迟缓爱德华氏菌唾液酸酶的克隆表达与功能研究

迟缓爱德华氏菌唾液酸酶的克隆表达与功能研究 ? 研究生学位 迟缓爱德华氏菌唾液酸酶的 克隆表达与功能研究 研宄生姓名?仨蝗 指导教师姓名 堂隧堡塾援 专业名称 渔注生物堂 申请学位级别 亟? 论文日期垫生且目学位授予日期生?且 中国海洋大学一谨以此论文献给所有在科研工作和生活中 关心和我帮助过我的人们,, 、迟缓爱德华氏菌唾液酸酶的克隆表达与功能研究 学位论文完成日期: 指导教师签字: 答辩委员会成员签字: 一蒸似.\独创声明 本人声明所呈交的学位论文是车在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外.论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研宄成果以及其他教育机构的学位或证书使用过的村料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名:薪仁谚签字日期:?墀‘月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定.并同意咀下事项: 学校有权保留并向国家有关部门或机构迭交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅 和借阅。 学校可以将学位论文的全部或部分内容编有关数据库进行检索.可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、于编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊光盘版 电子杂志社”用于出版和编入《中国知识资源总库》,授权中国科学技术信息研宄所 将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。保密的学位论文在解密后适用本授权 书 导师签字: 学位论文作者签名:斩仁鸩 签字日期: 年 月 日 签字日期:研年月』日迟缓爱德华氏菌唾液酸酶的克隆表达与功能研究 摘要 细菌的唾液酸酶是一类糖苷水解酶,在细菌对宿主细胞和组织的侵染过程中发挥着重 要作用。本研宄中,我们采用牙鲆为动物模型,初步探索迟缓爱德华氏菌唾液酸酶 的功能。生物信息学分析表明,由十氯基酸组成.含有唾液酸酶结构域和自体 .个 和保守的 运输结构域,前者包含了细菌唾液酸酶的典型结构:个 催化中心。我们对其唾渡酸酶结构域进行了体外重组表这,纯化得到的重组蛋白具 有水解唾液酸底物的水解酶活性。为了进一步检测的功能,我们构建了的突 变菌株。毒力分析实验表明.与野生型菌株相比.突变型菌株对 牙鲆组织的感染能力大幅下降.抵抗牙鲆巨噬细胞活性氧的杀伤能力以及在巨噬细胞中的 生存复制能力都明显降低。以作为亚单位疫苗.能够有效的保护牙鲆抵抗迟缓爱德 华氏菌的感染.综上所述,是一种毒力相关因子.在迟缓爱德华氏菌的致病过 程中 发挥了重要作用: 关键词:唾液酸酶;迟缓爱德华氏菌;毒力;疫苗. .彘/ 。四占//:. 南 ? . 、吣呈 /冒 : :、 :::////目录 绪论迟缓爱德华氏菌研究概况 ?退缓爱德华氏菌简介 迟缓爱德华氏菌的流行病学 迟缓爱德华氏菌的感染途径 一 迟缓爱禧华氏菌的毒力调控网络 迟缓爱德华氏萤病的防治 细菌唾液酸酶研宄概况 细菌唾液酸酶简介 细菌唾液酸酶的结构 】.细菌唾液酸酶的功能 本论文的研究目的及意义 】 迟缓爱德华氏菌唾液酸酶的克隆、表达与活性检测 和方法 基围的克隆基因组的提取 】 脚基因的扩增 瑚%基因的序列鉴定和分析 基因的表达 】 蛋白原核表选菌株的构建 .重组蛋白的诱导表达.重组蛋白的纯化 .重组蛋白的复性 .重组蛋白的活生捡测 .结果与讨论 . 基园的克隆与序列分析 . 重组蛋白的表达纯化 . 复性蛋自的唾液酸酶活性. .本章小结 基因突变型菌株的构建和功能分析 材料和方法脚突变型菌株的构建 同源重组片段的克隆 重组自杀质粒的构建 同源重组获得突变体菌株生长状况的分析菌株对牙鲆致死率的测定 菌株对牙鲆组织侵染能力的测定菌株对牙鲆巨噬细胞呼吸爆发影响的测定 菌株在巨噬细胞中复制能力的测定菌株对牙鲆巨噬细胞免疫相关基因表达影响 的测定 .结果和讨论 . 突变型菌株的构建 . 菌株生长状况的比较 . 菌株对牙鲆致病力的比较 菌株对牙鲆巨噬细胞免疫指标影响的比较 . “ 菌株在牙鲆巨噬细胞中复制能力的比较 . 菌株刺激牙鲆巨噬细胞免疫相关基围表达情况的比较 .本章小结 的抗原保护效应检测 材料和方法重组蛋白保护效应的检测 抗体效价的检测免疫后牙鲆血清杀菌能力检测 .结果和讨论 .本章小结 结论参考文献 附录 致谢 个人与学术成果目 &自《????目自&% 绪论 迟缓爱德华氏菌研究概况 ?迟缓爱德华氏菌简介 迟缓爱德华氏菌五山研协砌,口掰是一种胞内寄生致病菌。于年由 从患病的日本鳗鲡中分离得到?。在分类学上属于肠杆菌科、爱德华氏菌属。其主要特征 为:革兰氏染色阴性,周生鞭毛,运动活泼,无荚膜且不形成芽孢.兼性厌氧.不耐酸 有机化能营养.可在盐浓度为%,温度为?.为...的条件下存活.适应 力极强”。该菌是一种广宿主致病菌.能够感染鱼类、两栖类、爬行类、哺乳娄甚至包括 人类八?.其中对水产动物的感染撮为普遍。作为一种重要的鱼类致病菌.每年给我国水 产养殖业造成巨大的经济损失四,尽管人们对迟缓爱德华氏菌的研究投入了巨大精力.咀 是目前还投有一种针对该菌的有效防治手段。迟缓爱德华氏菌的流行病学 迟缓爱德华氏菌分布广泛,在海水或淡水环境中都普遍存在,是一种常见的条件致病 菌,可以感染鱼类、爬行粪、两栖粪、鸟类等多种动物以及人粪。其中,主要感染鱼类、 爬行动物和两栖类等冷血动物。在世界范围水产养殖业中,迟缓爱德华氏菌能引起多种鱼 类爆麓爱德华氏菌病,如鲤鱼、鲻鱼、虹鳟、黑鲈、真鲷、罗非鱼、牙鲆、 大菱鲆、河豚, 鳗鲡等四,其中对鳗鲡养殖业造成的损失尤为严重,且常与链球菌混合感染,引起太规模 死亡。该病作为一种鱼类多发性疾病.一年四季均有发生,在高水温时更易爆发.所以夏 季该病尤为盛行,并且水质的恶化会促进该病的爆发。一旦爆发.传播迅速.死亡率极高。 养殖水体一般水温较高,且由于养殖密度较大,水质较差.在返种情况下更容易发病。水 环境中存在大量的迟缓爱德华氏菌.可以通过不同的方式进入鱼体包括腮、胃肠道或皮 肤病灶。进入鱼体后开始在鱼体内大量增殖.对肝脏和肾脏等脏器造成损伤,虽后扩大形 成全身性感染,导致鱼体发病?.严重时可引起痛鱼大批死亡,札记载的各种鱼粪感染迟 缓爱德华氏菌的症状来看,具有一些共同特征.如食欲减退、身体发黑、眼球突出和浑浊 身体表面或鳍条的基部有出血点、皮肤损伤、肌肉渍烂、肛突出、内脏器官脓肿等。缓爱?&自《????达自?目 作用一种人畜共患菌.迟缓爱德华氏菌对人类的感染也屡见不鲜,许多国家包括中国, 马来西亚、美国、意大利、日本、印度等都有关于人类感染的报道;人类主 要通过接触携 带病原菌的水源、水生生物或者食用未加工好的水产品等受到感染,作为一种肠道病原菌 迟缓爱德华氏菌主要能够引起胃肠道感染,致使人类出现肠胃炎,严重时还会导致肌肉坏 死、软组织感染、畋血症等症状。 】迟缓爱德华氏菌的感染途径 以迟缓爱德华氏苗感染人类为例.其感染途径如图.俨】所示。该过程主要分为六步, 首先迟缓爱德华氏菌侵入上皮细胞和肠胃组织并在其中定植复制,然后进一步在宿主体内 扩散入侵,并被吞噬细胞吞噬。迟缓爱德华氏菌选择在上皮细胞和吞噬细胞中生长繁殖来 逃避宿主天然免疫的杀伤作用进而在体内大量繁殖:当体内的细菌数目达到一定的数量. 由局部感染变成全身性感染。 图迟缓爱德华氏菌感染过程示意图 《~用绿色荧光蛋白标记的迟缓爱德华氏菌进行鱼体浸泡实验时显示,胃肠道上皮细胞、 腮和体表是主要的附着位点?】:在感染初期.迟缓爱德华氏菌通过鞭毛介导的运动接触并 吸附到宿主上皮细胞。通过比较迟缓爱德华氏菌的有毒株和无毒株三/的 胞外蛋白产物,证实鞭毛蛋白作为鞭毛的主要成分是一种重要的毒力园子四,此外,菌毛. 黏附素等在这一过程中也起到了重要作用,例如菌毛蛋白?,血细胞凝集素】.??目《?目??&自 自体运输黏附素等。当细菌黏附到宿主细胞表面后,在一些侵染相关蛋白的协助 下侵入到组织或细胞内.并在其中生长繁殖,例如溶血素在这一过程中发挥着重要 作用,其主要通过参与宿主细胞微丝的重排而侵入细胞”。 当迟缓爱德华氏菌成功侵入到胃肠道上皮细胞后,其型和?型分泌系统开始发挥重 要作用:促进病原菌的内化和胞内复制”“,并在相邻的细胞中进行扩散。随着宿主体内 瘸原菌数目的不断增加,能够进一步侵入到更深层的组织中,到达血细胞和淋巴。在这一 过程中,迟缓爱德华氏菌必须抵御宿主巨噬细胞和血清介导的杀伤作用才能存活下来。目 前已发现许多基因与这一过程密切相关。酸中和基因如删瑚能够保护迟缓爱德华氏苗在胃 肠道和巨噬细胞的酸性环境中免受损害,拓椰即删别编码过氧化氢酶和超氧化物歧化 酶这两种酶能够消除巨噬细胞杀伤病原菌过程中所产生的不同形式的毒性 氧 和 ,避免氧化损伤盖。此外.有研究显示巨噬细胞内存活的迟缓爱德华氏菌 其型舟泌系统的组成蛋白例如和的表达量明显上调.表明型分泌系统与迟缓 爱德华氏菌在巨噬细胞中的存活有关”】。【型分泌系统最主要的特征是其针状复合物结 构,在感染过程中.病原菌通过针状复台体直接将效应分子注入宿主细胞质膜内。型分 泌系统使得迟缓爱德华氏菌能够逃避吞噬细胞的吞噬作用,在吞噬细胞内生存繁殖:?型 分泌系统基因如,硎々缺失会导致迟缓爱德华氏菌在宿主体内的增殖能力下降,表明?型 分泌系统与迟缓爱德华氏菌的感染能力密切相关。?型分泌系统使得迟缓爱德华氏菌能 够在宿主体内定殖,造成严重的系统性感染.最终导致宿主死亡。 在整个感染过程中,迟缓爱德华氏菌必须从宿主体内获得营养来维持自身的生存繁 殖.比如无机磷酸盐和铁分子。当处于宿主体内时,营养物质相对缺乏,尤其是在上 皮细胞和巨噬细胞中,无机磷酸盐的含量较低,为了获得该种生理生化反应所必须的 营养物质,磷酸盐特异转运 口.操纵于被启动,不断的将环 境中的转运到细菌体内五。铁对于细菌在宿主细胞内的生存繁殖也是非常重 要的,一些 铁相关基因的缺失都会导致细菌的毒力降低如./芳基硫酸酯磺基转移酶基困?】、 基因 基因四、出? 四等。此外.一些胞外酶如溶血索、软骨紊酶、胶原蛋白酶等都与细菌在宿主体内的传播 扩散有关。 迟缓爱德华氏菌的毒力调控网络 病原菌要想成功在宿主体内定植,对宿主造成持续的感染,还必须适应宿主体内的环 ?&自《???《日%日 境。迟缓爱德华氏菌具有多种调控系统,能够感应各种环境变化如温度、州、渗透压、 抗菌肽的存在等和营养短缺“、。、磷酸盐等,调节自身代谢。迟缓爱德华氏 菌的调控系统包括双组分系统、群体感应系统和一些其它的调控因子.各个调控于之间相 互协调,交互作用.对各种环境条件及时的做出反应.选择性的表达不同的毒力基因】: 图.四中列出了迟缓爱德华氏菌中各种已知的调控系统及其相互作用。 双组份系统通常由感应蛋白和转录调控蛋白两部分组成,感应蛋白是一种具有组氢酸 激酶活性的跨膜蛋白.能够被环境变化或信号分子所激活,自身磷酸化并将 磷酰基基团传 递给细胞质中的调控蛋白从而将其激活,激活的调控蛋白结合到特定的启动子上调控毒力 基因的转录四。迟缓爱德华氏菌中已经报道的双组分系统包括’”、 一感受温度、’浓度以及抗菌肽、。感受磷酸盐的浓度 点埘感受渗透压、.感受宿主的信号分子如肾上腺素等,各双 组份系统单独或交互作用,通过感受到的信号调控迟缓爱德华氏菌的?型分泌系统、?型 分泌系统、溶血素以及菌毛、鞭毛袁达等。 细菌之间利用群体感应系统进行信息交流,即细菌以自发产生并释放的自诱导物质 作为信号分子,根据其浓度感知周围环境中自身或其它苗群的密发大小, 当信号浓度达到自界值时,能启动细菌体内相关基囡的表达,调控细菌的生物行为来适应 环境的变化.如形成生物膜、产生毒素和胞外酶、产生抗生素等。迟缓爱德华氏菌中的 /.群体感应系统能够调节生物膜的形成,调控?型分泌系统相关基因的表达水平, 与细菌的致病性密切相关: 总之.迟缓爱德华氏苗通过各种调控系统感应外界环境中的各种信号,适时开启各种 毒力因子和效应蛋白的表达,形成一个复杂的毒力调控网络对宿主进行感 染。蹑置博&自《&??;功能日 ’ ? 嘲 、 / \。鼍》玎” \ /” ? ?岬 一四。 .吼四” 叫啪 。。州七 一’雌。 囤『.迟缓爱德华氏菌的毒力调控网络 姬 %? 钏 埘洗,迟缓爱德华氏菌病的防治 目前的水产养殖业中,仍主要依靠传统的消毒剂和抗生素来防治迟缓爱德华 氏菌病, 此种方式虽然在一定程度上缓解了迟缓爱德华氏菌对水产动物的危害,但其 产生的负作用 也越来越明显,不仅导致药物残留、水质恶化、环境污染和耐药菌株的频繁 出现.破坏水 体的微生态平衡.还带来食品安全隐患,影响了海水养殖业的健康可持续发展。因此研究 实用、高教、绿色环保的新型防治手段迫在眉睫.疫苗防治的健康养殖模式成为防治迟缓 爱德华氏菌病的趋势。近年来,国内外专家在退缓爱德华氏苗的疫苗研宄与开发工作取 得了不少进展。包括趣缓爱德毕氏菌的灭活疫苗、弱毒株制备而成的减毒活疫苗活陋”班 《?&《?女自?? 及亚单位疫苗】。但由于迟缓爱德华氏苗存在多种血清型,增加了疫苗研制的难度。经 过多年的探索.至今还没有开发出一种针对不同血清型的迟缓爱德华氏菌都能广泛适用的 疫苗。因此想要建立一种高效、绿色环保的防控迟缓爱德华氏菌感染的措施就必须对该菌 的致病机制进行更加深入、系统的研宄,包括毒力因子、鱼类的免疫应答机制以及病原菌 与宿主的相互作用。另一方面.尽管已报道的许多疫苗对鱼类迟缓爱德华氏苗病都有一 定的保护作用.但大都是在小范围实验条件下所得到的结果,要想投入实际生产直用,其 安全性和有效性仍有待进一步考察。 细菌唾液酸酶研究概况 细菌唾液酸酶简介 唾液酸是一种酸性氨基耱,由个碳原子组成.并具有吡喃糖结构,是生物杂聚物的 重要组成部分?,主要以短链残基的形式存在于细胞糖类复合物的末端,例如寡糖、多糖. 糖蛋白、神经节昔脂和脂多糖等】。其基本化学结构如图所示,由于号碳上连接基 团的不同形成了不同的唾液酸衍生物,例如一乙酰神经氧酸。 图唾液酸的一般结构女 图显示了唾液酸旗的多样性四.其中、、可以技不用的官能团所替代, 这种唾液酸结构的多样性与细胞表面的含唾液酸的糖类复合物的生物学功能密切相关.此 外唾液酸分子内部可以形成氢键,使得分子本身结构更加稳定。《%置德&自《??女&&功《日 、?,、 ?. ?、?,.、 图唾液酸族的多样性 畸 在高等动物.原生动物,致病性真菌.病毒和细菌中,以乙酰神经氨酸为例,其主 要是通过叶 或,酮苷键连接到帖多糖.凸多糖或鞘磷脂末端的半乳糖.?乙酰半 乳糖胺和.乙酰葡糖睦上,或通过. 酮苷键连接到另一廿于的一乙酰神经氨酸上位 于细胞表面的糖类复台物中寡糖链末端的唾液酸具有重要的生物学功能.能介导细胞的黏 】。唾液酸作为一个末 附.受体配体的结台,细胞与细胞、细胞与分子之间的相互作用 端基团.能被唾液酸酶从大分子复合物上水解下来,例如流感病毒的致宿和传播与细胞膜 表面的唾液酸密切相关,流感病毒唾液酸酶能识别并清除宿主细胞表面的唾液酸.然后侵 入宿主细胞造成感染。 唾液酸酶,?.是作用于非还原末端具有唾液酸的寡糖、糖 蛋白质、粘蛋白、糖脂质,使其酮糖苷键发生水解而放出唾液酸的酶的总称在病毒,细 菌和脊椎动物中广泛存在畔,在高等的真核生物中.唾液酸酶能修饰细胞表面的唾液酸类 糖蛋白,井通过其介导细胞的识别和黏附来调节细胞与细胞、细胞与分子之间的相互作用 】。在原核生物中,有超过种微生物中都有关于唾液酸酶的报道.且大多数产唾液酸 酶的微生物都具有致病性或者能有宿主共生。到目前为止,有大约种微生物 唾液酸酶 的生化特性已经被报道,其中有至少八种已经获得晶体结构表?忡】。??爱 《?&?克&功能日 』栅?? %: ? “岫啦魄【 ? 州业??;口衄 “曲趣?叫曲 ‘研】? ?酬“ ??盘?岫 ?“ “?:、々 二.‰』?“ 】? 璐: 删九 吐?嘴? :??:“ ?%】? 岫 一 吼目脚“ ?????“ %四 ? 一?‘ :《?口雠刊 帆叫峨州?蝌&曲虹? 州 址嗽】呻“ :?岫?眦“ ?口 ?“?】 删缸 曲呷? 女自咄?弘 衄眦:缓日《《《?日%?女《《日能日 一 ‘ ~ 、【一、 ’..’ 一 , . ?: 。. .一 一 一~ 一 、一 .一一? ’.“ 一’ ’ ??????????????????????????????????一 ?一.、? ?“ ;‘ “?一 .呲瑚目“ ?咄 期、缸 : 々噍? 二“?日口? 皿岫 呷十虹 皿口岫耐叶 ; . 吐山 ? 咄‘阱 “?山御“州 ?岫九 哪? ?~艘虮础帅 吐吐 ?; ? ? 、碰 ? 口口 出嘧 日?蜕 ; ??口 四 、醛 : 日: ? ,,‘搬?:山 晒出曲神 抽 ?、日?缓爱? 自《?&《???自&日 ? 一 曲?自讪 吐?正 :“? 蛔啦 。? 啉【由 刎,舻 :‘ ??,? , : :~ 『口“ 口越?? ?四 丘瞰四 ? 叶?《靠 ,,、》一, ‰? 口蚪‘ 口北?【 日? 五刚??? ?. ??“? ? ?嘶 出正?鼽,?山。 ? ?柚、瞄 ‰“ ’小?由 ?《 曲船眦础 :妇?口腻? ‰出口删 州四呷 “?.?? 呲 到二曲酬 矗’? 甑斗 眦 “ “ 涮斗蛔”?础 、站 “?孙 岫口强 : ?? ?洲蝴“舶 ’?:【?“: 佃回 ,,,八? ‘?? 抽蹦栅血岫 ?’“昀? 蛐 “ %““‰ ? 、盎镪毯卑酶。唧一?删曲四靴口。%跚却?峨??? 帮越 ,?枷嘲其它都属于致病苗, 相对活性是蚍唾浪酸酶的最高水解活性为%来定义的。 多聚体形式 单体形式 缓爱缚&自《??《?克《&选与功自日 .细菌唾液酸酶的结构 细菌唾液酸酶整个氨基酸序列的同源性虽不到%,但其唾液酸结构域的拓扑 学结构 却是相当保守的,都含有一些特殊的和氰基酸残基图忡】。所有非病毒起源的 细菌的唾液酸酶中的唾液酸酶结构域都包含个? 代表任意氨基酸图四.而且都位于拓扑学 /??./ 结构的折叠片中图】. ,但我们还不清楚其具体功能卅。在第~个.上游 还含有一个/其中的残基与活性部位的开;或有 ”, 茏訇一,怍用于废物的.乙酰神经氢酸的羧基基团【”】. ?口 ???????????????????????????? ~。?。’:一 ?????????????????????一:。 一 一 一一一』??.,艇.? 舯孑 《蒜 “一一 ‘。。.‰;?” 图细菌唾粳酸酶的结构示意图 墙. ,其 唾液酸酶的活性部位包含个保守的.个,对舭和,个一 叫, 中保守的是催化反应的亲核试剂.在的协助下发生亲桉反应七. 在催化反应中作为酸性基团而起作用”.活性部位的其它氨基酸圈中被标记出来、 可能与底物的特异性、催化效率以及催化反应的动力学有关。 大多数细菌的唾液酸酶通常包含一段信号肽序列、具有催化活性的唾液酸酶功能域和 其他一些与底物结台或酶的定位有关的功能域图一 .例如类凝集素结构域和膜锚定 结构域,具有信号肽序列或膜锚定结构域的唾液酸酶能分泌到胞外或锚定在膜上来水解宿 主细胞表面的末端唾渡酸残基旧。粪凝集素结构域一般位于唾液酸酶的.端或.端,通 常为.个,其能够识别与唾液酸相连的寡糖.从而能够增强底物与酶之间的结合。,然 而在有些细菌的唾液酸酶中并不包含该功能域。?爱?&自《?《目?女&自&日 咻 :.?: ? 薹薹 啦. :锄;: .咖,州 帅? 蹦.岫 唯瑚? “ 图 的部分序列与其同源物之间的序列比对结果 /卯 叶表唾液酸酶的保守性位点.:代表保守的可营代位点.电线代表可变区域. 实线代表口七 代表活性部位的三个精氟酸,代表活性部位的其它氟基酸, 《。“一 “??甜『 氍一帅% 日?目 ? ?爱《&自《?自?女女功《日 一\二 、 、 图一白喉杆苗唾液酸醐的结构模型。 为的整体结构为卸的活性中心.为唾液酸酶的催化机制。 群 . 赶 .细菌唾液酸酶的功能 总体来说.细菌的唾液酸酶主要与营养及致病性有关??:像微生物中发现的其 它糖苷酶一样.细菌的唾液酸酶能够水解含唾液酸的糖蛋白、糖脂和其它糖类复合物末端 的唾液酸来为细菌的生长提供碳源雏”:调节生物膜的形成陋”通过暴露宿主 调节宿主的免疫反应【“舶】。许多己报道 细胞表面的受体进而促进病原菌的感染 的细菌唾液酸酶都与细菌的致病性有关.例如 铜绿假单胞菌??&苗&的?&女;?自日 的唾液酸酶与生物膜的形成密切相关,该基因的突变株不能在小鼠呼吸道定植,丧失了感 染呼吸道的能力?。霍乱弧菌?曲即/依靠霍乱毒素与宿主细胞结台.在此过程 中.唾液酸酶能够将宿主细胞表面复杂的神经节苷脂去唾液酸化,转化为霍乱毒素的受体 】,促进病原菌与宿主的结合。肺炎链球菌./的唾液酸酶具有 三种同工酶:、『和,其中的功能仍未知,其它两种均与毒力有关 蛋白锚定在细菌细胞膜表面,通过其水解酶活性暴露出宿主细胞表面的受体来促进 病原菌对鼻咽内皮细胞的侵染和呼吸道的感染睇,此外有研究表明有助于细菌的生 存,通过水解下来的唾液酸为自身生存提供碳源,同时通过对其它细菌表面进行修饰来 发挥其竞争优势”:是一种分泌型胞外酶,与肺炎链球菌引起的呼吸道感染和败血 症有关【州。 本论文的研究目的及意义 作为一种严重危害水产动物的致病菌,迟缓爱德华氏菌已经在二十多种鱼类中引起病 害.给水产养殖业造成了巨大损失。为了有效防治退缓爱德华氏菌,必须对其致病机制进 行系统、清晰的阐释。近年来国内外有关迟缓爱德华氏菌的研究取得了一定的进展.对其 致病相关因子的研究已逐渐深入。本文中.我们对迟缓爱德华氏菌的唾液酸酶进行研究. 通过构建唾芟酸酶基因的突变株来探讨迟缓爱德华氏菌唾液酸酶与该菌致病力之问的关 系。本研字己有助于我们进一步了解迟缓爱德华氏菌的致病机理.并为防治迟缓爱德华氏苗 病提供了一个可能的新途径, 迟缓爱德华氏菌唾液酸酶的克隆、表达与活性检测 根据网站上提供的迟缓爱德华氏菌株的唾液酸酶基因序列设计引物. 以实验菌株为进行序列扩增,并利用生物信息学方法进行序列鉴定.分 析预测 其功能。根据分析预测结果,结台文献查阅,对唾液酸酶进行体外重组表达, 并针对该酶 的功能进行蛋白活性检测。?爱?自《&?%?《《《功能日 材料和方法 菌种和质粒 实验菌株迟缓爱德华氏菌由所在实验室人员分离改造得到:大肠杆菌点// 与三菌株购自于天根生化科技有限公司:表达载体由所在 实验室人员构建保存; 购自公司。 三的培养温度为, 翻一的培养温度为?.细菌培养基采用普通 培养基.如不加特殊说明,细菌培养昕使用的各种抗生素的终浓度分别为:氨 /.四环素: 苄青霉素: /,氯莓素: /,卡那霉素: : ?掣,硫酸多粘菌素 / 药品和试剂 / //】限制性内切酶、聚台酶、连接酶、 聚合酶购自 :琼脂糖凝胶回收试剂盘、质粒提取 试剂盒购自上海生工生物工程有限公司:回收蛋白的亲和柱购自公司 唾液酸酶底物血?话“ 购自 公司。 其他常规药品和试剂均购自上海生工生物工程有限公司。 主要仪器 移液枪: 仪: 凝胶自动成像系统:上海培清科技有限公司 电泳仪、和蛋白电泳设备:中国北京市六一仪器厂 紫外分光光度计: 、 电子天平: 超滤纯水系统: 台式玲冻离心机: 振荡培养箱:国华? 隔水式恒温培养箱:上海一恒科技有限公司 超声波细胞粉碎机:宁波新芝生物科技有限公司 .和甚?冰箱:青岛海尔公司 %爱?&《?目??克?;功自日 。 荧光分光光度计:日本 实验中的所有引物台成均由上海桑尼生物科技有限公司完成.序列测定均由 公司完戋,哮列比对于数据库中进行; 】基因的克隆 基因组的提取 为获得反应模板,首先提取迟缓爱德华氏菌株的基因组。具体方法 如下: 】收集菌体取适量新鲜培养至对数期的菌液于离心管中.于 离心。 洗涤:将收集的菌体重悬于 %的溶液中进行洗涤.并于.离心 可重复一次。 裂解:倒掉洗涤液,加入 缓冲浈其中台有/的溶菌酶将菌体吹打 %的总体积为.将离心管温和的上下颠倒数次使液 混匀,再加入 体充分混匀,?水浴中孵育,观察菌甏裂解至澄清后将离心管取出,时间一般 在 以上。 抽提:加入等体积的苯酚.氯仿混合液体积比:使蛋白质变性沉淀.充分混匀 后 抽提蛋白质。 ”离心 离心后溶液出现明显的分层,轻轻的将最上层液体吸出转移至一新的 离心 管中并 用缓冲液将体积补足至山.按上述步骤反复抽提,赢至中间的蛋白质层消夫 为 止在抽提过程中尽量防止发生断裂降解. 吸出上层液体转移至一新的离心管中一并用缓冲液将体积补足至/再 ,除去苯酚。 加入相同体积的氯仿与之充分混台,.×离心 沉淀:吸出上层液体转移至一新的离心管中,加入/体积的 将离心管温和的上下颠倒数次,再加入相同体积的异丙醇沉淀, 离心 。 洗涤:缓慢的吸出上清,将沉淀用/的醇进行洗涤, ,将液体 ×离心 尽量吸干后室温干燥约 .以充分晾干酒精。 溶解:加入适量叽含有的缓冲液溶解基因组。 鉴定:取山进行凝胶电泳,检测基因组是否提取成功,并根据其质量及浓度 来确定作为模板时的使用量,使用时可适当稀释。 缓%?《酶?克&选与自能日宄 基因的扩增 唾液酸酶基因的引物是根据己完成全基因组测序的迟缓爱德华氏菌 的标准菌株进行设计的。为莸取基因全序列,根据基因组 数据库中提供的信息.利用 .,在基因两端设计引物.并以提取的 基因组为模板.通过扩增得到基因片段,以下是引物序列: 巩 :。 :一 在微型离心营中配置如下反应体系: : : 山 /:. ?: 模板基因组: 山 ? 酶: 加补足体积至?。 采用两步法进行删基因的扩增.程序设置如下: ?预变性 ?变性 退火 个循环延伸 ?变性 ?退火 个循环延伸 延伸 获得的产物不易长时间存放,尽快进行下一步实验。 基因的序列鉴定和分析 凝肢的回收纯化 将获得的产物进行%琼脂糖凝睦电泳分析.并按照凝胶回收纯化试剂盒进行 割 胶回收。步骤如下:《埋※??《目??&目自自目 用刀片将含有目的条带的凝胶切割下来,保持目的条带的完整并尽可能多的 切除多余凝 胶部分,将切好的胶体转移至干净的 离心管中。 加入适量体积溶胶液约为凝胶体积的倍.置于.水洛中使肢体充分融化。 待胶体完全溶解后,将融化的溶胶液转吸附柱中,室温静置后,离心 。 将过柱液重新加入吸附柱中.进放结合,步骤同上。 对吸附柱进行漂洗. 倒掉过柱液.将吸附柱重新放入收集管中,加入 : 离心 倒掉废液.将吸附柱重新放入收集管中。重复上述步骤一次: .尽量甩出吸附柱中的液体。并将吸附柱开盖置于室温 剧掉废液一 .空离 晾干约。 向柱子膜中央小,入?洗脱液,取一干净的 离心管进行收集,?水浴 ,洗脱收集目的片段纯化产物。 分钟..×离心 获得的纯化产物于一保存,用于下一步的连接转化实验。 产物与载体的连接转化 将上步腔回产物与克隆载体 进行连接。在微型离心管中配置如下反 应体系:纯化产物?, ,?水浴中连接。然后将过夜产物 进行转化。在此之前需制各大肠杆菌 感受态细胞,制作方法如下: 为保证制各出纯的感受态细胞首先对保存的三菌种进行纯化,吸取少许菌液 于固体培养基上,用接种环进行划线.倒置培养过夜。 待长出单克隆后挑取一个饱满的单菌落.接种于舍有液体培养基的试管中, ,一叫培养至细菌对数期。 夜晚取上述培养物接种至锥形瓶中,加入液体培养基,于 摇床 枷过夜振荡培养,为避免第二天菌液浓度超过预期值.可以适当减少接种量. 调慢转速。 第二天,对菌液的瑚值进行跟踪测量.每小时测量一次。当测得菌液的。 时.说明已经达到制各感受态的标准,可以取出锥形瓶置于冰上放置预冷,同 时 将转化缓冲液以及无菌离心管进行预冷备用。 将预冷好的苗液置于?离心机中,×离心收集菌体。 迅速倒掉上清,加八 预冷的转化缓冲液.井用移液枪轻轻将菌体吹打均匀 ?缓爱蟪&煞《?醴酶的克&&选与功能目吃 整个感受态制番过程均严格在冰上操作并防止染菌:于以.离心 收集菌体。并重复上述操作一次. 倒掉上清.并尽量吸干.根据菌体的体积加入适量预冷的转化缓冲教轻轻将 菌体 重悬菌液沉淀一般加入,并加入终浓度为 %的二甲基亚砜, 。 充分混匀后于冰上放置 制备好的感受态细胞于冰上迅速进行分装,用液氮进行速冻后置于一?冰箱 冷冻保存。 将上述连接产物转化迸制备好的大肠杆菌感受态细胞中: 将.冻存的感受态细胞置于冰上.待融化,加入上步所得连接产物,轻轻旋转 枪头 以幌匀,继续于冰上放置约分钟, 将水浴锅调至?.热激后.迅速取出.并在冰上放置舒钟. 加入州左右液体培养基.?振荡培养。 从摇床中取出离心管, ×离心 .倒掉上清,在管底保留约的液体, 将底部的菌体重悬后.均匀涂布在舍有 /、/和? 。 /三种抗生素的固体平板上.转入培养箱倒置培养 转化于的筛选与鉴定 根据?互补原理通过蓝白斑法对重组子进行筛选。 载体包含胁操纵 子序列,外源序列的插入会改变一半乳糖苷酶基因的正常表达,从而使得阳 性克隆呈 现白色菌落,而未插入片段的阴性克隆呈现蓝色菌落,挑取白色菌落.进行鉴 定。 待上步培养的平板长出明显的蓝白斑后,在无菌状态下,用枪头挑取白色菌 落悬浮于 的无菌.一中.用移液枪吹打均匀。然后通过检测重组子,在微型离心管中 配置如下反应体系: : ? : 载体引物或基因正向引物“: ? 基因反向引物或“: ? 模板苗落混合液:.? 酶: 加入补足体积至 山。 反应程序设置如下: 《缓爱缚自《&?目的克?与功《日 ?预变性 变性 、 退火 个循环 延伸?延伸 程序运行完毕后取出产物进行%琼脂糖电泳.检测有无目大小条带.若载体自 连.则无法检测到明显条带。 重组子的序列测定 筛选出的阳性克隆培养后,送往公司进行测序由于插入的目的片段较长 利用和 对 的插入片段进行正反向序列测定, 基因的鉴定 将测序得到的基因序列用正确拼接后,用等网络资源进行序列比对和 蛋白结构分析。 基因的表达 蛋白原核表达苗株的构建 克隆载体的构建: 以,【”为引物.以提取的 基因组作为模板.对的唾液酸酶结构域进行扩增,并通过琼脂糖凝胶电泳的 方法进 行鉴定,并对目的片段进行分离纯化然后与 载体进行连接转化.挑选。 插入了目的片段的阳性克隆进行测序详见 质粒的提取: 将上一步测序正确的阳性克隆进行培养,提取插入了正确目的片段的 质粒。具体操作过程如下: 接种吉有正确目的片段的 质粒的大肠杆菌,在培养基中振 荡培养过夜。 取过夜培养的苗液于离心管中, .离心.收集苗体,根据菌体的 量确定是否重复该步骤。 用?先检查是否己加入,使用移;夜器或涡旋振荡器彻底悬浮细 菌沉淀,再加入等体积的 .温和的上下轻轻翻转次,使菌体充分裂解。 《?蛏?&?《&《??《&自&? 注意:加入 后一定要轻轻的上下颠倒进行混合,若动作过于剧烈,可能会打 断基 因组。混台时间不宣过长.控制在以内,混台后的液体应变澄清粘稠。若加 入的菌体过多.则可能裂解不充分, 加入山的.温和的上下轻轻颠倒次,此时将出现白色絮状沉淀。 离心 ,确保沉淀完全沉降于底部。 注意加入 后应立刻混台避免产生局部沉淀。离心后若上清中还有微小白色沉 淀.可再次离心. 。然后将上清小心吸出 吸附柱中加入山进行平衡,.。离心 转移至吸附柱中一定避免吸到底部沉淀。室温静置. .×离心.可 将滤浓重新转移至吸附柱中进行二次结台。 倒掉滤液,加入山 先检查是否已加入乙醇于吸附柱中进行洗涤. . .离心 ,倒掉滤液后再次 弃滤液.加入 进行二次洗涤..离, ,将吸附柱中残余的漂洗液去除。 ×离心 注意 中的乙醇残余会影响后续的酶反应酶切、等】实验为确保后续实 验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱开盖置于室温放置数分钟以彻底晾干 吸附材料中 残余的漂洗液: ,室温 将吸附柱置入一个干净的离心管中.向吸附膜的中间位置滴加 放置? .离心 ?收集得到质粒。 取 质粒溶液进行琼脂糖凝胶电泳,检测提取质粒的质量和浓度,剩下的质粒 溶液置于一冰箱保存待用, 质粒的酶切: / 进行取酶切,并回收带酶切位点酶 将上步所得的质粒用 切末端的目的基因片段。酶切反应体系为: : ? 质粒: 限制性内切酶: 各 山 加入补足体积至山。 置于水浴中双酶切,取山进行琼脂糖凝胶电泳检测是否切开,若条带 较弱,可继续进行酶切:若已切出明显目的条带.则对目的片段进行割胶回收 胶回收的 &?自《&??自&? 步骤同上。 表达载体的酶切: 和 酶切体系同上.在水沿中酶 质粒中加入限制性内切酶 切后.取山进行琼脂糖凝胶电泳检测是否切开.用未进行酶切的载体作为对 照 再通过腔回收获得到线性化的载体腔回收的步骤同上, 表选载体的构建: 将两端分别带有 和 酶切位点酶切末端的基因片段与同样经过取酶切 的线性载体进行连接,连接体系为: 片段: ? 线性化质粒: : 刖 :.? 加补足体积至山,在水浴中连接。 采用普通化学转化法将上述连接产物转化至感受态细胞 中具体方法参 照 。利用质粒的抗性.挑取在含抗生素的平板上长出的克隆 用载体上的引物、分别与插入目的片段上的正向、反向引物配对进行 检测,筛选出正向连接的阳性克隆菌落。 表达菌株的构建: 接种步骤中挑取的正向连接的阳性克隆.并提取该菌株中所含有的质粒. 采用普通化学转化法转化至点感受态中。挑取在含抗生素的平板上长出 的阳性克隆命名为: ..重组蛋白的诱导表达 按照系统蛋白表选手册中的说明.利用原核表选系统进行重组蛋白的表达。 具 体步骤为: 液体培养基的试管中. 将含有表达载体的阳性克隆 /接种于含 加八抗生索,置于摇床, ,过夜培养。 将上述培养液按%的接种量接种至 】台有抗生素的液体培养基中进行扩 大培养为了摸索诱导条件.一般接种瓶。摇床, /振荡培养, 后 开始进行跟踪观测.当菌体浓度达到枷? 时方可加入进行诱导,每 《缓爱蹲营《&酶的克自能日 菌液中加入 /诱导前吸出苗液转移至试管中作为未诱 导对照继续培养.设置几个不同的诱导温度以寻找最佳诱导条件通常设置温 度为 ?、?或? 旧继续培养适当时间通常为后离心收集苗体 检测重组蛋白的表选形式。根据探索好的条件获得诱导表达后的菌体沉淀, 加适量 裂解液含有终浓度为 /溶菌酶重悬苗体.置于?反复练融然后使用超声 波破碎仪器破碎细菌,超声波破碎仪的使用功率为.工作次.每次持续 间隔,冰浴中破碎菌体至菌渣变为澄清。离心机中 离心:将 上清液转移至新的离心管中.沉淀加入适量 于室温下裂解?。 于室 将未诱导的对照于离心管中 ,然后加入 离心 温下裂解?, 将超声获得的上清和重新裂解的沉淀以及未诱导的对照同时进行聚丙烯酰 氨 凝胶电泳.分析,检测表达的重组蛋白是以活性形式还是包涵体形式存在. 以确定该蛋白的纯化方式。 聚丙烯酰氧凝腔电泳的具体操作步骤如下: 】将胶板洗净,晾干后装入蛋白电泳架上固定备用,注意蛋白电泳架一定要放于水平的 桌面上。 先将配好的%的下层分离胶注入两胶板中.然后上面加盖一层异雨醇,以压平液面 并隔绝空气.同时使聚丙烯酰胺较快凝固。待分离胶凝固后将上层覆盖的异丙醇倒出 并用清水冲洗干净。再将配好的%的上层浓缩胶注入两胶扳中.确保液面上方无气泡 后迅速插入加样梳,置于室温或培养箱中进行聚合,待凝胶完全聚合后小的拔 掉加样梳注意一定要等凝胶充分聚合再拔梳子.否则凝胶容易断裂。在电泳槽中缓 缓注入电泳缓冲液,慢慢加满,使其殳过加样孔, 蛋白样品与【/体积的蛋白样品缓冲液混台,于沸水浴中煮沸 以上使蛋白变性, 加样时微量移液器的枪头深入到加样孔中缓慢加入蛋白样品.所加样品的界面不应超 过加样孔的高度。调整电压为进行电泳.当溴酚蓝指示带刚好由浓缩胶迁移至分 离胶时此时条带压缩至细长状.可将电压调高一般低于继续电泳,直至 指示带到达凝胶底部.鲒束电泳。 小心地将凝胺从胶板中取出.放于染色液中染色个小时左右.再将凝胶从染色液中 取出,放置脱色渡中脱色.可多次更换脱色液,直至能够清晰地分辨出凝胶中的蛋白