制青霉素致痫大鼠大脑神经元的凋亡～从而对神经元起了重要的保护作用。 【关键词】 川芎嗪 癫痫放电 神经元 青霉素 Bcl-XL基因 细胞凋亡(apoptosis) 是正常器官发育和组织稳态过程中一种固有的细胞死亡形式,也可由多种因素包括糖皮质激素、高温、一定的化疗药物和电离辐射等诱导产生。细胞凋亡同细胞的增殖与分化一样, 离不开基因的表达与调控, 目前发现许多基因参与细胞凋亡的调控, 在哺乳动物细胞大致分为三类:一类为促进凋亡; 另一类为抑制凋亡; 还有一类为双向调控, 如c-myc、Bcl-x,Bcl-x 可翻译出两种蛋白Bcl-XL 和Bcl-XS, 前者抑制凋亡,后者促进凋亡。原癌基因和抑癌基因是参与细胞维持自稳平衡(homeostosis)的正负调控信号, 共同调节细胞增殖、分化和凋亡,1~3,。 川芎为伞形科蒿本属植物, 它具有活血化淤、疏风止痛、理气的作用,4,。川芎嗪(ligustrazine)是中药川芎的有效成分之一,属酰胺类生物碱,化学结构为四甲基吡嗪, 化学结构为四甲基吡嗪 ( tetramethylpyrazine,TMP)。TMP可抑制海马神经元的放电活动, TMP可明显抑制吗啡依赖大鼠戒断症状及体重下降,5～6,,大剂量TMP对缺血、缺氧性脑损伤、海马CA1神经元的缺血性损伤有改善或保护作用。TMP已被广泛应用于心、脑血管闭塞性疾病的治疗。 本课题采用免疫组织化学方法、图像分析技术检测了TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元内Bcl-XL基因表达的平均光密度及阳性面积率的变化影响, 并进一步探讨其作用机制。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 SD大鼠(由武汉大学医学院实验动物中心提供) , 雌雄不拘, 体重200， 250g。 1.1.2 实验药品及试剂 盐酸川芎嗪注射液( 批号0107001 ) , 常州制药厂生产,注射用青霉素钠( 批号00109306) , 华北制药股份有限公司生产。 1.1.3 实验仪器 BL-410 生物机能实验系统, 成都泰盟电子有限公司生产,江湾I-C型立体定向器, 第二军医大学器材处生产。 1.2 方法 1.2.1 癫痫动物模型 实验选用健康SD 大鼠, 用10% 乌拉坦以10m l〃kg-1体重腹腔注射( ip ) 麻醉, 将动物固定在江湾I-2C 型立体定向器上,于大脑左、右两侧前卤后3mm , 矢状缝旁开3mm 行开颅手术, 暴露大脑皮层记录区域(2mm 〓2mm),将银球电极臵于左、右两侧的记录部位,信号输入臵BL-410 生物机能实验系统, 进行左、右两侧脑电记录。用浸有青霉素溶液的明胶海绵(200u/mm3)臵于左侧大脑皮层表面, 诱发大鼠大脑皮层癫痫样放电, 待癫痫放电稳定后, 移去明胶海绵, 用浸有温热生理盐水棉球盖住创口。 1.2.2 试验分组及取材 将实验大鼠随机分为5组, 每组8只: ?A 组(手术对照组) , 麻醉开颅手术1h后取大脑; ?B组(青霉素致痫组),青霉素诱发癫痫1h后取大脑, ?C组(TMP10mg〃kg-1治疗组),青霉素诱发癫痫放电稳定后,再腹腔注射 (TMP10mg〃kg-1),待抑制作用最明显时取大脑, ?D组(TMP20mg〃kg-1治疗组),青霉素诱发癫痫放电稳定后, 再腹腔注射(TMP20mg〃kg-1),待抑制作用最明显时取大脑,?E组(TMP40mg〃kg-1治疗组),青霉素诱发癫痫放电稳定后,再腹腔注射(TMP40mg〃kg-1),待抑制作用最明显时取大脑。 1.2.3 HE染色 常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(厚约4μm)及HE染色。 1.2.4 免疫组织化学S-P法检测Bcl-XL相关抗原 主要步骤: ? 组织切片5 μm～常规脱蜡至水～蒸馏水洗, ? 3%过氧化氢～37?孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性～PBS洗4〓5min, ? Bcl-XL采用微波抗原修复,3档～10 min,～PBS洗4〓5min, ? 正常羊血清37?孵育10 min以减少非特异性反应, ? 一抗37?孵育1 h～PBS洗4〓5min, ? 生物素标记的二抗～37?孵育10 min～PBS洗4〓5min, ? 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37?孵育10 min～PBS洗4〓5min, ? DAB显色液显色～自来水冲洗终止反应, ? 苏木精复染～脱水～透明～封片。 用PBS代替一抗作为阴性对照组～人扁桃体作为Bcl-XL的阳性对照组。 1.3 免疫组织化学结果判断 Bcl-XL相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外～胞核和胞浆内无棕黄色反应物。 采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文管理系统,同济千屏影像公司,对Bcl-XL的表达进行定量分析～每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野,〓400)～测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积～计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值,阳性面 积率,单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积〓100,,。 1.4 统计学处理 对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK-q检验～检验水准α为0.05。 2 结果 Bcl-XL基因的表达 A 组(手术对照组) : 大脑皮层神经元胞浆内可见一些棕黄色颗粒～Bcl-XL基因表达较强,B 组(青霉素致痫组) : 大脑皮层神经元胞浆内可见极少量的棕黄色颗粒～Bcl-XL基因表达弱,C 组(TMP10mg〃kg-1治疗组) :大脑皮层神经元胞浆内可见少量的棕黄色颗粒沉积～Bcl-XL基因呈弱阳性表达,D组(TMP20mg〃kg-1治疗组) :大脑皮层神经元胞浆内可见一些棕黄色颗粒～Bcl-XL基因表达较强, E组(TMP40mg〃kg-1治疗组) :大脑皮层神经元胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒～Bcl-XL基因表达呈阳性。图像分析结果显示:A 组(手术对照组) Bcl-XL基因表达的平均光密度为0.2506〒0.0159,B 组(青霉素致痫组) Bcl-XL基因表达的平均光密度为0.0753〒0.0261,C 组(TM P 10mg〃kg-1治疗组) Bcl-XL 基因表达的平均光密度为0.0945〒0.0248,D组(TMP20mg〃kg-1治疗组) Bcl-XL基因表达的平均光密度为0.1938〒0.0194,E组(TMP40mg〃kg-1治疗组) Bcl-XL 基因表达的平均光密度为0.2631〒0.0210。A 组(手术对照组) Bcl-XL基因表达的阳性面积率为0.2437〒0.0213,B 组(青霉素致痫组) Bcl-XL 基因表达的阳性面积率为0.0873〒0.0286,C 组(TMP10mg〃kg-1治疗组) Bcl-XL 基因表达的阳性面积率为0.0896〒0.0259,D组(TMP20mg〃kg-1治疗组) Bcl-XL基因表达的阳性面积率为0.2042〒0.0264,E组(TMP40mg〃kg-1治疗组) Bcl-XL基因表达的阳性面积率为0.2687〒0.0186。经单因素方差分析～组间有显著性差异,P,0.01)。经q检验～A组(手术对照组)与B组(青霉素致痫组)、C 组(TMP10mg〃kg-1治疗组)之间Bcl-XL基因的平均光密度及阳性面积率有显著性差异,P,0.01)～A 组(手术对照组)与D组(TMP20mg〃kg-1治疗组)、E组(TMP40mg〃kg-1治疗组)之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性,P,0.05,～B 组(青霉素致痫组)与C组(TMP10mg〃kg-1治疗组)之间Bcl-XL基因的平均光密度及阳性面积率 的差异无显著性,P,0.05,～D组(TMP20mg〃kg-1治疗组)与E组(TM P40mg〃kg-1治疗组)之间Bcl-XL基因平均光密度及阳性面积率的差异无显著性,P,0.05,。见表1。表1 各组Bcl-XL基因表达的平均光密度和阳性面积率,略,注:* A组与B组、C 组比较～,P,0.01),** A组与D组、E组比较～,P,0.05,,? B组与C组比较 ～,P,0.05,, 3 讨论 青霉素致大鼠癫痫模型是一种极为有效的、操作简便的实验动物癫痫模型, 其癫痫放电持久稳定, 可以用作抗癫痫药物疗效及癫痫发病机制的研究,7,。青霉素诱发的癫痫电活动是阻断了GABAa受体导致抑制神经网络功能失调而产生癫痫状态的,8,。细胞凋亡(apoptosis)是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因调控的细胞主动死亡过程～它是细胞在一定条件下～通过启动其自身内部机制～引起内源性DNA内切酶的激活而发生细胞的自然死亡。细胞凋亡的过程不导致溶酶体及胞膜的破裂～没有细胞内涵物外泄～所以不引起炎症反应。 细胞凋亡受许多基因调节, 其中包括多种癌基因和抑癌基因如c-myc、bcl-2 、p53 、fas 等。 其中bcl-2 是与细胞凋亡关系最为密切, 被研究得最深入者之一 。 Bcl-2 的表达产物位于线粒体内膜、核膜及内质网膜, 在人体多种肿瘤中高表达, 可抑制多种因素诱导的细胞凋亡,9,。 进一步研究发现:bcl-2 是一个多基因家族, 包括多个成员. Bcl-x 是近年发现的bcl-2 家族成员之一。1993 年Boise,10,以鼠bcl-2cDNA为探针, 在鸡淋巴细胞cDNA文库中筛选到一个克隆, 命名为bcl-x. 经DNA 印迹等一系列实验证实其为一与bcl-2 显著不同的新基因～ 随后用鸡bcl-xcDNA作探针, 筛选到人bcl-x cDNA。 由于不同的剪接产生两种大小不同的mRNAs: bcl-xL(long form) 和bcl-xs (short form)。bcl-xL 类似于bcl-2 , 能抑制细胞凋亡, 奇怪的是, bcl-xs 却能促进细胞凋亡。 本实验结果显示, 青霉素致痫后大脑皮层神经元胞浆内可见少量的棕黄色颗粒～Bcl-XL基因表达较弱。而D组腹腔注射不同剂量的TMP后,大脑皮层神经元胞浆内可见较多的棕黄色颗粒～Bcl-XL 基因表达较强。特别是腹腔注射TMP40mg〃kg-1, 大脑皮层神经元胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒～Bcl-XL基因表达非常强。实验结果表明～Bcl-XL很可能根据不同的诱因以不同的方式参与调节细胞的生存或死 亡, TMP抑制大鼠癫痫样放电的机制可通过抑制大脑皮层神经元的凋亡 而使大脑皮层神经元结构和功能恢复正常～对神经元起着重要的保护 作用。TMP在体内吸收后,能有效地透过血脑屏障,并广泛分布于大脑皮 层、脑干、纹状体、海马、小脑和中脑等部位。TMP在体内有广泛的抑 制效应, 具有抑制缺血、抗再灌注所致心律失常的作用, 并有抑制心 肌耗氧量的作用。TMP在大脑皮层缺血所致海马神经元凋亡的过程中起 着重要的保护作用。 【参考文献】 1 Gotz R, Kramer BW , Camarero G, et al. BAG-1 haplo-insufficiency impairs lung tumorigenesis. BMC Cancer, 2004,4(1):85. 2 Xie X, Clausen OP, Boysen M. Bag-1 expression as a prognostic factor in tongue squamous cell carcinomas. Laryngoscope, 2004, 114(10): 1785~1790. 3 Moriyama T, L ittell RD, Debernardo R, et al. 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