阻抑催化动力学法测定青霉胺

阻抑催化动力学法测定青霉胺 阻抑催化动力学法测定青霉胺 第25卷第5期 2006年5月 分析试验室 ChineseJournalofAnalysisLaboratory Vo1.25.No.5 20o6—5 阻抑催化动力学法测定青霉胺 袁玉,吴建平,宋建健,李焕德,程泽能 (中南大学药学院,长沙410013) 摘要:在HS0介质中,Fe(?)能催化H0与甲基红之间的褪色反应;加入 青霉胺后,青霉胺又能灵敏地阻抑该氧化褪色反应,从而建立青霉胺的测定方 法.青霉胺测定范围为5.0—40.0g/I,检出限为2.4t~g/L.该具有操作简 便,灵敏度高,试剂易得等特点,可用于实验样品中青霉胺的测定. 关键词:阻抑;动力学法;青霉胺 中图分类号:0657,3文献标识码:A文章编号:1000—0720(2006)05.049.04 青霉胺(Penicillamine),又名D.3.巯基缬氨酸, 分子式CHNOS,是一种重要的含巯基药物,用 于治疗肝功能紊乱?,皮肤炎症j,Wilson病J, 风湿性关节炎,胱氨酸尿以及作为重金属中 毒的解毒剂,还有报道青霉胺可阻止人类免疫 缺陷病毒(AIDS)的修复H,治疗进行性系统硬 化,和对缺血后再灌注心肌损伤有保护作用 等.文献报道青霉胺的测定方法或质量控制方法 有电位滴定法,流动注射法,,HPLC_9f法, 具有样品预处理麻烦,试剂不易得等缺点;催化 动力学分光光度法??可用于测定催化剂或活化剂 或抑制剂的浓度或含量,如基于有机物对催化反 应的阻抑作用,再根据阻抑剂浓度与反应速率存 在定量关系,从而测定阻抑剂浓度?.研究发现, 在S()4介质中,青霉胺能灵敏地阻抑Fe?和 H:0:氧化甲基红的褪色反应,从而建立了用阻抑 催化动力学法测定青霉胺的新方法. 1实验部分 1.1仪器及试剂 UV2450型紫外可见分光光度计(日本岛津公 司);GSY—II型不锈钢电热恒温水浴锅(北京市医 疗设备厂).甲基红溶液(以MR表示):取适量用 体积分数50%的乙醇配制成浓度为4.0×10 mol/L的溶液;98%H,SO配成0.1mol/L的溶液; 硫酸铁铵溶液浓度为1.8×10"mol/L(以Fe表 示);体积分数30%的H0.溶液;青霉胺(以PenA 表示)溶液:准确称取青霉胺(Fluka试剂) 0.01g于100mL容量瓶中,加水溶解,稀释至刻 度,摇匀,得100mg/I青霉胺储备液;再取1.0mL 储备液于100mI容量瓶中,加水稀释至刻度,摇 匀,得1.0mg/L青霉胺的工作液.青霉胺片(上海 信谊药业有限公司,规格0.125g/片,生产批号为 040102).所用试剂均为分析纯,分析用水为二次 蒸馏水. 1.2实验方法 在两支刻度一致具塞50mL比色管中,分别 加入1.0mI甲基红溶液,0.4mL0.1mol/LHSO, 1.0mLFe?标准溶液,其中一支吸光度记为A,; 再在另一支比色管中加入适晕青霉胺,其吸光度 记为A,;最后在两支比色管中分别加入0.4mL 30%H,0溶液,用水稀释至25mT,摇匀,放入 90?水浴中加热6min,迅速取出比色管,启开玻 璃塞,在流水中冷却4min,终止反应.再分别将 溶液倒入1cm吸收皿内,以水作参比,于波长为 522nm处测量A和,42,并计算Ig(A:/A)值. 2结果与讨论 2.1吸收曲线 图1所示的系列溶液按实验方法操作绘制吸 收稿13期:2005.06—28:修订13期:2005.09—09 基金项目:中南大学药学院青年教师教改科研基金项目(03'一05') 作者简介:袁玉(1976一),女,讲师 ———— 49-?—— 第25卷第5期 2006年5月 分析试验室 ChineseJournalofAnalysisLaboratory V01.25.No.5 2O06—5 收曲线.曲线1,2,3,4分别表明青霉胺,H:s0, Fe?,甲基红之间均不发生褪色反应;曲线1,5 峰值较其它曲线低,是因为与其它溶液相比,没 加入H,s0,说明H可增强溶液吸光度;曲线6 表明H0在没有Fe"催化条件下使甲基红褪色 的速度很慢;曲线8表明Fe?可催化加速H20氧 化甲基红褪色;曲线7表明青霉胺对该褪色反应 有灵敏的阻抑作用.各曲线在522rim处有最大吸 收,本实验选择的测量波长为522rim. 图1吸收曲线 Fig.1AbsorptioncurVes l—MR1.0mL;2一MR1.0mL+H2S040.7mI;3一MR1.0 mL+H2S040.7mL+Fe1.5mI;4一MR1.0mL+H2SO4 0.7mL+PenA1.0mL;5一MR1.0mL+PenA1.0mL;6一 MR1.0mL+H2S040.7mL+H2021.2mL;7一MR1.0mL+ H2S040.7mL+H2021.2mL+Fe1.5mL+PenA1.0mL;8 一 MR1.0mL+H,S040.7mL+H021.2mL+Fe1.5mI 2.2试剂用量的确定 固定反应温度为90?,时间为6rain,分别改 变甲基红,H2S04,Fe",H20的用量,按实验方 法进行试验,结果表明:甲基红,H's0,Fe?, H202用量分别在1.O0,1.50mL;0.40,0.60mL; 0.50—1.O0mL;0.30,0.50mL范围之内 lg(/.)较大,且较稳定.在此基础上,改变试 剂用量进一步作4因素3水平正交试验(见表1), 可确定甲基红1.25mL,HSOa0.40mL,Fe?1.O0 mL,iI0:0.40mL为最佳试剂用量. 2.3反应温度及时间的确定 2.3.1反应温度的确定结果表明,室温下反应 几乎不发生,反应温度在70,80?时,lg(A/A.) 值随温度升高缓慢增加,反应不明显,85?以上 一 50一 时,阻抑效果愈明显.故选择90?为反应温度. 2.3.2加热时间的确定结果表明,反应温度为 ,加热时间4rain以内,A值较小,不够稳 90? 定,4,7rain时阻抑效果明显,故选择6rain为最 佳加热时问. 2.4工作曲线及精密度 配制一组质量浓度分别为5,10,20,30,40 g/L的青霉胺标准溶液,按实验方法各取1.O0mL 进行试验,分别试验3次,记录吸收曲线,以lg (A,,A.)对进样质量浓度进行线性回归,得其线性 回归方程: lg(A2/A1)=1.685x1010PA(/~g/I)+ 0.Ol306,(r=0.9953,n=5) 青霉胺线性范围为5.0,40.0g/L,其检出限 按36/s计算为2.4g/L.以30tLg/L的青霉胺标准 溶液为测定样品,重复试验6次,其测定结果的 RSD=2.1%,表明此方法的精密度较好. 2.5表观活化能的测定 本反应速率力'程可表示为: 一 dcMR/d,:k1cMH"cIlcI"cF+clJ.(L"cA 由于A:ebc,当同定各反应物的用量时,有: In(一AA/At)=In(c)=lnk+lnc=lnk+常数 由Arrhenius方程:lnk=一E/RT+B可得: ln(一AAIAt):一E/R+常数 固定时问t.:4rain,,2:4.5rain,其它条件为最 佳试验条件,当反应温度在80,95?范围内时, 分别测定阻抑反应和非阻抑反应的?A值(?一= (一A)/2).算出Jg(一AA/At)及1/,值.以 lg(一AAIAt)埘11t进行线性归,非阻抑反应所 得回归方程:lg(一AAIAt):一3294.061xlit+ 7.945,r:0.9994,由此可得非阻抑反应的表观活 化能为E:63.07(kJ/too1).阻抑反应所得回归方 程:lg(一?一/At):一4257.112x1/t+10.597049, r:0.9764,由此可得阻抑反应的表观活化能为E :81.51(kJ/too1). 2.6共存离子的影响 以40g/L的青霉胺标准溶液进行实验,控制 相对误差在?5%范围内,加入一些常见离子进行 干扰实验,结果表明,1000倍量的Na和K,100倍 量的NH4,5o倍量的H2PO4,C6H.06,5倍量的 Zn",M, Cu",Bi,pb2,A1?,ca2无干扰. 第25卷第5期 2006年5月 分析试验室 ChineseJournalofAnalysisLaboratory Vo1.25.No.5 2oo6—5 表14因素3水平正交试验表 Tab.14orthogonalexperimentdesigntable 3样品分析 取青霉胺片1O片,测得平均片重,研碎后准 确称取6份(每份约含青霉胺0.125g),分别置于 50mL的容量瓶中,用水充分溶解后定容,过滤, 分别取滤液适量逐级稀释为约含青霉胺25g/L的 待测液.然后按前述方法进行试验,测得待测液 的平均质量浓度(p为26.63ptg/L,青霉胺加样 回收率为97.6%.此片剂中青霉胺的标示量质量 分数求算方法:求得所取样品粉末中青霉胺平均 含量,再计算出每片青霉胺的含量,再与标示值 0.125g/片相比,即得(见表2).中因药典规定本 品含青霉胺CH..NO:S应为标示量90.0%一 110.O%,因此本品是合格的.与现有的青霉胺测 定方法相比(见表3),本方法具有检测限低,灵敏 度高,方法简单,试剂易得等特点. 表2样品测定 Tab.2Determinationofthesamples 表3几种测定青霉胺的方法比较 Tab.3ComparisonofsomemethodsforthedeterminationofPenieillamine 一 51— 第25卷第5期 2006年5月 分析试验室 ChineseJournalofAnalysisLaboratory Vo1.25.No.5 2oo6—5 参考文献 RuizTP,Martfnez—LozanoC,TomdsVeta1.Journalof PharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,1996,15:33 张学军,杨森,胡跃等.临床皮肤杂志,1994, 6:302 GuptaVK,AliI.Talanta,1998,6:197 WangfuengkanagulN,ChailapahulO.Talanta,2002,58: 1213 Kfiszegi—SzalaiH,PaTL.Talanta,1999,48(2):393 GottiR,PomponioR,AndrisanoV.JournalofChromatog— raphy,1999,844:36l [7] [8] [9] [10] [11] [12] 刘玲玲,王士雯,余松涛等.中国应用生理学杂志, 1998,14(4):333 国家药典委员会.中国药典(二部),2000版,2000, 357 ZhangZ,BaeyensWRG,ZhangXeta1.AnalChimAc— ta,1997,347:325 AmarnathV,AmarnathK,Talanta,2oo2,56:745 WalashMI,MetwallyMES,E1一BrashyAMe,a1.IL Farmaco,2003,58:1325 徐春勇,黄湘源.江西化工,2002,1:l9 Inhibitorykinetic—spectrophotometricdeterminationofpenicillamine YUANYu,WuJian— ping,SONGJian-jian,LiHi,tan-deandCHENGZe-neng(SchoolofPharmaceuticalScience, CentralSouthUniversity,Changsha410013),FenxiShiyanshi,2006,25(5):49,52 Abstract:AnewmethodforthedeterminationofPenicillaminewasproposed.Itwasbasedontheinhibitoryeffectof penicillamineondiscoloringreactionofH2O2andmethylredcatalyzedbyFe"indilutesulfuricacidsolution.Thede— tectionlimitis2.4Landthecalibrationgraphisrectilinearfrom5.0to4O.0gg/Lpenicillamine.Thismethodis simpleandsensitive.Ithasbeenappliedsatisfactorilytothedeterminationofpenicillaminepills. Keywords:Inhibitory;Kineticreaction;Spectrophotometry;Penicillamin 一 52一 ……