肌酸激酶同工酶——MB评估

肌酸激酶同工酶——MB评估 肌酸激酶同工酶——MB评估 上海仁济医院检验科 肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)是由M和B亚基构成的杂化型二聚体，主要存在于心肌细胞的外浆层，是心肌酶谱中最有特异性的酶，从80年代起公 [1，认为心肌酶学诊断的“金标准”，应用于急性心肌梗塞(AMI)的早期诊断2][3]1979年Gerhardt等人首次报道用免疫抑制原理测定CK同工酶，免疫抑制法以其快速、灵敏、定量且可进行自动分析等优点适合常规检测，随着方法与试剂不断改进与完善，1986年国外已有试剂盒供应，但价格昂贵;最近国内研制成功免疫抑制法测CK-MB的试剂盒，本文旨在对该试剂盒的特性作一评估。 材料和方法 一、标本来源 分正常组，AMI组和非AMI组，非常人血清来自体检健康人员，计30例，AMI组53例，系仁济医院心内科病房已确诊为AMI者，非AMI组系心内科 后经系列观察和及其它科门诊病人，因胸痛、心率失常等初诊疑拟AMI， 酶学检查证实不是AMI患者，共20例。 血标本留取后及时分离血清检测或将检测血清置于-20度冰箱保存至测定。 二、试剂 1. 免疫抑制法检测CK-MB试剂盒:上海北加生化试剂有限公司产品 (1) R1:含CK-MB抗体的咪唑缓冲液 (羊抗人CK-M多克隆抗体抑制剂>2000U/L，100mmol/L的咪唑 缓冲液成pH6.7内含葡萄糖20mmol/L，醋酸镁10mmol/L，EDTA 2mmol/L) (2) R2(A):酶干粉。 (AMP 5mmol/L，磷酸肌酸 30mmol/L，五磷酸二腺苷 10mmol/L， NADP 2mmol/L，V-乙腺半胱氨酸 20mmol/L，已糖激酶?2500U/L， G6PDH?500U/L，ADP 2mmol/L)。 2. 宝灵曼CK-MB试剂盒:对照用。 三、仪器 HITACHI 7150型自动生化分析仪 波长=340nm 四、方法 本试验在日立7150生化自动分析仪器上测定，参数表如下: TEST EXPECTED VALUE ASSAY CODE TECH LIMIT SAMPLE VOLUME INSTRUMENT FACTOR R1 VOLUME [ CK-MB ] R2 VOLUME [ RATE - A ]:[ 45 ]-[ 50 ] WAVELENGTH [ 5 ][ 3 ] CALIB METHOD [ 240 ][ 100 ][ NO ] STD. (1) CONC. –POSZ. [60 ][ 20 ][ NO ] STD. (2) CONC. –POSZ. [ ][ 340 ] STD. (3) CONC. –POSZ. [ LINEAR ][ 0 ][ 0 ] STD. (4) CONC. –POSZ. [ 0.0 ]-[ 1 ] STD. (5) CONC. –POSZ. [ 65 ]-[ 28 ] STD. (6) CONC. –POSZ. [ 0 ]-‘[ 0 ] SD LIMIT [ 0 ]-‘[ 0 ] DUPLICATE LIMIT [ 0 ]-‘[ 0 ] SENSITIVITY LIMIT [ 0 ]-‘[ 0 ] SENSITIVITY LIMIT [ 0.1 ] ABS. LIMIT (INC/DEC) [ 100 ] PROZONE LIMIT [ 100 ] [ 0 ] [ 0 ]-[ 25 ] [ 9000 ][ INCREASE ] [ 100]-[ 1000] [ 0 ][ LOWER ] [ 1.0 ] 结 果 一、线性范围 取一高活性CK-MB标本:152.0U/L用生理盐水按1/5、2/5、3/5、4/5、5/5比例稀释，测得其相应活性分别为38.0、81.0、111.0、131.0、152.0，作图(见图1)。呈典型的抛物线曲线，符合免疫比浊法反应原理。 图1 试剂盒测定CK-MB线性 同样操作方法，将CK-MB为79.0U/L的病人血清标本用生理盐水按1/5、2/5、3/5、4/5、5/5比例稀释，测得相应活性为18.7、32.5、48.9、65.5、79.0以稀释倍数为X轴，酶活性Y为轴，其线性见图2，可见CK-MB活性在80U/L以下线性良好。 图2 试剂盒测定CK-MB线性 二、精密度试验 分别取低、中、高活性的血清标本(简称低值、中值、高值)。按本法操作， 定一次共10天，表1为本试剂盒对五份血清批内重复200次，批间是每天测 标本所做的重复性试验，批内:n=60，CV=1.66~13.66%，平均6.78%。批间:n=20， CV=6.59~11.73%，平均9.16%，基本符合质控要求，显示该试剂盒有效较高的精 密度。 表1 精密度试验 标本 n man min X SD CV(%) 批 低值 20 13.0 8.0 10.15 1.39 13.66 中值 20 61.4 51.7 55.99 2.81 5.02 内 高值 20 168.0 158.0 163.1 2.7 1.66 批低值 10 15.0 10.4 12.45 1.46 11.73 批高值 10 108.8 90.1 98.73 6.51 6.59 三、干扰试验 1. 甘油三酯(TG)干扰试验:采用高脂标本经测定分析物浓度后加入试验 样品中。 选取两标本，一为高甘油三酯标本(TG:14.8mmol/L，CK-MB:30U/L)，另 一为甘油三酯正常标本(TG:1.09mmol/L，CK-MB:32U/L)。将高甘油三酯作 为干扰物，按不同比例1/5、2/5、3/5、4/5、5/5加入甘油三酯正常的标本中， 随后测CK-MB活性分别为30、31、33、31、30。干扰物加入前后的反应曲线 图见图3、4。由于两标本CK-MB接近，仅考虑TG带来的影响，根据图及测 得值显示TG在14.8mmol/L以下对CK-MB活性无明显影响。 图3 TG加入前反应曲线图 图4 TG加入后反应曲 线图 2. 胆红素(BIL)干扰试验: 选取高胆红素标本(BIL:394.72μmol/L，CK-MB:4.1U/L)作为干扰物，按不 同比例1/4、1/3、1/2加入胆红素正常(BIL:4.02μmol/L，CK-MB:11.0U/L)的标 本中，然后分别测胆红素，CK-MB值(见表2)，干扰物加入前后的反应曲线 见图5、6。由于两标本中CK-MB略有差异，随着干扰物高胆红素加入的同 时，低活性的CK-MB亦被带入，须计算理论值，根据测定值与理论值比较 及图显示BIL，在209.33μmol/L以下对CK-MB活性无明显影响。 表2 胆红素对CK-MB的影响 干扰物加入比例 1/4 1/3 1/2 BIL 104.20 136.76 209.33 CK-MB(测定值) 9.7 8.4 7.4 CK-MB(理论值) 9.28 8.7 7.55 图5 BIL 加入前反应曲线图 图6 BIL加入后反应曲线 图 3. 溶血干扰试验 将8例CK-MB活性增高的标本，先测定CK-MB活性，然后进行人为溶 血，得到溶血样品，再进行测定CK-MB活性及血红蛋白浓度，结果见表3。 进一步试验，将标本1、4溶血前重复测5次，得136.58?2.51、27.74?2.21;溶血后 重复测2次，均在X?2SD范围内，说明当轻度溶血(Hb<200mg/dl)时本试剂盒 对CK-MB测定无明显影响;反之严重溶血可致CK-MB活性升高。 表3 试剂测定CK-MB活性溶血前后结果比较 1 2 3 4 5 6 7 8 溶血前 135.1 201.5 27.3 27.3 65.2 69.5 181.9 201.5 溶血后 135.8 202.6 27.4 26.1 64.6 70.4 189.5 214.9 Hb(mg/dl) 100 100 100 200 200 200 300 500 四、与德国宝灵曼同类试剂盒的相关性 60份临床病人血清标本用本试剂和宝灵曼试剂进行CK-MB平行测 定，以宝灵曼试剂测得结果为X轴，本试剂测得结果为Y轴，求得线性方 程为Y=0.565X-0.5999，线性相关系数为r=0.983(图7)。显出高相关性，上述结 果表明二种试剂盒对AMI的临床意义均满意。 图7 本试剂(Y)与宝灵曼试剂(X)的相关性 五、正常值 本试剂盒测定体检健康人员30名，结果CK-MB为4.96?2.95U/L(X?SD)，取95%的范围，单测u= 1.645得4.96?3.37(X?1.645SD)，正常上限定在<10U/L。 讨 论 肌酸激酶(CK，EC2,7,3,2，)，又称肌酸磷酸激酶(CK)，是Kuby等于1953年首先从兔骨骼肌中提取的。CK是不稳定的酶，对光、热及高pH敏感， [4]故测定时必须十分注意测定条件，标本最好用血清，除肝素外采血管中不应加其它抗凝剂，因为它们对CK活性有抑制作用。由于标本在保存中活性缓缓下降(4度，24小时活性丢失10%;25度，1小时丢失10.)，最好采用血后能迅速进行测定。如标本需储存，由于CK在室温不稳定，所有标本都因尽快与细胞分离保存在4度，保存时间不应超过24小时;若24小时内不测定需放在-20度冰箱中。 本试剂应用美国进口的羊抗人CK-M多克隆抗体，建立并产生了免疫抑制测定CK-MB方法的试剂盒，采用N-乙酰半胱氨酸(NAC)代替谷胱苷肽作为激活物质，其稳定性和溶解性好，而且测定时不会引起蛋白沉淀;并增加 DETA作为酶激活剂，避免了使用还原胱甘肽作酶激活剂使CK-MB结果偏低的情况。其原因为还原谷胱甘肽(GSH)中除常混有氧化谷胱甘肽(GSSG)外，本身在保存过程中会部分地被氧化，而血清中存在的谷胱甘肽还原酶(GR)则会催化氧化谷胱甘肽生成还原谷胱甘肽，并同时竞争性地消耗在催化CK-MB过程中产生的NADPH，反应如下: GSSG+NADPH+H+ 2GSH+NADP+，致使CK-MB结果偏低，可造成假阴性结果，另外，单磷酸腺苷(AMP)和二腺苷-5-磷酸(Ap5A)亦是试剂盒不可缺少的成分，血清中腺苷酸激酶(AK)主要来自RBC、PLT、肝和肌肉组织，可催化ADP产生ATP，参与反应，导致CK值假性升高，因此分离血清时要保证离去PLT、RBC等等。虽然RBC中不存在CK，溶血不直接影响CK活性;但是RBC中含有丰富的AK，是测定的主要干扰物质，这种干扰可以通过向底物反应混合液中入AK的抑制剂而减少，最有效的便是将AMP和二腺苷-5-磷酸结合起来使用。因而本试剂对轻度溶血标本(如Hb<200mg/dl)，CK-MB活性无明显改变。 本试剂盒测定CK-MB活性显示精确性和线性良好，对轻度溶血，黄疸及脂血不受干扰。对AMI血清标本和进口宝灵曼试剂盒和相关性良好(r=0.983)，表明该试剂符合测定要求。关于正常值，通过测定30名健康人平均CK-MB为4.96?2.05U/L，将其正常值为<10U/L，比宝灵曼试剂正常值(<25U/L)低。在标准品方面，由于生产物标准品提取纯化较困难且代价高昂，目前还没有CK-MB的国际二级标准品以提高可比性。日常工作中如使用的标准品标化不准或日久失活，将影响工作质量，故标准品问题有待进一步研究。值得一提的是，日常工作中应注意试剂盒的保存期及保存条件，因生物制品性质不十分稳定，要低温保存和运输，若过了保质期有时虽仍一定活性，但相对定量关系发生了改变，对测定结果有影响，给质量控制带来一定困难。 采用免疫抑制原理测CK-MB活性，其操作简单、快速、灵敏度高而具有一定精确性的方法，适合心肌梗塞患者的急诊检查，也能用于自动分析作 [5]批量测定。缺点是不能排除巨CK及CK-MB干扰，在诊断急性心肌梗塞和解释结果时应谨慎，由于CK-MB主要存在于脑组织中，并由于血脑“屏障”作用，血液CK-MB含量甚微而可忽略不计。因此临床应用时，在排除急性器质性脑损害(脑实质细胞和血脑屏障均受损)的前提下，本法测定值大于正 常值，特别是CK-MB>10U/L时，拟可提示急性器质性心肌损害，如AMI。值得一提的是在临床实际工作中，急性器质性脑损害和心肌梗常不难鉴别。如患者血中还存在异常CK时(巨CK1型或线粒体CK)，不能被M抗体所抑 [6,7,8]制，都将出现假阳性结果，但在多数情况下其含量很低的，Gerhardt报道这种干扰的频率大概小于0.5%，如有疑问时可用电泳法核实，根据电泳凝胶止的迁移位置，能把它们与MB区别开来。虽然血清中CK-MB升高是国内外公认诊断AMI和确定有无心肌坏死的重要指标，但CK-MB亦有其局限性，在于骨骼肌损伤时也可能释放出一定量的CK-MB。虽一般认为骨骼肌含有 [9]的CK-MB在总CK中不超过5%，但也例外。因此当CK-MB增高时，临床也应考虑有无非心肌来源的可能性。 本试验应用的试剂盒用免疫抑制法测定肌酸激酶-MB同工酶活性，测定省时，能用于急诊，且敏感性高，不失为估计有无心肌梗塞的一种理想方法，随着试剂盒的供应，自动分析仪的普及，其使用将越来越广泛。