氯乙基亚硝基脲导致DNA股间交联的检测分析

氯乙基亚硝基脲导致DNA股间交联的检测分析 每 单位代码: 分类号: 学 号: 密 级:公开 北京工业大学硕士学位 , ‰ ? 题 目氢乙基垩趟基避昱塾坠塑?避间童毯趁捡测佥堑 兰 至坠盟?丛壁睦鱼垒里 英文并列 型墅型垦坠 塾 旦坠壁垦丛 坠塑: 目 壁?&:坠亘巡曼 题 焦 研究生姓名: 研究方向:丝堂生物堂皇盆王匡堂 专 业: 生物丝堂皇筮王生物堂 嬗?一 职 称: 麴握 鲑儡圈』 导师姓名: 一一 职 称: 赵面蜢 副熬援?一 论文提交日期 生?目旦 ?室王些盔堂室壹塑塑匡垩丕垦曼 授予单位名称和地址 一?? 学位授予日期一, 羹 ,四?四四六独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其 他 人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得北京工业大学或其它教育 机构 的学位或证而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 日期:皇三』:曼卫 群:粤 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权 保留送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部 或部 分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密的论文在解密后应遵守此规定 签名:肆导师萼名:多恻。 一 ,要 摘 . 摘 要 氯乙基亚硝基脲是临床上一类重要的抗癌烷化剂,该类药物在发 挥抗癌作用的同时能够诱发白血病等二次肿瘤的产生,其致癌副作用不容忽 视。 研究表明其抗癌和致癌机制均与导致股间交联有关。因此,研究药物导致 的交联能够为抗癌与致癌作用之间的差异提供参考,对癌症的预 防和治疗具有不可忽视的重要意义。本课题以此为出发点研究导致 股间交联的作用程度和交联率的变化趋势。主要采用变性凝胶电泳、荧光方 法和 高效液相色谱.质谱联用.方法对导致的股间交联进行 定性和定量检测分析。 首先,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测司莫司汀? 与的股间交联。四种不同含量%、%、%和%的合成 与.反应的交联产物经进行分离,电泳结果显示经. 作用的含量为%的没有股间交联,而其它三种中均有交联生成, 表明昏能导致碱基对交联,而不能导致碱基对交联。该方法操 作简单,但灵敏度较低,无法检测交联率,仅适用于定性分析。因此,又使用了 灵敏度更高的实时荧光方法进行定量分析。 然后,使用实时荧光法研究了不同浓度的司莫司汀?、卡莫司汀 和尼莫司汀导致入交联的情况。结果表明.和 对入的交联反应初期均存在一个交联率上升缓慢的“诱导期”,“诱 导期”后交联率随反应时间明显上升,在小时左右达到稳定的最大值。 导致的交联率则没有“诱导期”,由于分解较快使得的单碱基烷化产物迅 速增多从而推动了交联反应的进行。对的交联率在反应后期有明显 的下降趋势说明可能导致了断链。实时荧光法与荧光分光光度法相 比检测更加迅速,从而避免了由于测量时间长导致荧光强度衰减而引起的误 差, 因此是一种简便、高效、稳定的交联检测方法。 最后,使用高效液相色谱.电喷雾串联质谱../联用方法对 .导致股间交联的产物进行检测。由于通过荧光方法测得的交联 率是交联双链的含量,而一条交联双链中可能含有多个交联的碱基对,为 了从本质上探讨交联率的变化规律,我们使用../联用方法对 .导致股间交联的碱基对进行了定量分析检测。首先将与亚硝基 脲反应后的样品经过酶解和离心过滤得到单个核苷,然后经反相色谱分离。 使用质谱的选择反应扫描 ,己模式监测“ 专?比的离子通道,对中分离出来的?交联进行定量分析。 经过计算,得到了每 个碱基对中生成.交联的个数。结果表明,含摘 要 量分别为%、%和%的双链中交联率均随反应时间呈上升趋势,并 且均可以明显看到“诱导期的存在。此外,双链中含量越高,在相 同反应时间和相同药物浓度下,生成的.交联越多,表明导致 交联具有一定的序列选择性。 综上所述,本课题分别使用变性电泳、实时荧光和../方法 对导致的股间交联进行了检测。变性电泳方法作为一种定性分析 的方法,重复性好、操作步骤相对比较简单,但是由于灵敏度低,不能满足交 联 率较低的样品分析,故不适用于定量分析。实时荧光方法灵敏度高、分析速 度快, 因而适用于对交联双链的定量分析。../方法检测交联不仅 灵敏度和准确性高,而且与实时荧光方法相比,它检测的是交联碱基对: 而不是交联的双链。因此,../方法更能从本质上揭示交联 率的变化规律,同时比实时荧光方法具有更高的稳定性和重复性。 ??/方法得出的交联率进一步表明,在交联反应的初期明显存在 一段交联率上升缓慢的诱导期,这不仅为阐明交联机理提供了依据,同时为 进一 步探讨交联反应动力学提供了可靠的方法。 关键词氯乙基亚硝基脲:交联;实时荧光;高效液相色谱.电喷雾串联质谱怕 嬲..、, 血.肌 ? ., . ,、? .龇 切 . 僦 锄 ,一 ?曲怕咖 印 ../.? . , . %, %,% %%, . . , . , 母. ,.. , 入?.“. “ ” ? .“ 印.’ . ” , . . . .. ., ,伍 加. .?厂. , . , ., .,?./. ..行. 王 ?、耽 己 / 啪 专/ .. .墩、啪 .. 、张 . . %,% % “ ., ” ., . 砷 也., . , ?./ , . , , , 母’ 戗 汀.. .../ , . . ?., 锄. , .../ 、 “. ” . ? , . . : 缸钆 ?, , ../‘ 目 录 摘要?..??.. 第章绪论.. .研究背景??.. .氯乙基亚硝基脲类药物??.. ..亚硝基脲的基本结构? ..氯乙基亚硝基脲的基本结构和性质? ..氯乙基亚硝基脲类抗癌药物? .氯乙基亚硝基脲类药物的作用机理.. ..氯乙基亚硝基脲的分解机制? ..氯乙基亚硝基脲的烷化和交联作用? . 交联的检测方法 ..凝胶电泳??.. ..荧光法.. ..高效液相色谱.质谱联用技术 .本课题研究内容第章聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测股问交联 .聚丙烯酰胺凝胶电泳概述? ..非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.. ..变性聚丙烯酰胺凝胶电泳?.. .实验仪器和试剂..实验仪器 ..实验试剂??.. .实验方法和步骤.. 的变性退火??. ..氯乙基亚硝基脲与合成的交联反应? ..非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳??.. ..变性聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳.. .实验结果和讨论..核酸染料染色方法的选择..司莫司汀导致股间交联的变 性电泳? .本章小结第章实时荧光法检测股间交联目 录 .荧光分析法概述.实验仪器和试剂??. 。。实验仪器??:.. ..实验试剂??.. .实验方法和步骤.. 浓度的标准曲线??:..? .. 变性过程的实时荧光检测??. ..实时荧光定量仪检测药物导致的交联. .实验结果和讨论.. 浓度的标准曲线. 。.. 变性过程的实时检测?. ..实时荧光定量仪检测药物导致的交联.. .本章小结“?.. 第章液质联用方法检测股间交联? .高效液相色谱质谱技术概述 ..高效液相色谱技术?.. ..质谱概述??一 ..高效液相色谱.电喷雾质谱联用技术的应用 .实验仪器和试剂..实验仪器 ..实验试剂??.. .实验方法和步骤??. ..氯乙基亚硝基脲与合成的交联反应? .. 样品的酶解.??。 ..色谱和质谱条件??.. .实验结果和讨论..交联产物的定性分析.. ..交联产物的定量分析.. .本章小结??: 结论?.. 参考文献??.. 攻读硕士期间所发表学术论文??.. 致谢?..第章 绪论 第章绪 论 .研究背景 癌症是危害人类健康的重大疾病。年月日世界卫生组织报 告显示,癌症是导致人类死亡的最主要原因之一。全球的癌症患者人数逐年攀升, 年,世界上可能会有万名新患癌者,其中万人死于癌症,。。在中 国,肿瘤引起的死亡率在所有病因中居第位,占.%,且发病率呈上升趋势。 据相关部门统计,平均每分钟有人死于癌症,其中肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、 结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌及鼻咽癌等种癌症占癌症死因构成的%以上。 指出人类%~%癌症与环境因素有关,例如烟草、酒精、辐射、感 染、环境污染、化学制品、饮食和药物等,在环境因素中,由化学物质引起的癌 症约占%【。现有证据表明与人类癌症发生有因果关系的化合物共达种,其 中与环境污染有关的如砷,铬,镍,铍,镉及它们的某些化合物等,同时在实验动物中 能诱发癌症而缺乏流行病学调查证实的化学物质约有数百种。化学致癌物中主要 是遗传毒性致癌物,它的化学活性高,可与细胞内大分子和靶作用,并将 单个烷基或复合的烷基基团转移到碱基的特殊位置上,同时还可以引起 .蛋白质交联、.交联、链断裂和碱基改变等多种损伤。化学 因素致癌可以分为间接作用和直接作用。间接作用的化学致癌物包括:多环芳烃, 芳香胺类与氨基偶氮染料,亚硝胺类,真菌毒素等。直接作用的化学致癌物是指 致癌物不经体内活化就可致癌,如烷化剂、酰化剂以及砷、镉等金属及其化合物。 目前治疗恶性肿瘤的方法主要包括外科手术、化学治疗和放射治疗。化学治 疗作为癌症治疗的主要手段之一。随着化疗药物种类的逐渐增多,用药方法的不 断改进,临床经验的不断积累,临床疗效日益提高,化疗已从以前的姑息性治疗 向根治性治疗过渡。根据抗肿瘤药物化学结构和作用机理不同化疗药物可分为多 种类型,包括烷化剂类、抗代谢类、抗生素类、天然产物类、激素类及其它类药 物。烷化剂作为一种细胞遗传毒性类药物是最早用于治疗恶性肿瘤的化疗药物, 也是应用最为广泛的一类抗癌药物”。烷化剂与双链的共价连接可以通过多 种途径导致细胞死亡。烷化碱基可以导致异常碱基配对,复制时引入错误的碱基, 导致正常遗传信息发生改变;鸟嘌呤烷化后不仅可以导致链的断裂而且能 引起碱基与核糖间的断裂,发生脱嘌呤作用,导致整个遗传信息密码子的读码错 误【】。此外,双官能烷化剂的细胞毒性较单官能烷化剂强,当其产生分子间交联 后,可以阻止互补双链在复制时分开,因而阻碍的正常复制过程,此 外也会导致双链发生断裂【,】。目前,细胞遗传毒性类药物作为肿瘤药物治 疗的主体;仍然是世界抗肿瘤药物研发的重点领域。北京工业大学理学硕士学位论文 .氯乙基亚硝基脲类药物 ..亚硝基脲的基本结构 自世纪年代研 等人【最先开展对亚硝基脲类化合物基本结构 如图?所示,与代表相同或不同的烷基或酰基等的研究以来,对这类化 合物的认识就在不断深入,亚硝基脲特别是.氯乙基亚硝基脲中的一些化合物已 经成为活性显著的抗癌药物。? 工 ‖\百/\。 图.亚硝基脲类化合物基本结构 舔 . ...氯乙基亚硝基脲的基本结构和性质 年,.甲基’.硝基.亚硝基胍被发现对白血病有效 引,后来在这种全新化学结构的基础上,.甲基.亚硝基脲被具 有更好的抗癌活性。陌,的.位点的甲基被氯乙基取代后,其活性明显加强, 它就是氯乙基亚硝基脲?类衍生物,基本结构如图.所示。氯乙基亚 硝基脲易分解,如水解反应、见光或受热分解,一般都难溶于水,易溶于乙醇、 丙酮和等。位点的氯乙基取代是这一系列化合物的共同特征,它使得 亚硝基脲具有较高活性,是药物发挥抗癌活性的主要基团。而位点取代物的 不同,可以使得分子的物理特性有所差异,比如:通过提高这一取代基团的疏 水 性,可以提高整个分子的脂溶性,这对于亚硝基脲抗癌活性来说是非常重要 的, 这种高脂溶性使亚硝基脲可以穿越血脑屏障,治疗脑部肿瘤,使氯乙基亚硝 基脲 成为少数能够通过血脑屏障的抗癌药物之一【’】。/\/\/\ 图氯乙基亚硝基脲的基本结构.? 第章 绪论 ..氯乙基亚硝基脲类抗癌药物 氯乙基亚硝基脲作为一类有效的双功能烷化剂【,临床应用广泛。具有代表 性的临床所用氯乙基亚硝基脲主要包括司莫司汀,.?、卡莫 司汀,?,尼莫司汀,奶、洛莫司汀, 、哌啶亚硝基脲?和雷莫司汀,?等【。引, 其结构如图.所示。它们的抗瘤谱较广,对白血病、各种实体肿瘤脑瘤、骨 链瘤、恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤以及多种人类癌症如肺癌、乳腺癌、胃癌、 直肠癌、结肠癌、睾丸癌等有良好的疗效【】。目前,人们又合成出各种不同 结构的氯乙基.亚硝基脲来改造其特性,更好的提高其疗效。其中,.氯乙基.. 肌氨酸酰胺.。亚硝脲们?是一种位被甲基化的咖,已被国际癌症 协会确认在治疗恶性神经胶质瘤方面具有广阔的应用前景【】。另外,年 月美国食品药品管理局新批准上市的苯达莫司汀可用于治疗淋巴瘤、多 发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病和乳腺癌等多种恶性肿瘤【】。/\/内\/ 人 ?\矿 尼莫司汀 司莫司汀.聊入/\/\/\ ~ 卡莫司汀 洛莫司汀聊八/\/ ? /\/\/ 哌啶亚硝基脲 雷莫司汀 图.临床常用的亚硝基脲类抗癌药物 狮 .? 北京工业大学理学硕七学位论文 表本课题研究的三种氯乙基亚硝基脲 ? 赫 唱 .氯乙基亚硝基脲类药物的作用机理 ..氯乙基亚硝基脲的分解机制 研究表明氯乙基亚硝基脲在生理条件下能够通过水解反应产生多种活性中 间体进攻【’羽,生成多种烷基化产物,如..氯乙基脱氧鸟苷酸、.. 氯乙基脱氧鸟苷酸、..羟乙基脱氧鸟苷酸等【,,其中..氯乙基脱 氧鸟苷酸被认为与横向交联有着重要关系【】。由于.键具有不稳定性, 其代谢过程非常复杂。、?【筇】等人提出了氯乙基亚硝基脲可能的几种主要水 解机制。一系列研究表明其中的途径如图.是其在生理条件下分解的主要 途径:亚硝基脲分子在氨甲酰胺处分裂为异氰酸酯和重氮氢氧化物中间体,异氰 酸酯能够导致胞内大分子中的氨基基团甲氨酰化从而使细胞受到损伤,而重氮氢 氧化物则是与作用发挥抗癌活性的主要物质。 等用氘标记经.分析推断被碱基或核苷 酸催化分解生成氯乙基重氮氢氧化物是反应的限速步骤。课题组对标 记的,和?在水溶液中分解产物研究时发现大量的羟氯乙 基和乙醛出现在亚硝基脲的水解产物中,并提出了氯乙基碳正离子是一种重要的 烷化剂【。 第章 绪论 卜南。 怎..譬躲啦昂 卜?卜 , 陋?叫??吼?窿?印二 ?抵等唧 谂 。一口一。 删一?坞哟 一 ? 厂胙五 ?卫嘲触陋?啦参一 厂胙伽 啦啡陋啦墨啦:&里啦一‰ 一 一, 图氯乙基亚硝基脲的主要分解机制 .? 砒丛 ..氯乙基亚硝基脲的烷化和交联作用 能够引起细胞凋亡、增加突变频率、诱导姐妹染色单体交换和染色体 畸变等,其细胞毒性均与导致烷化有关【】。 在溶液中不稳定,容易 分解成多种可以引起烷基化的活性成分,其中氯乙基和羟乙基是两种主要的 烷化 中间体。等人研究了.氯乙基亚硝基脲与小牛胸腺作用后的烷化产 物,其中包括 一.羟乙基脱氧鸟嘌呤和鸟嘌呤胞嘧啶乙基.交联产物 等种产物【引。 缓冲液中 等【】用和小牛胸腺在 反应,将反应后的沉淀并酶解成游离的核苷,然后进行.分析,得 到了种加合物,其中.羟乙基脱氧鸟苷 .等种加合物 的结构得到质谱确认并进行了定量分析如图.和表.。对这些烷化产物进行 分析,认为哪最易于和碱基中鸟嘌呤的。位发生烷化反应,其次还可 以对鸟嘌呤位进行修饰;对胞嘧啶位和腺嘌呤位也可以发生烷化作用。 此外,与反应生成的加合物的种类和含量受碱基序列、反 应体系中阳离子浓度和缓冲液组成等多种因素的影响。芝 氏’ ’ 毒 。众 ~ ?;蜒洲、宫 、 蕃礅‖ 图?小牛胸腺与卧反应烷化产物的分析鹊舶 . 锄曲时 表小牛胸腺与黔反应的烷化产物及其含量硒?呵仃呵以 一 .士..士. . .士. . .士. . .士. . .士..士. 由于卧?与其它亚硝基脲类化合物一样,也通过分解产生碳正离子中间体 导致碱基的烷化损伤。等【使用和反应,检测到产物中含 有,一亚乙基腺嘌呤,..和,.亚乙烯基腺嘌呤,.. 如图所示,这两种化合物在致突变或致癌方面起着不可忽视的作用, 第章 绪 论 研究表明在哺乳动物聚合酶催化下,,..能够使在转录合成 中发生错误编码。,.. 。.. 图. ,.桥亚乙基腺嘌呤和,.亚乙烯基腺嘌呤的结构 .. ,. ,. 除了引起烷化外,还导致股间横向交联.等【研究发 现氮芥在小白鼠白血病细胞上引起的横向交联在小时内几乎可以 完全被修复,而引起的横向交联在小时内则很少被修复。产生这一现象 的原因就在于氮芥中两个烷化中心的距离远超过互补碱基对间的距离,因此 主要 是在非互补碱基对之间形成交联,这种交联很容易依靠互补的碱基作为模板 而被 修复;相反,引起的横向交联是由乙撑承担的,它正好在互补碱基 对的成对负性原子之间形成共价交联,由于没有对应的模板而难以修复。继 后的 研究证实了这一观点,等【】发现引起的交联产物的确是在互补的鸟 嘌呤和胞嘧啶之间发生:在生理条件下首先分解形成重氮盐和异氰酸酯, 其中重氮盐部分进一步分解生成氯乙基正离子并在一条链的鸟嘌呤.上发 生烷化反应,然后氯原子再与.位的氮原子作用并发生分子内的闭环,形成活 泼 中间体,。桥亚乙基鸟嘌呤,然后和互补的另一链上胞嘧啶的位发生烷 化,生成有细胞毒性的股间交联物..’.脱氧胞基】.一【一 .脱氧鸟基 乙烷.如图.所示。 .~玲? 毒’氐儿, 卜魑趋疵. 太? 垫乒逝 。一 . 仃 . 图. 导致生成.股间交联的反应机理 肌 ? 豫 ?出 .? 等【研究发现谷胱苷肽能使.氯乙基化的失活,从 而抑制形成股间交联物。用分别与小牛胸腺和 质粒 作用,加入后发现形成的股间交联物减少,说明能与中间体,.桥亚 乙基鸟嘌呤作用如图.所示,阻断了该亲电中间体进一步与互补胞嘧啶的共 价交联,从而减少对的损伤,降低其细胞毒性。烷基转移酶是一种重 要的损伤修复酶,它能够特异地识别对碱基的烷化损伤产物 .,并把氯乙基从鸟嘌呤的位除去,从而抑制股间交联物的形成 畔啪。但是一也可以与烷基转移酶形成共价交联物,当与修复蛋白 .甲基鸟嘌呤一甲基转移酶形成共价配合物?时,则 表现出细胞毒性【。,。第章 绪 论 图. 淬灭氯乙基化和减弱股间交联 . . 等用高效液相色谱.电喷雾串联质谱../对 与反应的产物进行了研究,检测到了交联产物.的紫外谱图和质 谱图如图.所示,从二级质谱图中可以确认分子离子峰州 十和 州 和毗分别由母离子丢失一个和两 ,以及碎片离子峰/ 个核糖形成【。研究发现倾向于和/丰富的作用,在 条含有个 碱基对的序列中,股间交联由不含时的几乎零交联率,逐渐增加到含有 对时的.%的交联率如表.所示。等用.方法对小牛胸腺 和反应的交联产物进行了定量分析,检测到.和 的含量分 别为.%和.%,证明既能引起股间交联,也能导致股内交联圳。 等用碱变性电泳检测到了导致的股间交联物,电泳过程中未交联的 变性成单链;而交联的双链不能完全打开,其分子量大,从而与未交 联的分离【】,图.为与’末端标记的反应产物的电泳图,图 中可以明显地看到交联的存在。 ? ’ 嚣 嚣 墨% 《 》 。 . . . 墨嵋 长皇?墓苫爹髻一毒 / 图股间交联的色谱、质谱和紫外谱图 . , 锄 . ? 。一”,::。:.’微?辫辫彩 。。、’:,’。。。 。’,晰钾铲?警黧 曩磊搿祷凇一?灞 ?’,撅锄麟‖棒?赣舷,~~参。:茹獬‘.蝴摹蝴 一一 .倒? 第章 绪 论 表. 不同序列双链与作用的交联率 ’ 二 ?. . 交联的检测方法 存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息,因此维护分子的完 整性至关重要。外界环境和生物体内部的因素都经常会导致分子的损伤或 改变。交联是最为严重的损伤形式之一。它通过影响的复制、 转录和重组等,能够引起基因突变和链断裂,进一步引发细胞癌变甚至导 致细胞死亡。一个交联点的形成就可以导致缺乏修复机制的细菌和酵母的死 亡; 大约个交联点可以使缺乏修复机制的哺乳动物细胞死亡【,。更为重要的是, 交联能够引起基因突变和重组,甚至导致细胞生长失去控制,形成肿 瘤。 交联包括股内交联 .和股间交联 .,。本文中所提到的交联主要是指股间交联。它又包括股间 互补碱基交联和股间非互补碱基交联两种类型。亚硝基脲类化合物导致股 间互补碱基的交联,通常是在互补的的位和的位之间。补骨脂素 和丝裂霉素 产生的交联均在股间非互补碱基之间, 前者是在序列的交联,后者序列的.交联【,氮芥类化合 物能够产生更远距离的交联,是在序列的.之间。 导致发生交联的交联剂既存在于环境中又可来源于人工合成。环境中 很多物质都可以导致交联并引发肿瘤,如砷、铬、亚硝胺和石棉等引。为 了更好地治疗肿瘤,减小抗肿瘤药物的副作用,人们不断地合成多种交联剂: 顺 铂【】、氮芥】、亚硝基脲剐和它们的衍生物等等,它们也是通过引起发挥北 京工业大学理学硕七学位论文 抗肿瘤作用。 随着人们对交联在抗癌药物研究中的重要性拥有越来越多的认识,不 断有新的检测交联的方法被推出【训】。根据检测过程中交联剂作用对象的 不同:一类是交联剂直接作用于片段,通常是采用质粒经过酶切的 线性片段或者人工合成的寡聚核苷酸进行实验,包括电泳、荧光染料法和高 效液 相色谱.质谱联用.等方法;另一类是交联剂作用于细胞,然后检测 细胞内的交联水平,包括碱洗脱法、细胞荧光染料法和彗星电泳等。本论 文主要是在分子水平上对股间交联进行检测。 ..凝胶电泳 根据所利用的介质不同,该方法包括琼脂糖凝胶电泳【和变性聚丙烯酰胺凝 ,巾。 胶电泳. 琼脂糖凝胶电泳利用了对热变性和迅速低温冷却的处理步骤。含有横 向交联位点的双股加热变性双螺旋解开,立即在冰浴中冷却,交联位点将 类似于一个拉链起点而使双链的互补碱基立即配对,从而使迅速复 性形成原来的双螺旋。而不存在横向交联的双螺旋则不会发生上述 “拉链效应”,难以恢复双链,仍是以杂乱无章的单链形态存在。电泳可将 单双链分离开来。琼脂糖凝胶电泳可对长度为几百至几千个碱基对片段进 行检测。 电泳方法因其简便性得到广泛的应用。通过碱变性电泳方法研究了三 甲基补骨脂素与入和巾的交联反应情况,证明了该方法的快速简 便性【】。等【】用此方法成功地对福莫司汀导致交联的动力学进行了 初步的分析,结果表明福莫司汀形成烷基化产物的速度较快,而形成交联产 物的 速度较慢。等人借助等方法证明冲蛋白和丝裂霉素导致的 交联的形成有关【】。 当选择只有到碱基对的双链进行分析时,须选用具有更高分辨 能力的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。变性凝胶电泳不需要热变性过程,它 是利 用在变性剂存在条件下也可发生变性解链进行鲥州。在迁移的过程 中,双链逐渐打开,没有交联位点的完全解螺旋成为单链,迁移速度较快, 含有交联位点的无法完全解链,迁移较慢。经过长时间电泳,含有交联的 双链和未发生交联的单链就会分离开。 电泳方法实验步骤比较简便,但是定量效果较差:根据条带强度可以比较交 联程度,但是无法得到更为明确的数量关系,因此电泳往往用于对交联的 简单定性分析。现在这种方法更多被作为一种纯化方法,将电泳后的交联 进行回收,同时可以脱去盐分,产物可进一步进行质谱、测序等分析。第章 绪 论 主 。?’:‘. 一它。’疆, 謦秽警燃婶镰嘲鞲獭 .一:纛毫量?。菇簿蛰罐麓 之。~。:,’?%?’二毫谚磊,秽鞯麓鬟。 : 、,’.:。?‖’.::笺, 一、:: 一、;》 :鬟鬟鬃豢纛露器壤灞 ”,~.,:;:麝泰苏《;;露。谢弘.,正?.、‖ 鼻?:‘器 :【 ;:? 图. 质粒在容胱甘肽存在条件下随着. 浓度增加股间交联的形成【 .一嬲 . 【. ..荧光法 这种方法最初建立使用的是碱性体系,借助溴化乙啶为染料 检测荧光值,是一种检测交联的有效方法。但是,由于它在值为的 体系中进行并且溴化乙啶是强致癌物,大大限制了这种方法的应用。等 人选用能嵌入小沟槽并且毒性更小的荧光染料,在中性 值即生理条件下测定.的交联【 ‘,同时利用分子荧光探针 能够特异识别并结合双链的特性来探讨交联率随反应时间的 变化规律以及各种交联剂的作用机制【。。经这种方法氮芥、卡莫司汀和司 莫司汀 等双官能团烷化剂均被证明能引起 的互补碱基交联,而单官能团烷化剂 如.甲基..亚硝基脲和,.双甲磺基..甲基肼等则不能引起交联。在 利用上述方法证明实验室合成的,.双甲磺基...氯乙基腈及其类似物确实 能够导致交联【 ,具有成为抗癌药物的前景。在此基础之上,他进一步借 助荧光染料法证明他所合成的这种物质经过代谢所产生的中间体对的修复 作用具有抑制性引,因此可以用于对卡莫司汀、环磷酰胺和苯丙氨酸氮芥等 药物 具有耐药性的肿瘤的治疗。 该方法步骤简单,便于操作,可以利用质粒经过酶切的线性片段,也 可以选用其他如小牛胸腺、入等更长片段的。其局限性在于: 不能判别互补碱基对或非互补碱基对之间地交联;应用主要是对体外水解 即可作用于的交联剂的研究,在如何检测代谢后所产生的双官能烷化剂导 致的交联方面还有待于开发。北京工业人学理学硕十学位论文 ..高效液相色谱.质谱联用技术 为 高效液相色谱.质谱联用?技术是以为分离手段, 检测手段的一门综合性分析技术,集液相色谱的高分离能力与的高灵敏度、 专属特异性于一体,弥补了传统检测器的不足,成为药物研究中不可或缺的 工具。 它能够分析交联的分子结构,进而可以判断交联的形式和位点。交联剂作 用于得到的产物可以直接进行液质分析【】,也可以对交联产物进行水解, 对脱落的碱基进行分析,以降低质谱分析的难度。另外,根据与交联剂作用的 在反相液相色谱中变性后的单双链量的变化情况,并以质谱辅助检验,也 能定量的交联率。等【】利用反相高效液相色谱和质谱成功 地测定了交联剂吡咯开苯并吖庚三烯二聚体?对的交联率及其序 列选择性。等【用高效液相色谱.电喷雾串联质谱../ 对与反应的产物进行了研究,检测到了交联产物.的紫外谱 图和质谱图。 研究发现倾向于和/丰富的作用,在条含有 个碱基对的序列中,股间交联由不含时的几乎零交联率,逐渐增加 到含有对时的.%的交联率。等【用?方法对小牛胸腺 和反应的交联产物进行了定量分析,检测到.和 的含 量分别为.%和.%, 证明既能引起股间交联,也能导致股内交联。 .本课题研究内容 氯乙基亚硝基脲是临床上重要的抗癌药物,具有较高抗癌活性同 时也有致癌副作用,能够引起二次肿瘤的产生。其导致股间交联是重要的 抗癌机制,但目前关于该交联的作用机理尚未有明确完整地阐明。本课题以 此为 出发点,采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、实时荧光和高效液相色谱.电喷雾串 联 质谱../方法对股间交联进行分析,探讨不同在 不同条件下的交联反应动力学规律,为阐明亚硝基脲与的作用机理、揭示 亚硝基脲抗癌与致癌作用的差异提供依据。 电泳法是检测股间交联较为简单快速的方法。变性凝胶电泳是利用在 变性剂存在条件下可发生变性解链而进行的。电泳时在迁移的过程中,双 链逐渐打开,没有交联位点的完全解螺旋成为单链,迁移速度较快,含有 交联位点的无法完全解链,始终迁移较慢。经过长时间电泳,含有交联的 双链和未发生交联的单链就会分离开。 实时荧光法是根据荧光染料与双链结合后激发荧光的性质,研究几种 不同浓度导致入股间交联的交联率变化趋势,同时结合对变第苹 绪 论 性淬火过程的分析,对交联反应规律作出合理解释。在此基础上,建立了一套 简 便、高效、稳定的交联检测方法。 ../方法检测与的股间交联作用,首先将与亚 硝基脲反应后的样品经过酶解和离心过滤得到单个核苷,然后经反相色谱 分离。使用质谱的选择反应扫描 ,己模式监测 州 专沈的离子通道,对中分离出来的.交联进行定量分 析。经过计算,得到了每 个碱基对中生成.交联的个数。结果表明, 含量分别为%、%和%的双链中交联率均随反应时间呈上升趋 势,并且均可以明显看到“诱导期”的存在。此外,双链中含量越高, 在相同反应时间和相同药物浓度下,生成的.交联越多,表明导致 交联具有一定的序列选择性。通过比较三种交联检测方法,认为 ../方法更能从本质上揭示交联率的变化规律,同时比实时荧光 方法具有更高的稳定性和重复性。../方法得出的交联率进一步 表明,在交联反应的初期明显存在一段交联率上升缓慢的诱导期,这不仅为 阐明 交联机理提供了依据,同时为进一步探讨交联反应动力学提供了可靠的方 法。第章聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测股间交联 第章聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测股间交联 .聚丙烯酰胺凝胶电泳概述 聚丙烯酰胺锄,结构式为一一一】。,分子 量万,是一种以丙烯酰胺和,’.亚甲基.双丙烯酰胺交联为单位的人工 合成凝胶,结构如图.所示。 %《卜 叫铲器铲躲心 ‘严 枷 卜 宁???? 本 / 尸 妇 《吣 : 午 ?托一一碣一明..一 丙烯酰胺 ,二甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 图..聚丙烯酰胺的形成.. 聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常见的检测方法,此法分离小于 的 片段效果很好,分辨率极高,只相差的片段也能分开,且可容纳相对 大量的。该方法优点主要为:合成聚合物,重复性良好;分离能力好; 通过增减丙烯酰胺单体和交联剂,’.亚甲基双丙烯酰胺的浓度,可以调节 凝胶的孔径大小;操作简便、时间短:化学性质稳定、机械性能好,柔软; 在酸性或碱性缓冲液中均可进行电泳,而且可加入两性电解质进行等电点电 泳,使用范围广泛,利用价值日益提高;由于染色技术的进步,可以进行定 量,也可检测出极微量的斑点【引。 ..非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.可以使生物大分子在电泳过程 中保持其天然的形状和电荷,它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶 的分 子筛作用,因而可以得到较高的分辨率,尤其是在电泳分离后仍能保持生物 大分 子的生物活性,聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于的 片段和序列。其装载的样品量大,回收纯度高,长度仅相差.% 即中的的核苷酸分子即能分离。对于生物大分子的鉴定有重要意义。 北京业大学理学硕十学位论文 禽硫? 离鲂銎厂 爹?一?孝“:。.:, 鬟一? 囊? 。 一。,’ , , 蠹,?:?二,。;”襄,;, %一一 “ ??:?。‘, 分子量及净电荷密度均影响泳动率 、为带负电生物大分子且分子量大于,为带正电的生物大分子 图?.非变性凝胶电泳原理 .?. 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体,在催化剂,,’,’.四甲基乙二胺 ,促凝剂,催化过硫酸铵产生自由基,易燃、有腐蚀性、易挥发和过硫 酸铵的作用下,丙烯酰胺聚合形成长链,聚丙烯酰胺链在交联剂,,’. 亚甲基.双丙烯酰胺参与下,聚丙烯酰胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的,不同浓度丙烯酰胺 , 和的有效分离范围见表.。 表..不同长度电泳时选用的凝胶浓度 溴酚兰 二甲苯青木 丙烯酰胺% 有效分离范围 . ~~ .~ .. ~. ~ ’ .. . ~木表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链分子所含碱基对数目, 溴酚兰 和二甲苯青作为电泳时间的指示剂。第章聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测股间交 联 本课题所使用双链长度,分子量约为,根据不同浓度丙烯 酰胺和的有效分离范围选择胶浓度%即可。 ..变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 锄 仃, 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上,加入了变性剂尿素和甲酰胺,尿 素可与碱基形成氢键,破坏双螺旋结构,碱基对在凝胶内迁移过程中发生 解链,从而能够实现双链的变性。甲酰胺主要作为变性单链的稳定 剂【】。【】等使用该技术对特定序列双链与顺铂等药物作用动力学进行 研究,从电泳图可直观看到交联产物处电泳条带随反应时间延长而逐渐变亮, 同 时未与药物发生交联反应的在电泳图中条带逐渐变暗,以此确定与 不同药物作用的反应动力学曲线,比较不同药物的细胞毒性强弱。等人 使用变性凝胶电泳比较了表氯醇及其三种衍生物同属双功能烷化剂与已知 序列交联位点的确定、交联反应效率高低及不同浓度对交联率的作用。 等人利用 股间交联作用是临床上抗癌药发挥药物活性的主要反应, 变性电泳直观获得了几种不同取代基的双功能亲电试剂分别与作用后的交 联情况。 .实验仪器和试剂 ..实验仪器 ?.型三恒多用电泳仪电源:北京市六一仪器厂 . ?一双垂直电泳槽:北京市六一仪器厂 ?凝胶成像系统:美国安莱公司 ?恒温混匀装置:德国公司 ?超纯水装置// :美国公司 ?型台式酸度计:美国公司 江苏海门市麒麟医用仪器厂 ?.型旋涡混合器: ?电子天平:上海森信实验仪器有限公司 ..实验试剂 ?司莫司汀.:美国公司 . ?核酸染料:美国公司 ?合成、,,’,’一四甲基乙二胺、丙烯酰胺、,’亚甲 北京工业大学理学硕士学位论文 基.双丙烯酰胺、过硫酸铵、尿素:北京赛百盛生物工程公司 ?三羟甲基氨基甲烷,分析纯、乙二胺四乙酸,分析纯: 北京鼎国生物技术有限公司 甲酰胺分析纯: ?无水乙醇分析纯:北京嘉仕腾试剂公司 ?溶液的配制: . . 方法:称量. 置于 烧杯中;加入约 去离子水充 分溶解,将溶液转入容量瓶定容至 ;室温保存。 . 髓: , 退火缓冲液 ., 摩 方法:分别移取止摩尔浓度.的.、. 尔浓度. 的’,均匀混合, 的、此摩尔浓度. 加去离子水定容至 ,?保存。 .× .. ,? , ,硼酸 ,调至.,加水定容至 保存。实验中将贮存液用蒸馏水稀释倍即为工作液。 .%~丙烯酰胺:丙烯酰胺 ,,’一亚甲基一双丙烯酰胺 ,加 水至 装于棕色瓶内,?可保存二个月。 .%过硫酸铵:过硫酸铵 ,?避光保存可用周, ,加水至 .?保存可用个月。 .上样缓冲液×: ,%~,甘油,.% ?二甲苯青 ,.%?溴酚兰 ,.,?保存。 .核酸染料工作液 组分浓度:×染料原液用去离子水稀释为× . 的溶液充分混合。 方法:此原液,加入 .电泳缓冲溶液.× × 方法:取 于 容量瓶中加去离子水定容。 .实验方法和步骤 .. 的变性退火 .将合成的每管单链见表?在一转/分钟的转速下离心分 钟,防止开盖时引物散失。 .收集管中制品于管底,然后轻轻打开管盖,每管 单链中各 加入此退火缓冲液,盖上管盖,使充分溶解。 第章聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测股间交联 .每管各取此,互补单链混合液充分溶解,此时双链浓 度 咖的质量约为肛。 ,关闭电源,自 .将取出的混合液用封口膜将管口‘密封,水浴?变性 然冷至室温?以下; .退火后的溶液置于?保存备用,.?长期保存。 ’.订越~久一’ .。 . 。 % . ’.气丑玎仉钔舱丑钢阿气一 ’一.’’’?’ ,拥 % . 二钮 ’’仉盯一’ ’?’ .细 .。 ’ % . ‘,皇‘ .’ ,. ’.’一’ .。 ,、,、 ‘” % . ’纠’ ,..’ ..氯乙基亚硝基脲与合成的交联反应 .与亚硝基脲在?进行反应 %含量分别为%、%、%和%的四种合成 ‖ 各取斗 ,移入用锡纸包被的四支离心管中,每管再加入肛去离子水,在? 恒温混匀装置上预热。 用分析天平称取 药物,将其溶于此无水乙醇,配制药物浓度为 的.。 .取样 的? 向四种含量的合成试液中各加入“浓度为 并开始为反应计时,取与药物作用 的样品各此加入到对应标号. 离心管中,迅速放入.。冰箱保存。对照管中取此未与药物作用的 试液。各管中终浓度为弘/。 ..非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 据分离片段的大小及需凝胶的容积,配制聚丙烯酰胺凝胶。具体操作 步骤如下: .按要求装配好垂直电泳板,保证封闭完全,防止聚丙烯酰胺液漏出。 .配制 浓度%凝胶备用。 .加入此%过硫酸铵、此,立即混匀,用移液枪缓缓注 北京工业大学理学硕士学位论文 入两玻璃板间的胶床中,直到液体接近溢出时为止。 .立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿下产生气泡。 .室温聚合小时后,小心取出梳子和封条,将玻璃板插入电泳槽中,上 紧,倒入.×缓冲液。 .立即用缓冲液冲洗加样孔,防治梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯 酰胺会流入加样孔内聚合,产生不规则的表面。 .将样品与适量的上样缓冲液混匀,加到样品孔孔,加样时不要 产生气泡。四管样品均加入此的×上样缓冲液,每孔上样此。 .接好电极,以恒定电流 进行电泳小时。 .根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳。 . .电泳毕,切断电源,取出凝胶板,小心移去玻璃板,取出的凝胶放入盛 有×核酸染料的培养皿中避光染色小时后将凝胶置于凝胶成像仪下观 察结果。 ..变性聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 .× .制胶:确定加入尿素. ,再加入 和甲酰胺 和 的%凝胶储存液,充分溶解,配制成%的变性聚丙烯酰胺凝胶溶 液 ;依次加入%过硫酸铵此, 此,迅速混匀制胶。 .上样,电泳: 取相等体积相同浓度肛‖样品皿与“的上样缓冲液混 匀,加到样品孔内,加样时不要产生气泡,每孔上样此。样品主要有两部分: 一类是四种含量的未加药双链;一类是四种含量分别与 .作用 后的取样。 电泳条件:电泳缓冲液.×,恒定电流 ,电泳时间小时。 .实验结果和讨论 ..核酸染料染色方法的选择 是一种具有凝胶染色特性,并被设计为替换毒性高的染色剂一溴 化乙啶的红色荧光核酸染色剂。在性能和可操作性方面均超过 或。通常,最显著的特性是其比等染料有更高的灵敏性 和稳定性。既可用于前染 ,也可用于后染 。通常后染比前染能够获得更灵敏的特性,并能排除染色剂在电泳过程 中对核酸条带分离造成任何影响的可能性。经预实验,确定用后染法对聚丙 烯酰第章聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测股间交联 胺凝胶电泳的染色。 ..司莫司汀导致股问交联的变性电泳 根据股间交联原理,含有横向交联位点的双链在变性聚丙烯酰胺凝胶 中发生变性时,双螺旋不能完全解为单链,而不存在横向交联的双螺旋在 同样条件下变性以后则难以复性,以杂乱无章的单链形态存在。由于双链 较单链具有较大的分子量,电泳过程中迁移速度较慢,可将二者分离开来。 首先参照文献条件用含量分别为%、%、%和%的双链进 行电泳预实验,找到可以使样品双链完全变性的尿素和甲酰胺最佳加量, 图.图显示完全参照文献变性凝胶变性条件尿素 ,不加甲酰胺尚 不能将双链完全变性为单链,当尿素 ,甲酰胺加量为制胶液体积/ 时得到双链变性较为完全的电泳图,如图.的图所示。在该变性条件下 进行与药物作用取样的电泳,结果如图.所示,含量为%的 双链位置没有条带显示,而含量分别%、%和%的与药物作用的 有条带显示并且条带亮度随含量增加而增强,这表明氯乙基亚硝基脲导致的 股间交联位点主要在碱基对之间;四种含量未加药均没有条 带显示,形成鲜明对照。 ,泳道:%的双链;~:%的双链;~:%的双链; ~:%的双链 图.双链变性电泳图. 北京工业大学理学硕十学位论文 一 , 王 ’ 唾一 “,‘。。 , ;‘ ,.吕 “’臣一’。 ? 一 , 一:?,。一?臼譬田,,?圈 ‖??? 釜一..。,夸 毒’。一一?.:鬈。一。?。锄 一。 一 自 ; 。‘‘’ ” :、。。, 一,;。 ; ‖。?、一、。?“一一 .: ?.‘ 嚏,一。.,一一。氇 ??童。。。麓?:????,镄 攀隧霞黝爨黝幽翻蠡黧戳廖步 泳道、、、:含量分别为%、%、%和%的未加.的双链; 泳道、,。、、:含量分别为%;%、%和%双链分别与 作 ’ 用 后的取样。 图.双链和经.作用 的的变性电泳图 锄 ? .? ?: .本章小结 本章使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测司莫司汀. 与的股间交联。四种不同含量%、%、%和%的合成 与.反应的交联产物经进行分离。首先准备样品: 的 .分别与四种含量的在?下反应 后取样,保存与. ?下:然后通过未加药的变性凝胶电泳确定能使双链完全变性所适 合的变性条件;在适宜的变性电泳条件下检测经.作用的股间交 联情况。 检测结果显示经?作用的含量为%的没有股间交联,而 其它三种中均有交联生成,表明.能导致碱基对交联,而不 能导致碱基对交联。该方法操作简单,但灵敏度较低,无法检测交联率,仅 适用于定性分析。 第章实时荧光法检测股间交联 第章实时荧光法检测股间交联 , .荧光分析法概述 如前文所述,目前从分子水平上研究抗癌药物的性质以及与核酸作用机理的 方法比较多,包括电泳、荧光、紫外、液相色谱.质谱联用、核磁共振谱等。其 中荧光法 具有较高的灵敏度和较宽的线性范围,而且仪 器简单,已在临床检验、药物分析、环境污染物分析以及生命科学、生物医学科 学研究中得到广泛应用。本实验以荧光探针与结合通过荧光法来检测 导致股间交联的程度。荧光探针技术不仅可以用来测定药物.核酸 的相互作用方式,而且能够通过荧光染料分别与单链和双链 结合后在一定激发波长下所产生的荧光光谱的差异而确定‘和 的量。 荧光法是利用物质发射荧光的特性进行分析的光学分析法。分子发光按激发 模式分类包括:化学发光、生物发光、热致发光和光致发光。荧光属于光致发光, 其产生原因是分子吸收光能后,基态分子从基态跃迁到激发态,而从第一激发态 的最低振动能级返回基态时,分子将以光的形式释放所吸收的能量。 荧光法检测的类型包括直接荧光检测和间接荧光检测。一些样品如少数氨基 酸:色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及部分蛋白质、核黄素、水杨酸钠等本身可以发 荧光,可以直接进行荧光检测,即直接荧光测定;对于那些本身荧光很弱或不发 荧光的物质需要使其转化成荧光物质再进行检测则是间接荧光检测。典型的间接 荧光检测有化学反应引导的荧光检测和制备荧光衍生物与荧光试剂反应生成 荧光衍生物,如溴化乙啶和结合的检测。本实验以为荧光探针 与结合来进行荧光检测,因此属于间接荧光测定。溶剂、值、温度、 淬灭剂、样品浓度等环境因素都能影响荧光测定。相对于紫外。可见光度法,荧 光分析法的灵敏度高,检测下限在.~. ‖之间;并且选择性好,可同 时用激发光谱和荧光发射光谱进行定性分析。 荧光法检测交联的步骤简单,能够检测交联率随时间的变化趋 势。所需设备仪器容易获得,常用仪器为荧光分光光度计,但由于该仪器只能单 个样品进行测量,操作工作量大且比较繁琐,测量时间过长,引入了较多的操作 误差。另外,单个地检测样品不能完全保证测量条件的一致性,也给其增加了一 定的系统误差。因此,寻找一种具有更高的效率、灵敏度和重现性的检测手 段对 于交联实验中减少测量误差和提高实验结果的稳定性是十分必要的。 本实验中采用的荧光检测装置是实时荧光定量. 仪。 公司推出,该技术不 该设备所用技术于年由美国 北京工业大学理学硕士学位论文 仅实现了对瓜模板的定量,而且具有灵敏度好、特异性高、能实现多重 反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点,目前己广泛应用于分子 生物 学研究和医学研究等领域。传统的荧光染料法原理是在反应体系中,加入 过量荧光染料,荧光染料特异性地掺入双链后,发射荧光信 号,而未掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号 的增加与产物的增加完全同步四。 图.化学结构式 .一 是公司..的结合染料,它是一种同时适用 于实时和高分辨率熔解曲线分析的新一代染料【.】。这种染料通 过一种被称为“按要求释放”的全新机制,选择性地结合双链。这一机制保 证了较低的抑制作用,同时也允许在染料饱和浓度以下进行分析。 由于染料在光谱特性上类似于以及 ,因此这种染 以及 料兼容所有商业化的仪器。此外,和 不同的是,染料非常稳定且无致突变性和细胞毒性。基于此,本实验 选用作为荧光检测的染料。 .实验仪器和试剂 ..实验仪器 ? 实时荧光定量仪:美国公司 .珊仪:英国砒公司 ? ? 超纯水装置// 美国公司 ? 恒温混匀装置:德国公司 ? 型台式酸度计:美国公司 第章实时荧光法检测股间交联 ?电子天平:上海森信实验仪器有限公司 ..实验试剂 ?司莫司汀.、卡莫司汀、尼莫司汀:美国 公司 ?荧光染料:美国公司 ?撇扣入,.“‖:出宝生物工程大连有限公司 ?三羟甲基氨基甲烷%,分析纯、乙二胺四乙酸,分析纯:北