诱导小鼠胚胎干细胞向牙齿上皮样细胞分化的实验研究

诱导小鼠胚胎干细胞向牙齿上皮样细胞分化的实验研究 分类号 密级 国际十进分类号(UDC) 第四军医大学 学 位 论 文 诱导小鼠胚胎干细胞向牙齿上皮样细胞 分化的实验研究 (题名和副题名) 宁 芳 (作者姓名)指导教师姓名 段银钟 教授(主任医师)指导教师单位 第四军医大学口腔医院正畸科申请学位级别 博士 专业名称 口腔临床医学(正畸)论文提交日期 2010.04 答辩日期 2010.05论文起止时间 2008 年 4 月至 2010 年 4 月学位授予单位 第四军医大学 独 创 性 声 明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关。 论文作者签名: 日期: 保 护 知 识 产 权 声 明 本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。 ，可以采学校可以公布论文的全部或部分内容(含电子版，保密内容除外)用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入《中 ，同意按国优秀博硕士学位论文全文数据库》和编入《中国知识资源总库》《中国优秀博硕士学位论文全文数据库 第四军医大出版章程》规定享受相关权益。 论文作者签名: 导师签名: 日期:学博士学位论文 诱导小鼠胚胎干细胞向牙齿上皮样细胞 分化的实验研究 研 究 生:宁 芳 学科专业:口腔临床医学(正畸) 所在单位:第四军医大学口腔医院正畸科 导 师:段银钟 教授(主任医师) 金 岩 教授(主任医师)资助基金项目:国家自然科学基金 No. 30725042关键词:胚胎干细胞;牙源性上皮;牙齿再生;微环境;组织;成 釉细胞 中国人民解放军第四军医大学 2010 年 5 月 第四军医大学博士学位论文 目 录缩略语 表 ................................................................................................................ 1中文摘要 ................................................................................................................ 3英文摘要 ................................................................................................................ 7前 言 .............................................................................................................. 12文献回顾 .............................................................................................................. 14正 文 .............................................................................................................. 23第一部分 小鼠胚胎干细胞的培养与鉴定......................................................... 23第二部分 成釉细胞无血清条件培养液诱导胚胎干细胞分化的研究............. 30 实验一 成釉细胞无血清条件培养液诱导胚胎干细胞分化的体外研究 31 实验二 成釉细胞无血清条件培养液诱导胚胎干细胞分化的体内研究 43第三部分 发育期牙胚细胞条件培养液诱导胚胎干细胞分化的研究............. 51小 结 .............................................................................................................. 60参考文献 .............................................................................................................. 61附 录 .............................................................................................................. 75个人简历和研究成果 .......................................................................................... 82致 谢 .............................................................................................................. 83 第四军医大 学博士学位论文 缩略语表缩略词 英文全称 中文全称AKP alkaline phosphatase 碱磷酶染色AMBN ameloblastin 成釉蛋白AMGN amelogenin 釉原蛋白 ameloblasts serum-free conditioned 成釉细胞无血清条件ASF-CM medium 培养液BMP bone morphogenetic protein 骨形成蛋白CBB ceramic bovine bone 陶瓷骨 羟基荧光素二醋酸盐CFSE carboxyfluorescein succinimidyl ester 琥珀酰亚胺脂CK14 cytokeratin 14 细胞角蛋白 14DMP-1 dentin matrix protein 1 牙本质基质蛋白1DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜DSPP dentin sialophosphoprotein 牙本质涎磷蛋白EB embryonic body 拟胚体EC embryonic carcinoma stem cell 胚胎瘤干细胞EG embryonic germ cell 胚胎生殖细胞EpiCM epithelial cell medium 上皮细胞培养基ESC embryonic stem cell 胚胎干细胞FBS fetal bovine serum 胎牛血清 -1- 第四军医大学博士学位论文缩略词 英文全称 中文全称HERS Hertwig’s epithelial root sheath Hertwig 上皮根鞘HESC Human embryonic stem cell 人胚胎干细胞ICM inner cell mass 内细胞团LIF leukemia inhibitory factor 白血病抑制因子MESC mouse embryonic stem cell 小鼠胚胎干细胞MSX2 msh homeobox 2 同源异型盒基因 Msx2NEAA nonessential amino acids 非必须氨基酸OCN osteocalcin 骨钙素OCT4 Octamer-4 结合转录因子4 配对盒家族中的转录PAX9 paired box homeotic gene 9 因子9 platelet endothelial cell adhesion 血小板内皮细胞粘附PECAM-1 molecule-1 分子-1PGC primordial germ cell 胚胎生殖细胞 干细胞表面标志性抗SSEA-4 stage-specific embryonic antigen-4 原4TGC-CM tooth germ cell conditioned medium 牙胚细胞条件培养液 -2- 第四军医大学博士学位论文 诱导小鼠胚胎干细胞向牙齿上皮样细胞 分化的实验研究 博士研究生 :宁 芳 导 师 :段银钟 教授 金 岩 教授 第四军医大学口腔医院正畸科，西安 710032 中文摘要 牙齿的发育过程是依赖于预定牙齿发生部位的上皮组织与其下方的间充质之间的相互诱导而发生的。因此，牙齿的生物性再生至少需要两种细胞:釉质形成所需的牙源性上皮细胞和形成牙髓牙本质复合体的牙源性间充质细胞。到目前为止，有关牙源性间充质细胞的替代研究较多，例如成体的牙髓干细胞、骨髓基质细胞、皮肤的真皮细胞以及毛囊细胞等均被具有向牙源性间充质细胞转化的能力。然而，在寻找合适的细胞向牙源性上皮细胞替代方面成功的研究较少。尽管有学者认为成体骨髓来源的细胞可以向成釉细胞转化，但是它可以同时向成釉细胞样细胞和牙源性间充质细胞这两种细胞转化的能力限制了它的应用。有研究在组织工程牙齿的构建中口腔腭粘膜上皮可以替代牙源性上皮，但是此研究必须建立在使用胚胎期或出生 1 天的自体口腔腭粘膜上皮的基础上，因此也限制了它的应用。这种局限性促使我们寻找一种新的细胞能够向牙源性上皮方向分化。胚胎干细胞具有自我更新和多向分化的能力，近年来受到许多学者广泛关注。有研究证实胚胎干细胞可以分化为皮肤表皮细胞，肺上皮细胞以及胸 -3- 第四军医大学博士学位论文腺上皮细胞等，但是胚胎干细胞是否可以向牙源性上皮方向转化还尚未见报道。因此对于这一问题的回答，无疑于对解决牙齿再生研究中上皮源性种子细胞来源的瓶颈问题具有重要意义。本课题主要进行了以下几方面的研究:1. 胚胎干细胞的培养及鉴定目的:培养胚胎干细胞R1系及CGR8系并对其进行鉴定。方法:胚胎干细胞极易受外界因素的影响，对生长条件要求非常苛刻。常规的胚胎干细胞培养液中含有高糖MEM培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇和非必需氨基酸等，为了防止胚胎干细胞发生分化，还要在培养液中加 入白血病抑制因子(LIF)，胎牛血清的质量及浓度也是影响ES细胞生长状况的重要因素，为此本实验采用GIBCO公司生产的胎牛血清，所加浓度为15。形成的ES细胞样集落，继续培养后观察集落的生长状态，并通过碱性磷酸酶染色，在体外形成拟胚体，移植入裸鼠皮下4周后取材，组织学观察进行鉴定。结果:ES细胞有其典型的形态学特征:集落呈鸟巢状，边缘清楚，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清楚;单个细胞体积小、核大;对ES细胞碱性磷酸酶进行检测，在AKP底物作用下，未分化的ES细胞显微镜下为棕褐色，分化的不着色。悬滴法培养ES细胞两天后生成拟胚体，它是胚胎干细胞在体外一定条件下自发形成的类似早期胚胎的球体结构，早期发育的简单拟胚体包含了外层的原始内胚层和内层的原始外胚层，这种结构与胚胎发育过程中的卵圆柱期结构十分相似。体内研究表明，将小鼠胚胎干细胞注入裸鼠皮下4周后，可形成含有三胚层组织的畸胎瘤。结论:胚胎干细胞具有高度的复制能力及多向分化的潜能。2. 成釉细胞条件培养液诱导小鼠ES细胞分化的研究目的:探讨成釉细胞构建的微环境对于小鼠胚胎干细胞的诱导能力。方法:本实验胚胎干细胞采用两种途径分化:生成拟胚体(EB)与不生成拟胚体直接诱导分化的途径，利用发育早期成釉细胞分泌的信号分子在体外模拟 -4- 第四军医大学博士学位论文成牙微环境，观察对小鼠胚胎干细胞增殖分化的影响。我们用成釉细胞的条件培养液诱导胚胎干细胞，并选择两个时间点，7天和14天，从形态学观察分化后细胞的形态特征，并从基因水平和蛋白水平检测诱导后细胞的表型变化。随后我们将两个诱导组的细胞植入裸鼠皮下4周观察体内结果，并将出生1天的C57小鼠的成釉器同样植入裸鼠皮下作为阳性对照。结果:体外利用成釉细胞无血清条件培养液诱导小鼠胚胎干细胞，形态学观察诱导后可促进其增殖和分化，诱导后的部分细胞形态与成釉细胞形态相似。随后的基因或蛋白检测发现诱导后的细胞具有牙源性上皮细胞的表型。其中经过EB诱导分化途径比直接诱导分化途径的效率要高一些。RT-PCR结果表明诱导后的胚胎干细胞表达牙上皮相关蛋白CK14、AMBN及AMGN，免疫荧光结果及Western Blot结果与RT-PCR结果一致。体内实验更验证了体外的结果，将诱导后的小鼠胚胎干细胞经纤维蛋白胶包裹移植于裸鼠皮下，培养4周后观察经过EB诱导分化途径的细胞在体内可形成一些上皮样角化组织，进一步免疫组织化学染色显示角化组织可表达CK14、AMBN、AMGN，具有类似成釉器样组织植入裸鼠皮下生成组织的特性。然而不经过EB诱导分化途径的细胞在体内生成了大量的结缔组织，未见典型的上皮样组织结构。当通过拟胚体途径经ASF-CM条件培养液诱导14天的胚胎干细胞与小鼠牙胚细胞混合植入裸鼠皮下后，结果显示，诱导后的胚胎干细胞在牙胚细胞的诱导下，参与了矿化组织的形成，因为经CFSE标记 躺 獾呐咛ジ上赴 肟蠡 橹 糠种睾稀,从盏嫉呐咛ジ上赴 牙胚细胞混合后，体内结果显示移植物仍然生成畸胎瘤。结论:以上结果提示，成釉细胞无血清条件培养液所提供的成牙微环境可在体外和体内促进小鼠胚胎干细胞的牙向分化，通过拟胚体途径的分化效率更高一些，且通过拟胚体途径诱导后的胚胎干细胞在体内能够生成牙源性上皮样组织，提示我们胚胎干细胞向牙源性上皮方向转化的可能性。3. 牙胚细胞条件培养液诱导小鼠ES细胞分化的研究 -5- 第四军医大学博士学位论文目的:探讨牙胚细胞构建的微环境对于小鼠胚胎干细胞的诱导能力。方法:本实验胚胎干细胞采用两种途径分化:生成拟胚体(EB)与不生成拟胚体直接诱导分化的途径，利用发育早期牙胚细胞分泌的信号分子在体外模拟成牙微环境，观察 对小鼠胚胎干细胞增殖分化的影响。本实验主要从形态学、基因及蛋白水平进行检 测，并将诱导后的细胞移植入体内进行观察。结果:体外利用牙胚细胞条件培养液 诱导培养小鼠胚胎干细胞，通过两种分化途径，并未实现向牙源性上皮细胞方向的 表型转化。形态学观察经过牙胚条件培养液诱导后，两种途径诱导的细胞增殖能力 缓慢，且诱导 14 天后细胞出现凋亡。基因表达仅表达 DMP1 和 CK14，未表达 牙齿上皮样相关基因。体内移植物为疏松的结缔组织，少量移植物体内生成畸胎瘤。 未见成釉细胞及牙齿相关组织形成。结论:以上结果提示，与成釉细胞条件培养液 相比，牙胚细胞条件培养液所提供的成牙微环境并不能促进小鼠胚胎干细胞的牙向 分化。关键词:胚胎干细胞;牙源性上皮;牙齿再生;微环境;组织工程;成釉 细 胞 -6- 第四军医大学博士学位论文 The differentiation potentiality of the mouse embryonic stem cells to dental epithelial cells Ph. D. Candidate: Ning Fang Supervisor: Prof. Duan Yinzhong Prof. Jin Yan Department of Orthodontics School of Stomatology Fourth Military Medical University Xi’an 710032 China Abstract Teeth are highly mineralized organs resulting from sequential andreciprocal interactions between the oral epithelium and the underlying cranialneural crest-derived mesenchyme. Tissue-engineered teeth need dental epithelialand mesenchymal cells. In recent years various tissue-derived adult stem cellshave already demonstrated the potential to give rise to dental mesenchymal likecells such as dental pulp stem cells DPSCs adult bone marrow cells skindermal multipotent stem cells hair follicle dermal papilla et al. However todate there are few reports on the successful transformation of cells into dentalepithelial cells. Although bone-marrow-derived cells can be reprogrammed toform ameloblast-like cells simultaneous differentiation of 1 cell type into thecells of 2 different embryonic lineages has restricted the utility of this approach.Oral mucosal epithelium can be a potential source of dental epithelial cellshowever using 1 post-natal autologous palatal epithelium limits the use of thisapproach. These shortcomings necessitated the search for other cell sources of -7- 第四军医大学博士学位论文ameloblasts using simple and convenient methods. Embryonic stem cells ESCshave attracted great interest recently because they can serve as a potentiallyunlimited supply of cells that can be differentiated toward specific lineages ofany cell type in the body. ESCs can give rise to epithelial cells of the skin lungthymic et al. However there have been few studies and little knowledge aboutwhether mESCs can differentiate into dental epithelial cells. The present studyprovides a better understanding of the mechanism of ameloblasts and insightsinto the selection of candidate cells for dental epithelial cells. The contents ofthe present study are as follows:1. Cell culture and Characterization of mESCs.Objective: To culture ESCs R1 cell line and CGR8 cell line and confirm theidentity of mESCs. Methods: MESCs were cultured in the absence of feedercells for 4 days. The culture medium was Dulbecco’s modified Eagle mediumsupplemented with 15 heat-inactivated fetal bovine serum FBS Gibco 1penicillin/streptomycin 2 mM L-glutamine 0.1 mM β-mercaptoethanol 1nonessential amino acids Gibco 1 mM sodium pyruvate Gibco and 1000U/mL leukemia inhibitory factor LIF Chemicon USA. Alkaline-phosphataseAP staining was performed according to the manufacturer’s recommendationsMillipore and EB formation was achieved. For teratoma formationapproximately 2 × 106 ESCs were injected into the subcutaneous pockets of6-week-old nude mice. At 4 weeks after ESC injection xenografted masseswere observed and dissected. Results: ES cells have the typical morphologicalcharacteristics: the nest-like colony with clear edge and smooth surface theboundaries between cells is not clear and the single cell volume is small. Nextwe evaluated the AP activity of mESCs enzyme assay results revealed high APactivity. In vitro methods involving EB formation are simple and widely used -8- 第 四军医大学博士学位论文because this method created suitable conditions for the differentiation into thecells of all 3 germ layers. Teratomas were formed 4 weeks after injection in vi.