玫瑰无须鲃卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子

玫瑰无须鲃卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 玫瑰无须鲃卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识 别因子 谨以此文献给尊敬的导师张士璀教授?一张俊? 、~ ; 。 :萋 ‖玫瑰无须缶巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识 别因子 学位论文完成日期: 该舭 指导教师签字: 鳓钾 兰蕊奴 答辩委员会成员签字: 、 \ ? / 沙邢婶琊 芬一钐 升 扣‰ 习 茜犁接铺瓤%?,;~ /孽独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得 《连 翅遨查基丝重要犍别虚盟数奎拦亘窒?或其他教育机构的学位或证书使用过的 。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 签字日期:如年月日 学位论文作者签名:撇 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》,并通过网络向社 会公众 提供信息服务。保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名:馓 一字:办班 签字日期:年月『日 签字日期:如细年月厂中国海洋大学硕士学位论文 玫瑰无须鲤卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 摘要 卵黄脂磷蛋白,,是卵黄蛋白原被卵母细 胞吸收水解后的主要产物之一,是一种大分子糖脂蛋白。本论文以玫瑰无须 纪卵为材料,通过离子交换柱层析和 凝胶过滤柱层析纯化得到了,天然聚丙烯酰胺凝胶电泳.显示 分子量约为 ,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.显示有三条带, 分子量分别为 , 和 。糖、磷、脂特异性染色实验表明玫瑰 无须囱巴鱼富含糖、脂,而磷含量较少。的氨基酸组成析结果显示其与哲罗 鱼, 和 虹鳟鱼,以及青鲻鱼的氨基酸组成十分相似,质谱结果表明从 条带所得的肽段序列与鲤鱼卵黄蛋白原的重链相匹配,而从 条带所得的肽段序列与鲤鱼卵黄蛋白原的轻链相匹配。由氨基酸组成分析 和质谱鉴定结果可以鉴定通过双步层析法纯化得到的蛋白确实为玫瑰无须 伍巴卵黄 脂磷蛋白。用纯化的玫瑰无须鱼巴免疫新西兰大白兔得到多克隆抗血清,用抗血 清作蛋白免疫印迹 发现具有明显的性别特异性,而且利用 抗血清可以检测雌性玫瑰无须啬巴血浆中的,利用免疫双扩散实验还发现 具有组织特异性。 一直被认为是卵子发生和胚胎发育过程中的主要营养物质,但是其它方面 的功能研究较少。鱼类发育成熟的卵细胞排到水中与精子结合形成受精卵,属于 体外受精,胚胎和幼体发育都在水中进行,但是水中存在很多鱼类致病菌和病毒, 这对于免疫系统还没有发育完善的胚胎和幼鱼来说是很大的威胁,本论文通过实 验证明了在胚胎和幼体发育阶段还发挥了抵御病原菌侵袭的作用,是一种具有 调理素作用的免疫识别因子。将异硫氰酸荧光素标记的与大肠杆菌 和葡萄球菌&孵育后荧光显微镜观察,发现 和&均 能发绿色荧光;卵匀浆液和溶液分别与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌孵育,然后 洗涤去除未结合的蛋白,最后用尿素洗脱结合在细菌表面的蛋白做 分析,结果在卵匀浆液和溶液与两种细菌作用后的洗出液中,都能检中国海 洋大学硕士学位论文 测到,上述两个实验证明与大肠杆菌和葡萄球菌都能结合。为了更好的理 解卵黄脂磷蛋白与细菌的结合,又做了酶联免疫吸附实验来调查细菌表面的 哪些分子被卵黄脂磷蛋白所识别。实验结果显示,能够识别非己成分,与病原 相关模式分子,包括脂多糖,、脂磷壁酸 ,、肽聚糖,等发生特异性结合,并且 结合呈现浓度依赖性。上述结果表明是一种多价的模式识别受体。本论文还通 过巨噬细胞吞噬细菌实验研究了对巨噬细胞吞噬细菌作用的影响。通过定义两 个参数来判断巨噬细胞的吞噬情况,一个为吞噬能力 ,,即 吞噬了细菌的巨噬细胞个数占所有统计细胞总数的百分数;另一个为吞噬指数 ,,即平均每个统计细胞吞噬细菌的个数。结果发现,与对 照相比,经处理的实验组的和都有显著性提高.,说明能够 促进巨噬细胞吞噬细菌能力,可能具有类似调理素的功能。 关键词: 卵黄蛋白;卵黄脂磷蛋白;模式识别因子;调理素;抑菌活性 ? ,泸,。‘中国海洋大学硕士学位论文 , ?, , . ., ?,. , . ,的‘. ,. ? . . . . , 中国海洋大学硕士学位论文., . . 嬲 、析. . . . .. . : .,. ? . ? ,, . ..,.弱 ?.. ?,? 轳岁名.虾../, 勰 , ;; :;; . 中国海洋大学硕士学位论文中国海洋大学硕士学位论文 缩略语 牛血清白蛋白 碳酸盐缓冲液二甲基亚砜 乙二胺四乙酸酶联免疫吸附 . 大肠杆菌 . 异硫氰酸荧光素肽牛血清小时 千道尔顿 脂多糖 脂磷壁酸卵黄脂磷蛋白 邻苯二胺 . 聚丙烯酰胺凝胶电泳 病原相关分子模式 . 磷酸盐缓冲溶液 . 苯甲基磺酰氟 ?模式识别受体卵黄高磷蛋白 肽聚糖 毕赤酵母吞噬能力 吞噬指数十二烷基硫酸钠磺基水杨酸 金黄色葡萄球菌 三羟甲基氨基甲烷 蛳 卵黄蛋白原 卵黄蛋白原受体 电压 中国海洋大学硕士学位论文 目 录 第一章文献综述?。 .卵黄蛋白的研究??..:?..:?...?:.:? .卵黄蛋白前体.卵黄蛋白原的结构特性?. .卵黄发生??:... 与卵黄蛋白的关系.卵黄蛋白原及卵黄蛋白的作用及研究的意义?. .鱼类抗感染免疫? .概述. .鱼类胚胎发育过程中的抗感染免疫??. .玫瑰无须鲍的研究背景? .本论文的研究的目的及技术路线?。 .研究目的及意义?. .技术路线? 第二章玫瑰无须囱巴 黄脂磷蛋白的纯化及鉴定 前言 材料和方法 .实验材料和试剂?. .卵黄脂磷蛋白的分离纯化:??. .聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的纯度和分子量. . 法测定纯化蛋白的浓度:? . 蛋白中含糖、含磷、含脂特性的鉴定 .蛋白的氨基酸组成分析?. .纯化蛋白的质谱鉴定??. .玫瑰无须囱巴卵黄脂磷蛋白的免疫原性研究??. .结果??. .卵黄脂磷蛋兰的分离纯化和分子量确定? .卵黄脂磷蛋白的特异性染色 .卵黄脂磷蛋兰的氨基酸组成分析? .卵黄脂磷蛋白的质谱鉴定? .卵黄脂磷蛋白的性别特异性分析 ’ .卵黄脂磷蛋白的组织特异性分析 中国海洋大学硕士学位论文 .讨论:? 第三章卵黄脂磷蛋白参与模式识别及促巨噬细胞噬菌功能的研究 . .前言??.? 日吾??..??.. 材料与方法 .实验材料?。 .细菌的培养. . 与细菌的结合? .卵黄脂磷蛋白与病原相关模式分子的结合.卵黄脂磷蛋白对鲈鱼巨噬细胞 噬菌作用的影响 结果 .卵黄脂磷蛋白与细菌的结合.卵黄蛋白原与病原相关分子模式的结合 .卵黄脂磷蛋白对鲈鱼巨噬细胞噬菌作用的影响 讨论 总结与展望??. 参考文献??。 致谢?一 作者简介?. 发表的学术论文?. 玫瑰无须鱼巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 第一章文献综述 卵黄蛋白的研究 卵生动物早期胚胎的发生和发育都依赖卵黄提供营养,而这些卵黄蛋白都源 自于卵黄蛋白原,,是一种大分子量的糖磷脂蛋白。鱼类的 跟其他非哺乳类脊椎动物一样,在肝脏中合成,然后释放到血液里,随血液循 环到达卵巢,被卵母细胞吸收,裂解成卵黄脂磷蛋白,,卵黄高磷 蛋白,和组分’【,翔。是的主要裂解产物 【’,是卵黄的主要成分。与一样,富含糖和脂,但是它的磷蛋白含量特别 低】。能为卵子发生和胚胎发育提供营养,但是其它方面的功能研究较少。 .卵黄蛋白前体.卵黄蛋白原的结构特性 卵黄蛋白原,是特异地存在于非哺乳类性成熟的卵生雌性 动物血液中的一种蛋白,是几乎所有卵生动物卵黄蛋白的前体。等第一次使 用“这个术语来描述一种昆虫血淋巴中的一种雌性特 异性蛋白质,后来这一名称则泛指这种在卵生动物的卵黄形成过程中,雌性 个体 血浆中大量存在的富含磷、糖、脂的大分子蛋白。与脊椎动物载脂蛋白 及微粒体甘油三酯转运蛋白 同属于古老的脂转运蛋白超家族。在不同门类动物中如昆虫、甲壳类、 鱼类、两栖类、爬行类和鸟类中都已纯化得到并进行了特性研究。从无脊椎 动 物到脊椎动物,在结构和功能上有一定的类似性【’】,也有很多的不同点。 无 脊椎动物的大多是由分子量不同的多个亚基组成,而脊椎动物特别是鱼类的 的同源二聚体组成,而介于无脊椎动物和脊椎动 通常是由两个一 物之间的文昌鱼的是由两个 的同源二聚体组成【】。并非一种单 一形式的蛋白,而是由若干基因编码的蛋白组成的一个家族。在鸟类和鸡中, 玫瑰无须童巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 编码的蛋白结构由端到端分别为脂磷蛋白部分,高磷蛋白部分,脂磷蛋 白部分和卵黄糖蛋白部分,而在硬骨鱼的一级结构由端到端为脂磷蛋 白部分,高磷蛋白部分,脂磷蛋白部分和组分部分,但是并非所有的都 具有上述完整的结构,.于是等提出一种分类模型:具有完整的结 构被分为和两类:底鳝,条形星蝶,黑线鳕和青鲻 等都属于类,它的在卵母细胞成熟过程中几乎被完全降解;底 鳝班,条形星蝶,黑线鳕和青鳝等都属于类,它的 在卵母细胞成熟过程中不被降解,或者被部分水解。还有一类,缺少 结构域,或者仅具有一个高度缩短的结构域,这类被分类为, 斑马鱼,昆虫以及鸡属于此类,的磷酸和丝氨酸残基含量低, 分子量比和都要低引。 .卵黄发生 在卵生动物中由卵子负责发育的启动和指导早期发育,在卵质中积累和储存 大量的能源、细胞器、酶、核酸、结构蛋白和蛋白合成前体分子以及卵黄等 【。 卵黄发生是动物卵母细胞生长的主要事件,它可为卵母细胞的生长 和后来胚胎的发育提供所需的氨基酸、脂、钙和能量等营养和功能性物质, 对动 物的生殖至关重要。卵黄的发生主要有两种形式:一种是外源性卵黄合成 ,即卵黄蛋白原由卵母细胞以外的地方合成,然后进入卵母细胞; 一种是内源性卵黄合成或自动合成,即由卵母细胞自身合成。不同 门类的动物或同一门类不同种的动物中卵黄发生的方式各不相同,既有内源性合 成的,也有外源性合成的,还有同一物种在不同的发育时期采取不同的合成方式。 ..外源性卵黄合成 外源性卵黄蛋白原的合成的一般过程为,先由卵巢外器官形成卵黄蛋白原, 然后分泌到循环系统,再由循环系统运输到卵巢组织而被卵母细胞通过胞饮作用 吸收,最终在卵母细胞内裂解形成卵黄蛋白。 外源性卵黄蛋白原的合成在无脊椎动物中常见于线虫、海胆、某些沙蚕、部 玫瑰无须啬巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 分软体动物、大多数昆虫和甲壳类等,而在几乎所有的卵生脊椎动物如鱼类、两 栖类、爬行类及鸟类中都存在,只是不同种类动物合成的部位不同。 线虫 的卵黄蛋白原是在肠细胞内合成,被卵母细胞吸 收后并不立即裂解。海胆的卵黄蛋白原则由消化道细胞和体腔细胞合成, 分泌到体腔液中,运送到卵巢被卵母细胞吸收并裂解成卵黄蛋白。昆虫卵黄蛋白 的合成比较复杂,因为昆虫卵黄蛋白主要分为四类,合成部位和代谢途径都不相 同:第一,卵黄磷蛋白,,,它存在于大多数昆虫中,其前体即为雌性 特异的卵黄蛋白原,,由脂肪体合成,分泌至血淋巴,最后由发育 而摄取、 中的卵母细胞通过受体调节的内吞作用 累积;第二,卵黄蛋白多肽 ,它存在于高等双翅目昆虫, 如黑腹果蝇中。它们在雌虫脂肪体和卵巢滤泡细胞中合成,最后也通过卵母细胞 摄取而积累于卵巢中;第三,滤泡细胞合成的蛋白,如家蚕卵特异性蛋白, 它由滤泡细胞合成,并摄入发育中的卵母细胞中;第四,非雌特异性蛋白,如家 蚕的 蛋白,也是在脂肪体中合成的,积累于发育中的卵母细胞【。在节肢 动物中,一些甲壳类动物的卵黄蛋白原是在脂肪体内合成,但大多数 甲壳类的卵黄蛋白原是由肝胰腺或滤泡细胞合成。在脊椎动物如鱼类、 两栖类和鸟类,其卵黄蛋白原由肝脏合成,分泌到血液中,运送到卵巢被卵母细 胞吸收后裂解为卵黄蛋白。虽然无脊椎动物和脊椎动物外源性卵黄蛋白原产生的 部位不同,但它们都是利用一种相同的机制把卵黄蛋白前体输送到卵巢,在那里 通过微胞饮作用进入卵母细胞。 ..内源性卵黄合成 内源性卵黄合成是指卵黄在卵母细胞中合成,其过程中一般观察不到卵黄蛋 白原的产生。内源性卵黄合成的证据主要来自于从形态学上可以观察到正在发育 的卵母细胞内细胞器中卵黄蛋白原的合成。与此有关的细胞器主要有内质网、高 尔基体和线粒体等,但实际上是由哪一种细胞器形成的,证据也不一致,在不同 动物中形成方法也有差异。 多毛纲的巢沙蚕 卵黄是在卵母细胞内高尔基体内合成,其 他几种沙蚕证明也是内源性合成卵黄。腔肠动物在水母体时期可在其高尔基玫瑰无须盍巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 体液泡中找到卵黄颗粒,卵黄颗粒是很可能由粗面内质网上的核糖体和高尔基体 联合合成的【堋。腹足类软体动物蜗牛 、贻贝 都是以内源性合成方式合成的,在线粒体里面或是线粒体群之间也发现结晶 状的蛋白卵黄小板。甲壳类的河虾卵黄是在卵母细胞的粗面内质网中合成,然后 被运至光面内质网的潴泡中,在那里形成成熟的卵黄体。 ..不同发育阶段卵黄的合成 许多动物在卵黄蛋白形成过程中并非单一的内源性或外源性合成,而是既有 内源性合成也有外源性合成,通常在不同的发育时期卵黄蛋白产生的部位不同。 甲壳动物的卵含有大量卵黄,卵黄的生成包括两个阶段,第一阶段是卵母细 胞本身合成卵黄蛋白,第二阶段是脂肪体内合成卵黄蛋白原,然后释放到血淋巴 中,被卵母细胞吸收。甲壳动物纲枝鳃亚目中的很多动物其在其肝胰腺和卵 巢都有合成,如日本对虾,南美白对虾 , ,短钩对虾 ,刀额新对虾 斑节对虾 ,墨吉对虾 】。最近在 一种蟹类幼年青花蟹 中也发现其肝胰腺和卵巢中都有表 达【刀。 年用放射自显影的方法,和用电镜观察的方法 均发现,鱼类的卵母细胞能产生卵黄蛋白,并通过胞饮作用积累外源性合成的卵 黄蛋白原。两栖类同鱼类一样,既有内源性合成的卵黄发生也有外源性合成的卵 黄发生。两栖类在卵黄发生早期,卵黄蛋白主要产生在卵母细胞内的多泡体内【。 有些两栖类特别是蛙科的,其内源性卵黄产生是在线粒体里面。但这些卵黄结 晶缺少卵黄脂磷蛋白和卵黄磷蛋白,所以只能说是未成熟的卵黄。到卵黄发生后 期,外源性卵黄产生开始,依靠肝脏制造卵黄蛋白原,运送到卵巢后,被卵母细 胞通过受体介导的内吞作用吸收到细胞。 ..硬骨鱼类卵黄生成及的分解 等【】根据对硬骨鱼类的研究,作出了其外源性卵黄合成的一个 简化过程如图所示。肝细胞在雌激素刺激下表达产生,释放到血液中, 随血液循环运输到卵巢,被正在发育中的卵母细胞通过受体介导的内吞作用吸收, 晕玫瑰无须童巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 在卵母细胞内被相关酶裂解形成卵黄蛋白,以卵黄颗粒或小球的形式储存于卵子 胞浆。 图硬骨鱼类卵黄生成的模式图 . ..受体,即存在于卵细胞表面的一种对具有高度亲和力的膜受 体介导了此内吞过程,与.结合的聚集于笼型蛋白形成的凹陷处,进而 形成吞噬小泡,这些吞噬小泡与卵胞浆外围的溶酶体融合形成多泡体,溶酶体中 的酶将分解为卵黄蛋白,参与分解过程的主要的是组织蛋白酶。溶酶 体中的其他酶类可能也参与此分解过程【。等【】发现组织蛋白酶和同 时存在于卵黄生成期的虹鳟鱼卵细胞的多泡体内。等【】证明了白斑红点 鲑 的在体外可以被牛的组织蛋白酶或白斑红点鲑 卵黄生成期卵巢中的一种对抑肽酶敏感的水溶性的成分分解为卵黄蛋白。 卵巢中纯化出了组织蛋白酶和溶酶体组织蛋白酶, 等从真鲷 并提出在这个物种中的分解是由组织蛋白酶来完成的【】。后来, 等【】从马苏鲑鱼.卵巢中纯化了一种与分解相关的对抑肽酶敏感 玫瑰无须啬巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 的酶,鉴定为组织蛋白酶样蛋白。处于卵黄生成早期的真鲷卵巢中的组织蛋 白 酶和溶酶体组织蛋白酶具有很高的活性,暗示在此物种中这两种酶可能参与 的分解过程。 . 与卵黄蛋白的关系 卵黄蛋白原是一种大分子的含糖、磷、脂的蛋白,一般以二聚体的形式存在 于血液中,分子量大小大约. 。在鸡和爪蟾,以及硬骨鱼中,被卵母 细胞吸收之后,产生了两个主要的蛋白,和?。是一种脂蛋白,大约含 有%的脂质,它是相关产物中最大的一个蛋白,由两条肽链构成,一条重链 命名为 或 和一条轻链命名为 或 。的主要功能是为胚胎 发育提供必要的氨基酸和脂类等营养成分。由大量的丝氨酸残基组成,大约 占 %,共价结合有磷酸基团,而且还与钙离子螯合,因此,为骨骼发育和新陈代 谢提供必要的矿物质。因为还有大量的磷酸基团,因此它表现出一些不同于其 他卵黄蛋白的特征,例如不太相似的免疫原性,不太容易被一般的生物化学染色 剂染色。 在鸡中发现来源于的另~类蛋白,叫做卵黄糖蛋白,基于现在 的分子生物学分析,鸡的编码的基因序列表现为一种线性结构,以它的卵黄蛋 白结构域为单位,表示如下:一????。含有由 重复的半胱氨酸残基组成的一个独特结构,其编码序列在鸡和爪蟾中是高度保守 的【】。在硬骨鱼中,和】从虹鳟刍 卵黄蛋白经过 柱层析后的分离组分中发现和鉴定了另外一种蛋白,与和不同的是,这 种卵黄蛋白既不含有脂也不含有磷,被命名为组分。后来和 在大马哈鱼卵中,也发现了这种蛋白,而且从免疫学上证明了其确 实是来源于的一种蛋白【闱。此外,在其他大量的硬骨鱼中也发现了这种蛋白, 例如比目鱼肌哪,.力】和鲈鱼勿阳刀彳聊仃池删】,这证明组分在硬骨 鱼卵中是广泛存在的。 玫瑰无须童巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 卵黄蛋白原及卵黄蛋白的作用及研究的意义 及其产物除了可以作为脂类、磷和金属离子的运输载体进入卵母细胞外, 主要的功能是在胚胎发育过程中提供营养物质,如氨基酸、脂肪、碳水化合物、 维生素等。除此之外研究发现,它们还能促进正在培养中的动物卵母细胞的生长 和分化【】。人们在对海胆、蛙类以及昆虫的研究中发现卵黄蛋白不仅在胚胎发育 中具有重要作用,而且在幼虫阶段也起作用‘捌】。有证据表明储存在卵黄颗粒中 的蛋白降解后并不是作为营养物质,而是分泌到正在发育的胚胎的胞外介质中行 使一定的功能【.。 的卵母细胞的成熟 此外还有人报道在海水硬骨鱼一比目鱼 和水合过程中,由于来自的卵黄蛋白发生了水解,产生的大量游离氨基酸能够 调节细胞内外的渗透压并使之平衡,以使排出体外的卵细胞在水中能够保持漂浮 除了上述生理功能外,由于近年环境污染日益严重,废料垃圾中含有的大量 内分泌干扰物,能模拟体内激素或能抑制体内激素的正常作用,从而干扰人类及 动物的正常内分泌活动。因此人们把受外源雌激素影响雄性动物体内非正常 表达 的或把受内分泌干扰物干扰,抑制成熟雌性动物体内雌二醇作用从而引起 的表达水平下降作为一种生物指标,来检测环境中的污染物质。免疫学方法 水平的方法已经被人们用来作为比较可行的检测 和测定体内 手段。但是有些小型鱼类,由于其血量少,采集困难,难以从中提取用作免疫 分析。而是鱼卵中的主要蛋白质,而且可以比较容易从卵巢或卵中获得足够的 量。许多研究已经表明,是在体内降解后的主要部分,与具有相同 、斑马鱼 、鳕鱼 的免疫原性也在鲫鱼 等多种鱼中被证实‘巧】, 、青鳝 和哲罗鱼 并且应用于免疫检测‘。因此以代替作为抗原,除了可以解决难以大 量获取的问题以外,还能克服极易降解的难题。玫瑰无须隹巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 鱼类抗感染免疫 .概述 抗感染免疫. 是机体抵御和清除病原微生物及其有害 产物的一种生理功能。抗感染免疫根据其形成和作用特点的不同,可分为非特异 性免疫先天性免疫和特异性免疫获得性免疫两大类。在抗感染免疫过程 中,非特异性免疫发生在前,可以看作是机体抗感染免疫的“先头部队。特异性 免疫发生在后,可显著增强非特异性免疫功能。两者相辅相成,共同完成抗感染 免疫作用。 先天性免疫 又称为自然免疫,是生物在种系发展和进化过 程中逐渐形成的天然防御机制。它是个体生下来就有的,可以遗传给后代,受基 因控制,因此具有相对稳定性,因此又称非特异性免疫 。 动物的非特异性免疫只能识别自身和非自身,对异物无特异性区别作用,是动物 抵御感染的第一道防线,与特异性免疫不同,它在接触病原后不需要抗体的参与, 应答迅速。非特异性免疫以机体的组织结构和生理功能密切相关。机体的屏障结 构、吞噬细胞、细胞和正常体液及组织中的抗菌物质密切配合,共同发挥非特 异性免疫作用。 ‘在这类免疫中,鱼类的保护性屏障作用主要是粘液、鳞、表皮和真皮对病原 的防御作用。由表皮粘液细胞产生的粘液,碎屑和微生物很容易和它粘结在一起 而被清除,粘液也是不断补充的。鳞片、表皮和真皮对物理性侵袭,也起着像保 护盾一样的作用,以阻止暴露创伤和防止可能导致的感染。除此之外,还有很 多可溶性蛋白在鱼类的非特异性免疫中充当关键因子,许多蛋白有直接的抗菌活 性或者以调理素的形式抑制病原的致病性,还可以通过巨噬细胞或补体对病原进 行杀伤,人们已经对一些抗菌类蛋白,例如溶菌酶和阳离子型裂解多肽等做了研 究【】。还有在补体和吞噬细胞的杀伤作用之前,能够对微生物靶位点进行非自 身性识别的寄主体内的凝集素和相关蛋白。 获得性免疫 不是天生就有的,而是个体在发育过程中受病 玫瑰无须啬巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 原微生物及其代谢产物等抗原性物质刺激后主动产生或接受免疫效应分子后被动 获得的。这种获得的免疫性对诱发的抗原具有特异性,所以获得免疫又称为特异 性免疫 。从生物进化系统来看先天性免疫是在最低等的无脊椎 动物上就存在的,而获得性免疫是在脊椎动物中才有的,而且是随着进化而 渐趋 完善的。它除了具有严格的特异性和针对性,还有免疫记忆的特点,它包括体液 免疫和细胞免疫两种,在消除病原体作用中占有重要地位咿】。 .鱼类胚胎发育过程中的抗感染免疫 鱼类胚胎在孵化时,淋巴系统仍处于发育之中,而且成鱼所拥有的免疫器官 和功能活性都不存在【。鱼类的胚胎和幼体一直暴露于含有各种病原体的水环境 中,它们是如何抵抗细菌感染的一般认为在系统发育上非特异性免疫比特异性 免疫出现早,可以认为鱼类比高等脊椎动物更依赖于非特异性免疫。大多数鱼类 在其幼鱼阶段特异性免疫器官尚未发育完全,还不能实行其功能,幼鱼对外界病 原微生物的抵御能力只能靠自身的非特异性免疫和来自母体的免疫。 早期一些学者就推测,亲鱼的免疫作用可以通过卵子被动地转移,使其胚胎 和幼鱼获得一定的保护作用。目前,越来越多的实验证据表明,在鱼类卵母细胞 或胚胎中存在蛋白酶抑制剂、凝集索、溶菌酶和。由于卵母细胞、受精卵和 胚胎中均不能合成凝集素、溶菌酶和,它们被认为是来源于母体的自然免疫 物质,而且在硬骨鱼类胚胎发育和早期胚后发育中可能起着重要的作用。在虹鳟 【】、鲤鱼 】、 、真鲷 罗非鱼 、大麻哈鱼 、印度洋鲤鱼 】、鲈鱼 】和鲫鱼 吲中均发现了母源性向后代的传递。 关于非特异性体液免疫因子的母源性传递及其功能研究相对较少。在虹鳟 的卵【硼 、大西洋鲑 和湖拟鲤 中以及蝶鱼 的血清和卵【】中都存在凝集素。等【】 在斑马鱼受精卵中检测到了母源性补体因子,并通过体外实验和活体实验证明了 玫瑰无须啬巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 母源性补体系统在卵子的溶菌活性中起重要作用,发现斑马鱼亲鱼免疫能够提高 其后代的补体含量和补体活性并提高胚胎的抗感染能力,进而证明了斑马鱼中补 体的母源性传递及其在胚胎免疫中的功能。等【】则发现对真鲷的亲鱼进行免 疫后,其后代的蛋白酶抑制剂活性和溶菌酶活性也明显升高。这些结果表明,母 源性非特异性体液免疫因子在鱼类胚胎发育和早期胚后发育中也可能发挥着重要 的免疫作用。 玫瑰无须缶巴的研究背景 玫瑰无须鲤 ,又名玫瑰鲫,俗称咖啡鲆,是一种淡水观 赏鱼,属于硬骨鱼纲一鲤形目一鲤科一啬巴亚科,原产于印度、巴基斯坦、尼泊尔 等南亚国家,玫瑰无须啬巴在实验室条件下饲养和繁殖技术已经很成熟,一年四季 均能繁殖,且生殖周期短,一般在 左右,产卵量大、卵子体积大而透明。其 胚胎很容易在实验室条件下孵化和发育。胚胎发育从受精到孵化,可分为受精卵、 卵裂期、囊胚期、原肠胚、成体节期以及孵化期个阶段。 发育成熟的玫瑰无须囱巴体长?厘米,雄性身体近尾部有黑色斑点,背鳍和 腹鳍也有黑色斑块,身体为明亮鲜艳的酒红色或玫瑰红色,雌性为淡银色,背部 的黑斑不太明显,雄鱼一般比雌鱼体形略大如图卜所示。玫瑰无须鲍属于亚 热带鱼类,它对生活环境的要求不是很严格,生活的范围在...,温度在 .,一般生活在河底或湖底部水域,在湍流的山间溪谷中也可以生活。杂 食,虫类,小型甲壳类和昆虫以及浮游植物都可以作为它们的食物。 玫瑰无须囱巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 图性成熟玫瑰无须囱巴 在胚胎发育生物学方面,等对雄性玫瑰无须靶和雌性鲤鱼做了杂交 实验,并从形态特征和生化指标方面对其发育成熟的杂合体进行了检测。红血球 和染色体分析表明鲤鱼和玫瑰无须啬巴的杂和体产生了条染色体,而另一种鲤科 鱼 和玫瑰无须靶的杂交能产生三倍体杂和体,具有条染色体。两 种鱼的杂交研究有助于对鲤科鱼遗传结构的了解,这在鱼类养殖和遗传研究中有 重要的作用。掣】把来自玫瑰无须靶囊胚期胚胎细胞移植入同科异种的斑 马鱼囊胚期胚胎细胞中,总共个融合的胚胎细胞中大多数在移植后只存活了 ?天,只有个杂合体在一个月后仍然发育良好。这个杂合体中有个 表现出供体细胞的的特征。这是首次成功利用囊胚期细胞移植进行玫瑰无须鳃和 斑马鱼之间的种间研究。 在生态毒理方面,等应用玫瑰无须鱼巴在重金属以及杀虫剂的毒性方面做了 大量的研究工作【昭。此外,和从组织病理学方面研究了铜,锌和 铅等环境污染物对玫瑰无须隹巴生殖系统的影响。胡家会等【刀用其精子的运动率与 超微结构的变化,检测了农药水胺硫磷的细胞毒性,指出水胺硫磷 抑制了精子的运动,并且电镜显示线粒体和细胞膜是受损最严重的细胞器。 同样, 等【用玫瑰无须鱼巴的精子对生物农药阿维菌素的毒性也进行了 研究。另外,等用玫瑰无须鳃的精子检测了内分泌干扰物壬基酚的毒性, 结果显示,壬基酚主要是通过破坏线粒体及细胞膜的结构,影响能量的产生以及 其它代谢活动,进而抑制精予的运动。 与斑马鱼相比,玫瑰无须鳃的胚胎发育在?士?温度下从受精卵到幼体孵 化只需,体节形成率是每小时节,这比斑马鱼胚胎发育要快。另外,色素 沉积发生在孵化之后,而斑马鱼在孵化之前就已存在。而其它方面如中期囊胚转 换、神经胚、枯否泡’ 、脊索形成等都与斑马鱼胚胎发育相 似嗍。在某些方面,例如对外界刺激因子的反应方面,比斑马鱼更灵敏,更适合 作为测定毒理的实验鱼类,玫瑰无须鱼巴完全可以作为一种良好的模式鱼类,进行 多方面的深入研究。在发育生殖以及免疫学研究方面都具有一定的潜在价值,因玫瑰无须童巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 此我们选择玫瑰无须鱼巴作为实验动物,来进行下面的研究。 .本论文的研究目的及技术路线 .研究目的及意义 鱼类的受精卵在大多数情况下是与母体隔离的,也就是说在受精以后是一个 独立存活的封闭系统,在胚胎发育的早期,鱼类胚胎和幼鱼体内合成体内免 疫相 关因子的能力很有限,而且免疫器官也没有发育完善。他们暴露于充满各种致病 菌和病毒等的水环境中,怎样抵御病原体的侵袭而存活下来,成为生殖和发育生 物学的一个研究热点,但是目前这方面的研究成果还很少。 研究发现,卵黄蛋白的前体一卵黄蛋白原除了能作为卵内营养物质的前体,还 具有其他非营养方面的作用。例如,等在文昌鱼 洲中,等陋】在玫瑰无须奁巴 中均发现均具有凝血和抑 菌功能;鱼类的还被证明是一种模式识别分子,能够特异性识别非己成分,包 ,、肽 括包括脂多糖,、脂磷壁酸 聚糖,等,还可以起到调理素的作用,促进巨噬细胞的噬菌 能力【硝】;最近,还被证明在宿主的先天性免疫系统中作为一种急性时相反应 蛋白发挥作用。 但分解以后的产物,各种卵黄蛋白,除了在胚胎发育的初始阶段提供营养 物质,在鱼类先天性免疫中是否发挥作用,怎样发挥作用至今尚未见报道。是 卵黄中的主要蛋白,而且是水解以后的主要产物,而且两者具有相同的免疫原 性,那除了营养功能,是否可以像一样,为胚胎和幼鱼提供先天性免疫的 保护,作用机制是什么关于这方面的研究至今还是空白。本实验的目的就是通 过实验验证是否能够识别病原菌,如果能,那么是否能发挥调理素的功能, 促进巨噬细胞的噬菌功能,也值得进一步探索。本实验的研究成果有助于研究发 育中的鱼类胚胎和幼鱼抵抗病原体侵袭的机制,填补这方面研究的空白,在生殖 养殖学以及免疫生物学方面都具有重要意义。 玫瑰无须丝塑重堕壁曼鱼墨垦查塑里耋垫壁竺鱼壅望型里三 一一 .技术路线 玫瑰无须隹巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 第二章玫瑰无须鲤尸扰刀伽卵黄脂磷蛋白的纯化 及鉴定 前言 在卵黄形成期,鱼类肝脏在雌激素作用之下,合成卵黄蛋白前体卵黄蛋白原 ;卵黄蛋白原分泌到血液中,经血液循环运送到卵巢,被正在 生长的卵母细胞通过受体介导的内吞作用吸收进去。进入卵母细胞 之后,卵黄蛋白原被降解成分子量较小的卵黄蛋白,储存于卵黄颗粒中,为未来 胚胎的发育提供营养。卵黄蛋白原降解成卵黄脂磷蛋白、卵黄高磷蛋白和组 分 ’.三种卵黄蛋白【捌。 由一条重链和一条轻链构成,是的主要组成部分】。被鉴定为一种 糖脂蛋白,富含脂肪和碳水化合物,但是磷含量比较低。和还可能存 在相同的免疫原性。现已从多种动物中得到纯化和鉴定;包括沙蚕 】,对虾 】,爪蟾 】,鸡 ,还有鱼类如哲罗鱼和 青鳝 【。 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳显示鱼类分子量在 之间【柏.。 和 哲罗鱼 ,在变性胶电泳中分为 的分子量为 两条带。在青鳝 中分离得到了两种,分子量分别为和 。而在一种杂交的鲟鱼 中纯化得到 的分子量为 。 玫瑰无须啬巴 是一种原产于印度等南亚国家的鲤科淡水观 赏鱼。由于世代周期短、产卵量大、卵子体积大和透明等特点,玫瑰无须奁 巴近年 来被广泛应用于生态毒理学和胚胎发育生物学研究。的主要降解产物在生 态毒理学和生殖发育生物学研究上都具有一定潜在应用价值。有关玫瑰无须 鳃 的纯化鉴定迄今尚未见报道,本文首次对其进行了纯化和鉴定,并与其它鱼 类做 玫瑰无须钯卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 了比较分析。 材料和方法 .实验材料和试剂 玫瑰无须鳃 实验用性成熟玫瑰无须鳃 购自青岛观赏鱼市场,雌雄分 开,放在持续通气的玻璃鱼缸饲养;水温保持在?,每天投喂热带鱼专用饲 料两次,模拟自然光周期。 化学试剂和耗材 肝素钠,苯甲基磺酰氟,牛血清白蛋白和考马斯亮蓝. 购自;丙烯酰胺粉末购自公司;甲叉双丙烯酰胺 粉末购自公司;十二烷基磺酸钠粉末购自公司;和 甘氨酸粉末购自公司;天然电泳分子量购自公司; . 层析柱填料和。. 层析柱填料购 自 ;变性胶电泳分子量标准为公司产品;超滤管购自 公司;蛋白测定试剂盒购自碧云天生物技术公司;增强型. 底物显色试剂盒购自天根生物技术公司;巯基乙醇、甲醇、溴酚蓝、三氯乙 酸 、、、乙酸、、碱性品红、苏丹黑、丙酮、磺基水杨酸 、、、钼酸铵、、甲基绿、等化学试剂均为国产分 析纯试剂。 实验用主要仪器 组织匀浆器.:上海金达生化仪器厂 .: 低温冷冻离心机 , 凝胶成像仪:日本 :上海天平仪器厂 电子分析天平 紫外可见分光光度计:上海棱光技术有限公司 玫瑰无须啬巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 石英自动双重纯水蒸馏器.:江苏金坛国胜仪器厂 稳压稳流电泳仪.:北京六一仪器厂 电泳槽. 型:. 蠕动泵.:保定兰格恒流泵有限公司 自动馏分收集器.:北京市新技术应用研究所 紫外检测仪:北京市新技术应用研究所 脱色摇床佴:江苏省海门市麒麟医用仪器厂 灭菌锅:山东新华医疗器械股份有限公司 酶标仪: .卵黄脂磷蛋白的分离纯化: 在雌性玫瑰无须鱼巴排卵期,收集鱼卵,与倍体积 缓冲液 / / 内含 , 和.%,.混合,放到组织 ,收 匀浆器中用 /转速匀浆 。匀浆液于。用 离心 , 集上清液。将上清液样品加到预先用.缓冲液含有 柱上,然后用.倍 .平衡好的. 的缓冲液平衡柱子,使蛋白与填料充分结合,不与之结合的蛋白会被洗脱下 来, 待紫外检测仪示数显示稳定后,然后分别用含有,,, 的缓冲液各进行梯度洗脱,洗脱速度为 /’自动收集器每管收集 面,共收集管以上。蛋白紫外监测仪在 处检测蛋白峰。将洗脱的各峰 蛋白在.%天然聚丙烯酰胺凝胶电泳中根据分子量大小等分析哪个峰可能含 有目 的蛋白。收集可能含有的洗脱峰,用超滤管浓缩,将浓缩后的样品加到预先用 . .缓冲液含有 .平衡好的柱上,采用同样的缓冲液洗脱,洗脱速度为. 自动收集器每管毫升,共收集管。将洗脱的各峰蛋白在.%天然聚丙烯酰胺 凝胶电泳中根据分子量大小等检测及其纯度。然后用超滤管超滤浓缩,测定 蛋 白浓度后加入等体积%甘油?保存待用。 玫瑰无须囱巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 .聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的纯度和分子量 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按照】和汪家政等嗍的 方法进行,分离胶浓度为.%, 浓缩胶浓度为%,样品与上样缓冲液以: 混合,上样缓冲液包括. ,%甘油,.%溴酚蓝,为.。 每个泳道加入?的样品。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.分离胶浓度 为.%,浓缩胶浓度为%,浓度为.%,样品与上样缓冲液以:混合, 上样缓冲液包括. ,%,%甘油,.巯基乙醇,.%溴 酚蓝,为.。蛋白样品与上样缓冲液混匀后在沸水中煮分钟,再用微量进 型电泳槽 样器加入泳道,每个泳道加入山的样品。电泳采用 ., 电泳起始电压为, 待溴酚蓝前沿进入浓缩胶和分离胶交界面 时调整电压为,当前沿跑至底部. 时停止电泳。取出凝胶放入考马斯亮 蓝一染色液.%考马斯亮蓝,%甲醇,%乙酸中染色半小时左右, 再用脱色液甲醇:乙酸:蒸馏水::脱色过夜。蛋白分子量采用 同样的方法与样品同时电泳来测定蛋白样品的天然状态和各个亚基的分子 量。天 然电泳的分子量采用公司的天然电泳高分子量标准试剂盒,用 ,铁蛋白, ,过氧化氢酶 甲状腺球蛋白, 和小牛血清白 , ,乳酸脱氢酶 , 作为标准蛋白,蛋白标准和样品都在不同浓 蛋白 , 度%%,.%,%,%分离胶的天然凝胶中进行电泳。结果得到了一系列 的迁移率,以胶浓度为横坐标,对标准品的迁移率做这样的处理: ,以这样的结果为纵坐标作图,计算出每一个标准蛋白和样品的迁移率的变 化斜率。以各标准蛋白的分子量的对数为横坐标,各斜率绝对值的对数为纵 坐标, 作出标准曲线。然后求出曲线方程,进而根据样品的在不同浓度凝胶中迁移 率的 变化斜率计算出样品在天然状态下的分子量。.所用为次高分子量标准 , ,钙调素结合蛋白 , 蛋白:肌球蛋白重链 。以 兔磷酸化酶. ,牛血清白蛋白. ,兔肌动蛋白 各标准蛋白的迁移率为横坐标,相应的分子量的对数为纵坐标,作出标准曲 线, 玫瑰无须鱼巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 再跟据标准曲线的方程和样品的迁移率计算出样品的分子量。 . 法测定纯化蛋白的浓度: 法测定蛋白浓度具有简单,高稳定性,高灵敏度和高兼容性等优点,检 测浓度下限达到/,最小检测蛋白量达到.,待测样品在 ./浓度范围内有较高的线性关系;法测定蛋白浓度不受绝大部分 , 样品中的化学物质的影响,可以兼容样品中高达%的,%的 %的 ,,。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响,需确保 低于,无,二硫苏糖醇低于,.巯基乙醇低于.%。 步骤: 根据样品数量,按体积试剂加体积试剂:配制 适量工作液,充分混匀,工作液室温小时内稳定。 完全溶解蛋白标准品,取加入缓冲液稀释至,使终浓 度为./。 将标准品按,,,,,,,山加到孔板的标准品孔中,加 缓冲液补足到山。 加,,,山样品到孔板的样品孔中,加入缓冲液补足到。 各孔中加入工作液,?放置。 测定处吸光值,根据标准曲线计算出蛋白浓度。 . 蛋白中含糖、含磷、含脂特性的鉴定 ..糖蛋白的检测: 参照等人和等人】的方法进行。将天然电泳后的凝胶放入 %的中,下振荡过夜,然后将凝胶放入.%的高碘酸中振荡两小时。 随后将凝胶移入由%乙酸配成的 的高碘酸钠溶液中震荡分钟,然后用 %乙酸配制的高碘酸钠溶液中洗涤两次,每次大约分钟。再用%的乙 酸洗涤分钟后,将凝胶放入试剂中染色过夜。第二天用的 玫瑰无须鱼巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 的溶液对凝胶进行漂洗,直至背景不再显示粉红色。 试剂的配制:将克碱性品红溶解于毫升沸水中,摇荡分钟后冷 ,冷却至?, 却至?左右,用滤纸过滤,向滤液中加入毫升的 加入.克焦亚硫酸钠,将此溶液置于暗处使其反应小时以上,然后过滤,将 滤液避光保存在下,用前升至室温。 ..脂蛋白的检测: 参照等人【和杨安钢等人‘刁方法,将电泳后的凝胶用蒸馏水洗涤 后放入%的苏丹黑的染色液中染色过夜,然后再用脱色液甲醇:乙酸:水 ::进行脱色,直至背景清晰。 乙酸和 苏丹黑溶液配置方法:苏丹黑溶于丙酮,再加入 蒸馏水,搅拌分钟后过滤,滤液保存在?避光处。 ..磷蛋白的检测: 参照等人【和等人【】的方法进行,将电泳后的凝胶转入用. 配制的%磺基水杨酸中固定小时以上。然后将凝胶从固定液 中取出,双蒸水洗涤后放入的. 溶液中分钟,用%钼酸铵洗 涤两次,每次分钟,接下来将凝胶浸在用 配制的%钼酸铵溶液中振 荡分钟。最后用%乙酸配制的.%甲基绿染色液染色分钟,%脱 色至背景较浅而磷蛋白条带清晰为止。 .蛋白的氨基酸组成分析 / 方法参照等【铂所述,将纯化的蛋白溶液放入离心管中,在 中?水解小时,取水解液在日立型氨基酸分析仪上分析氨基酸 组成。 .纯化蛋白的质谱鉴定 将纯化的进行?,考马斯亮蓝一染色液.%考马斯亮蓝, %甲醇,%酸中染色 左右,再用脱色液甲醇:乙酸:蒸馏水: 玫瑰无须蠢巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 :脱色至背景清楚。将所得条带用锋利刀片割下,装入盛有 双蒸水的 . /心管中,送至北京华大蛋白质组研究中心进行基质辅助激光解 / 析电离飞行时间质谱分析 。 .玫瑰无须鲤卵黄脂磷蛋白的免疫原性研究 ..多克隆抗体的制备: 具有免疫原性的抗原可刺激机体相应细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特 异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的细胞克隆所识别, 因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体,实际上为针对该抗原分子表面不同决定 簇的抗体混合物即多克隆抗体。另外,抗体的产生具有回忆应答的规律性,初 次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。这是由于记忆性细胞 参与再次应答所致。 选用~周龄左右的新西兰大白兔作为免疫动物,将购得的大白兔暂养一周 适应环境后,进行免疫。首次免疫剂量为 ,按照:加入弗氏完全佐剂后, 乳化至油包水状,对家兔皮下多点注射,每点山,周后以飕的抗原剂量 按照:加入弗氏不完全佐剂后,乳化至油包水状进行第二次免疫,周后以 的抗原剂量按照:加入弗氏不完全佐剂后,乳化至油包水状进行第三次免疫, 其后隔天用同样的抗原剂量进行加强免疫。最后一次免疫天后,常规颈动脉穿刺放血,放置过夜, ,收集血清,分装,保存于一 离心 ?备用。 ..各组织抗原的提取 纯化的玫瑰无须童巴和卵匀浆液来自本章第一节。 从卵黄形成后期雌性玫瑰无须囟巴取出肌肉、从雄性玫瑰无须啬巴解剖取出 精巢 和肌肉,蛋白的提取根据等【】的方法进行。取组织小块于研钵中,加入液 氮研磨,按 , 研磨组织/裂解液比例加入裂解液 , , , ,.%,.%,% , .,置于冰上裂解 / / , , ,玫瑰无须鱼巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 裂解完毕后 ,收集上清。另从雌、雄玫瑰无须鳃采集血 ,离心 // 缓冲液含 ,. 液,与倍体积 ,取得上清液血浆。 和 /肝素钠,.混合,经 离心 .. 的抗原特异性分析 组织特异性分析 用免疫双扩散的方法【进行的组织特异性分析,配制. .的巴比 妥钠盐酸缓冲液,毫升缓冲液中加入克琼脂糖,加热溶解,浇在洁净的小培 养皿内,琼脂糖厚度为。待胶板冷却后,在琼脂糖板上用打孔器打孔,孔 径约为孔距为。将中央孔中加入抗血清微升,孔分别加入 纯化,卵匀浆液,精巢粗提液,雌性肌肉粗提液,雄性肌肉粗提液,然后放入 保湿盒内室温下过夜。扩散完毕后,将琼脂糖板在生理盐水洗涤?小时以去 除未反应的蛋白质,然后将琼脂糖板小心转移到考马斯亮蓝染液中染色 小时,脱色后拍照记录。 检测的性别特异性 相关溶液: .。 . / ?, / 电转缓冲液: ,% . :.,定容 , , , 调 至 .样品纯化,雌性玫瑰无须伍巴血浆,雄性玫瑰无须鱼巴血浆按照.所述方 法进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 .准备好转膜用的模具、滤纸、膜、剪刀、镊子等。先将模具、剪刀、镊子 等 在中洗一下,再浸泡入电转缓冲液预冷中。同时按照胶的大小剪好 。 滤纸及膜。剪好后将滤纸及膜也放入电转液中浸泡~ 。一定要记清 .取凝胶,在胶的左上方剪一小角,放入电转液中浸泡~ 加样顺序与胶正反面的关系。 .按照阳极一海绵.两层滤纸.膜一胶一两层滤纸.海绵一阴极的顺序放入电 转模具中。 每加一层都要用试管轻轻的压一下,避免气泡的存在。然后将模具放入电转 仪中。 注意:保证模具阴极与电转仪的阴极相对应。 玫瑰无须鲍卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 .在 条件下转膜 时。 转膜完成后拔下电源,取出模具。然后在一个干净的培养皿中加入适量的 。用镊子将膜取出并在膜与凝胶缺口对应的同一部位也剪一个三角缺口。 。 再将膜朝着凝胶的一面向下放入中洗即 脱脂奶粉 .将膜放入事先配制好的%的脱脂奶粉溶液. 封闭液中,过夜。 。洗完后放入剪 .剪一张比膜略大的塑料膜。同时,用洗膜次,每次 好的膜中,封好口。按:的比例用封闭液稀释兔血清多克隆抗体,用注射器 吸取抗体液加入剪了一个口的塑料膜袋中,赶尽气泡,封好口,放入冰箱中 。 孵育~ 。按:配二抗液, .将一抗孵育过的膜取出后,用洗次,每次 放在冰盒中保存待用。剪大于膜的塑料膜,将膜放入其中,封好口。加入二抗 液 。 赶尽气泡后,封好口,室温下孵育 。 .取出膜,将膜在中洗次,每次 .用?增强型底物显色试剂盒天根按试剂盒方法配显色液。 显色后扫描膜,保存结果。 .结果 .卵黄脂磷蛋皇的分离纯化和分子量确定 卵匀浆后的蛋白样品通过.纤维素离子交换柱进行层析,经过含, ,,和 的不同离子强度的 .缓冲液含 / / 的 .,.分步洗脱后,产生个蛋白吸收 洗 峰图.。由于卵黄蛋白中分子量最大,经天然电泳发现, 洗脱下来的蛋白, 脱下来的蛋白有明显大分子主带出现,因此,收集 进行层析洗脱后,获得四个洗脱峰、、和图.。 浓缩后加至 峰组分经天然电泳检测,含有单一的大分子蛋白条带,因此,将峰组分浓缩, 玫瑰无须鱼巴卵黄脂磷蛋白是具有调理素功能的免疫识别因子 作进一步分析。根据.所述方法对的分子量进行测定,天然蛋白分子量的测 定约为 图,.显示有三条带,分子量分别为 和图 ,』、冷 ?苗乐?《/ ? . 、 ? ? 加 伯 ?荀焉电《 钟. / 图 凝胶过滤层析 离子交换柱层析和. 通过阴离子交换柱对玫瑰无须伍巴卵匀浆液进行离子交换层析,被含 凝胶过滤层析,对含有目的蛋白的组分进 的缓冲液洗脱下来。通过 行分离,在峰中被洗脱下来。. 一. .