[doc] IL-1β对谷氨酸致痫大鼠大脑皮质、海马内NMDAR1免疫反应变化的影响

[doc] IL-1β对谷氨酸致痫大鼠大脑皮质、海马内NMDAR1免疫反应变化的影响 IL-1β对谷氨酸致痫大鼠大脑皮质、海马内 NMDAR1免疫反应变化的影响 神经解剖学杂志 (ChineseJournalofNeuroanatomy) IL一1l3对谷氨酸致痫大鼠大脑皮质,海马内 NMDAR免疫反应变化的影响? 王争艳周厚纶刘庆莹 (华中科技大学同济医学院 朱长庚童逸龄魏瑛 解剖学系,武汉430030) 摘要为了进一步探讨IL一1口在促进癫痫发作中的机制,用免疫组织化学方法比较了单纯用致痫量谷氨酸钠致痫的大鼠和预 先向侧脑室注射IL一1口再用阈下剂量的谷氨酸钠共同致痫的大鼠脑内NMDAR免疫反应的变化.结果表明,IL一1口和谷氨酸钠 共同致痫的大鼠大脑皮质及海马CA.区NMDAR免疫反应较对照组明显增强(P<O.05),与单纯用谷氨酸钠致痫的大鼠没有 明显区别.如果预先给予IL—lra或D—AP5则IL一1口和谷氨酸钠的共同致痫效果不出现,脑内NMDAR1免疫反应与对照组比较 未见明显增强(P>O.05).本实验结果表明,IL—l口具有促进癫痫发 作的效应,这种促癫痫效应的发挥与谷氨酸受体具有协同作 用,并与通道型NMDA受体R亚单位表达的增加有关. 关键词IL一1口IL—lraD—AP5NMDAR1免疫组织化学癫痫大鼠 EFFECTSOFIL一113ONTHEVARIATIONOFNMDARECEPTOR SUBUNIT1IMMUOREACTIONINRATSWITHSEIZURE INDUCEDBYL—GLUTAMATE WangZhengyan,ZhouHoulun,LiuQingying,ZhuChanggeng,TongYiling,WeiYing (DepartmentofAnatomy,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030) AbstractWeexploredthemechanismofIL—l口 intheonsetofseizure.ExperimentalratswereinjectedwithIL一1口 firstandthen L—glutamate(adoseunderthethreshold)intothelateralventricleandweresacrificed2hoursaftertheonsetofepilepticactivity. ThechangesofNMDAR1wereexaminedbymeansofimmunohistochemistryandcomparedwiththatofratswithseizureinduced byL—glutamatealone.WefoundthattheimmunoreactionofNMDAreceptorsubunit1inhippocampalCA3areaandneocortexof ratswithseizureinducedbyIL一 18andL—glutamateweregreaterthanthatofcontrolgroup(P<O.05).Whereastherewerenore— markabledifferencesintheimmunoreactionofNMDAR1betweenthetWOexperimentalgroupofrats.Pre—applicationofIL—lraor D—AP5.eliminatedtheepilepticactivitiesandtheincreasedimmunoreactio nofNMDAR1inducedbyIL一18andL—glutamate.The expressionlevelofNMDARl,underthisconditionswasnodifferencewiththa tofcontrolrats.TheseresultsindicatethatIL一1口 canfacilitatetheonsetofepilepsybyL—glutamatethroughthecooperationbetweenII一1Randglutamatereceptors,andthatthe increasedexpressionofNMDAR1iSinvolvedintheprocess. Keywordsinterleukin1beta.IL—lra,D—AP5.NMDAR1,immunohistoch emistry,seizure,rat 癫痫是一种危害人体健康的常见病,多发病.癫痫的发病与免疫一神 经一内分泌网络调节失衡有关. ?国家自然科学基金(No.30170484)资助项目 通信作者:朱长庚地址:华中科技大学同济医学院解剖学系,武汉 430030,电话:027—83657603 E—mail:zhucg@public.wh.hb.cn 神经解剖学杂志第2O卷第1期2004年1月 白细胞介素一ll3(interleukin1beta,IL一1)是一种多 功能的细胞因子,在体内具有广泛的调节作用.在脑 内IL一1主要由星形胶质细胞产生,在正常生理状 态下,它:参与脑的生长发育,在病理状态下,它与脑 缺血,脑:损伤,Alzheimer病等中枢神经系统疾病的 兴奋性损伤有关.研究发现,IL一1p能增强谷氨酸钠 的致痫效果口],体外实验中IL一1能提高NMDAR mRNA的表达],而预先给予受体拮抗剂IL—lra, 则致痫效果及NMDARmRNA表达的增高均不出 现.兴奋性氨基酸NMDA受体活性及表达的增高 在神经元的兴奋性损伤和癫痫的发病机制中起重要 作用.有关在体状况下IL,1促痫作用与NMDAR 的关系尚未见报道.有鉴于此,本研究拟通过侧脑室 注射IL一1和II一lra观察IL一1对谷氨酸致痫大鼠 脑内NMDAR免疫反应变化的影响,以进一步了 解IL一1在癫痫发作中的作用. 材料和方法 1.动物分组 健康雄性SD大鼠40只,体重170,240g,实 验室条件下喂养,随机分为5组(每组8只):(1)生 理盐水对照组(NS组);(2)谷氨酸钠致痫组(Glu 组);(3)IL一117+谷氨酸钠组(IL一14-Glu组);(4) IL,lra+IL一14-谷氨酸钠组(IL—lra组);(5)D— AP54-IL,14-谷氨酸钠组(D—AP5组). 2.模型制备 大鼠在0.4戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉 下固定于江湾II型立体定位仪上,行右侧侧脑室注 射.注射点坐标为:前囟后0.8mm,中线旁1.5 mm,硬膜下3.8mm.10l微量注射器垂直注人.1 组注人NS6l,2组注人L—Glutamate(50mg/m1) 6txl(1500t~g/kg,致痫剂量),3组注人IL一1500U (2500U/kg,北京宝赛生物制品公司)后停针10min 再注人L-Glutamate(50mg/m1)3/xl(1500t~g/kg, 阈下剂量),4组注人IL—lra2.5g(12.5t~g/kg,北 京宝赛)后30min,再注人IL一1和L—Glutamate同 第3组,5组注人D—AP53l(40nmol/gl,Sigma) 后30min,再注人IL一1和L—Glutamate同第3组. 各组动物注射后均停针10min缓慢拔针. 3.行为观察 参照Schultz,Krohn等口的评估将动物癫 痫发作的行为表现分为6级.0级:无反应;I级:须 动,咀嚼;?级:头面部抽搐;?级:前肢或后肢抽搐; ?级:四肢节律性抽搐;V级:除?级以外表现,可以 伴有打滚,角弓反张.观察4组动物的行为表现,? 级及?级以下表现为轻型发作,?级,V级表现为 重型发作. 4.灌注取材 大鼠麻醉后仰卧固定,开胸,经升主动脉灌注, 先用37?生理盐水150ml快速灌注,再灌注4多 聚甲醛(0.1mol/IPBS配制,pH7.4)500ml,1h 灌注完毕.开颅取脑,将修好的组织块后固定于上述 固定液中6h(4C),再置于含20蔗糖的PBS(0.1 mol/LpH7.4)中4C过夜.待组织块下沉后用恒冷 箱(一20C)切片机做厚度为30m的额状切片,取含 背侧海马最大切面的切片供免疫组织化学反应. 5.免疫组织化学反应 切片经0.01mol/LPBS充分洗涤后置于0. 3HO一甲醇中20min阻断内源性过氧化物酶, 然后在l:40牛血清白蛋白中37C孵育lh,再依 次人鼠抗NMDAR(2.5/~g/ml,Gibco)37C孵育1 h,4C48h,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1: 200北京中山公司)37C孵育1h,以GDN(葡萄糖 氧化酶一DAB一硫酸镍胺)法显色15,20min,以上各 步骤之间皆用0.01mol/LPBS充分洗涤.切片经 37C烤箱烤干后常规脱水,透明,封片. 对照实验用PBS缓冲液代替第一抗体孵 育切片,结果为阴性. 6.图象分析及统计处理 采用HPIAS一1000高清晰度彩色病理图文分析 系统对图片进行图像分析.每例动物测2张切片,每 组共16张切片.每张切片注射侧海马CA.区及大 脑皮质分别随机选取2个×100视野进行测量.分 析指标:平均光密度(D).以上数据有分析系统自动 计算.统计学方法采用配对t检验. 结果 1.行为观察 NS组大鼠未见癫痫发作.Glu组大鼠在给予谷 氨酸钠后都出现面肌抽搐及上肢,下肢和躯干肌节 律性抽搐,并有竖毛等表现,癫痫发作达?一?级,持 续约20min后恢复正常.IL一1+Glu组大鼠在给予 IL一1后未见明显惊厥发作,继续给予谷氨酸钠后 出现面肌及上肢,下肢和躯干肌节律性抽搐,癫痫发 作均达?级,持续约20min后恢复正常.IL—lra及 D—AP5组动物未见明显癫痫发作. 王争匏等tI1口对谷氨酸致痈大鼠大脑皮质,海内NMDAR免痤反应 变化的影响 2.NMDAR阳性细胞在大鼠大脑皮质,海马的分布 光镜下观察.NMDAR阳性细胞在大脑皮质各 层内弥散分布.在海马主要分布于CA,CA:,CA 区锥体细胞层及齿状回颗粒细胞层.阳性细胞表现 为胞核呈空泡状,胞浆内可见蓝色免疫反应产物.大 脑皮质锥体细胞可见较长的阳性顶树突(Figs.1a- b). Fig.1a]mmb,3a.3b).NMDAR-免疫反应的平均光 密度显着高于NS组(P<0.05,表1).而Glu组与 II1B+Glu组比较则无明显区别(P>0.())II, lra组及DAP5组与NS组比较可见海马CA区及 大脑皮质内NMDAR免疫反应的平均光密度变化 不明显(表1).细胞着色均较浅.阳性纤维也未见明 显增多(Figs.4a,4b,5a.5b) 表l大脑皮质及海马(TA区NMDAR免疫反应平均光密度值(? 讨论 注:与对照组比鞍*.P<005 在正常生理状态下,脑内的血管内皮细胞,小胶 质细胞,星形胶质细胞及神经细胞均具有合成II1 的能力.根据分子结构和等电点不同,lI1可以分为 II一1a和It1口两种亚型,在脑内主要以IL一1口的作 用为主]在脑内II一l口不仅参与中枢神经系统的发 育和生长调节’.而且[乜参与病理状态下神经系统 的损伤过程,如脑缺血,脑损伤,Atzheimer病等.在 这些病变过程中.内源性增高的II1p明显促进了 损伤的发展I免疫组织化学研究发现.马桑内酯, 海人酸,戊四氮,谷氨酸钠及电刺激致痈大鼠和听源 性惊蹶易感大鼠脑内1I.1的表达增高,癫痫患者 脑脊液及血清中1L一1p的含量也增高同时.在电 刺激惊厥模型.向侧脑室微量注人IIlra(receptor antagonist)可以明显减轻运动性惊厥(behavioural convulsion)的严重程度】,海马内给予外源性重组 II一1ra可以明显抑制荷包牡丹碱(bicucuilineme thiodide)导致惊厥小鼠的行为表现和脑电图表 现.本实验室的研究也发现,谷氨酸钠致癫痫大鼠 脑内II1受体(ILIR)的免疫反应增加(待发表). 这提示1113参与了癫痫的发作过程.其作用的发 挥是通过其相应的高亲和力受体IllR实现的. NMDA受体是离子型的谷氨酸受体,具有NM— DAR】和NMDAR两个亚基.其中NMDAR在功 能性NMDA受体中起重要作用.是该受体的功能 58抻经解剖学杂志第20卷笫1期2004年】月 4a Fig2aImmunoreactlon0fNMDARIin~eogortexofseizureTatsinducedbyL —Glutamate~lone.TheaH.wshowsimm?reac tirepositivepyramidalceil.×100 FigZblmmunoreacdonofNMDARIinhippocampalCA3areaofseizurersin ducedbyL-Glutamaleg~]one.The~Troxvshows intmunoreactivepositivepyramida】eel【ofthehippocampalCAat-e8.×i00 Fig.3a Fig3b Fig4a Fig Fig. Fig.5b lmmunoreaetion0fNMDARIinhippocampalCAn8teaofseizureratsinduce dbyIL-1日and1.-Glutamate. ×100 [mmunoreaetionofNMDAR:in~eocoTtexofratsinjectedwithI11?.II,18andLGIutan~ate×100 ]mmunoreaetionofNMDARIinhlppocampa[CA3ar…fCRtSinjectedwith 1L…1,IL.13andL-Glutan1atex1O0 [mmunoreaetion0fNMI)ARLinneoconexofratsinjectedwithDAP5.IL1Ba ndL,G[utanmte×100 ImmunoreaefionofNMDARIinhippocampa[CA38r…ofa[sinjectedwith DAP5.【】1日andL-Glutamate.×100 《嚣 王争艳等:IL1口对谷氨酸致痫大鼠大脑皮质,海马内NMDAR1免疫 反应变化的影响59 单位.NMDA受体在脑的发育,神经可塑性调节及 长时程增强等方面有重要作用,尤其与一些动物癫 痫模型的产生,发展与维持有关.在杏仁核点燃模型 中,NMDARmRNA水平从部分点燃到末次点燃 惊厥发作后4周持续性增加En].放射性配基结合实 验发现点燃惊厥模型中NMDA受体结合点的数量 增加了2.8倍口.采用全细胞膜片钳和单通道记录 技术研究发现点燃动物急性分离的齿状回神经元 NMDA通道的激发电流及平均开放时间增加n. 这些表明NMDARmRNA的表达上调,NMDA受 体的功能增强在惊厥的发生和癫痫易感性的形成过 程中都发挥重要作用. 还有一些研究表明IL一1p能促进癫痫的发 作口.有人报道l1],IL一1p能增强谷氨酸钠的致痫效 果,但若预先给予IL—lra则IL一1p的促痫效应即不 出现.另有报道在体外实验中IL一1p可以提高NM— DARmRNA的表达[2].为了进一步探讨在体状态 下这种促痫效应发生的机制,本文作者向大鼠侧脑 室注射IL一1p后再给予阈下剂量的谷氨酸钠,结果 发现大鼠出现惊厥的行为表现与单纯用致痫剂量的 谷氨酸钠时的结果接近.免疫组织化学研究发现:在 两组致痫大鼠的大脑皮质和海马CA.区NMDAR 免疫反应增强,而预先给予IL—lra或谷氨酸受体的 竞争性拮抗剂D—AP5则动物不出现惊厥发作,NM— DAR免疫反应与生理盐水对照组相比仅表现为大 脑皮质和海马CA.区NMDAR免疫反应阳性细胞 数量的变化不明显.实验表明IL一1p具有促进癫痫 发作的效应,这种效应的发挥是通过IL,1R而实现 的.由于阻断谷氨酸受体后这种促痫效果也不出现, 因此可以认为谷氨酸受体对于IL一1p具有协同作 用,这种受体之间的对话可能通过受体分子间的直 接作用或通过G蛋白偶联实现.同时这种促癫痫效 应发挥与通道型NMDA受体R1亚单位表达的增 加有关.IL一1在体内外均可以促进神经元及胶质细 胞释放谷氨酸,本文作者推测,IL一1p与IL一1R结合 后,一方面促进内源性谷氨酸的释放,另一方面可能 通过与谷氨酸受体的相互作用改变细胞内信使,如 l-Ca]i,cAMP的含量,产生一系列细胞内效应,从 而使NMDA受体的活性增高,发挥促痫作用. (收稿2003—01—06) 参考文献 [1]WangY,RanXZ,ZhangSMetal.Effectofinterleukin一1beta ontheelevationofcytoplasmicfreecalciumofthecultured hippocampalneuronsinducedbyL—glutamate.JTongjiMed Univ,1999;19:120—123 [2]吴希如,单巍松,张国荣.NMDA受体I及白细胞介素一I在 癫痫机制中的作用.北京医科大学,1999;31:194—196 [3]Schultz—KrohnWA.ThompsonJ,HolmesGL.Effectofsys— temicestrogenonseizuresusceptibilityintheimmatureani— rea1.Epilepsia,1986;27:538,541 [42RothwellN,AllanS,ToulmondS.Theroleofinterleukin1in acuteneurodegenerationandstroke:pathophysio1ogica1and therapeuticimplications.JClinInvest,1997;100:2648—2652 [5]GiulianD,YoungDG,WoodwardJeta1.Interleukin一1isan astroglialgrowthfactorinthedevelopingbrain.JNeurosci, 1988;8:709—714 [6]FaganAM,GageFH.Cholinergicsproutinginthehippocam— pus:aproposedroleforIL一1.ExpNeurol,1990;110:105一 [7] 120 RothwellNJ,HopkinsSJ.Cytokinesandthenervoussystem ?:Actionsandmechanismsofaction.TINS,1995;18:130— 136 [8]HopkinsSJ,RothwellNJ.CytokinesandthenervousSystem I:Expressionandrecognition.TINS,1995;18;83—88 [9]DeSimoniMG,PeregoC,RavizzaTeta1.Inflammatorycy— tokinesandrelatedgenesareinducedintherathippocampus bylimbicstatusepilepticus.EurJNeurosci,2000;12:2623— 2633 [10]VezzaniA,MonetaD,ContiMeta1.Powerfulanticonvulsant actionofIL一1receptorantagonistonintracerebralinjection andastrocyticoverexpressioninmice.ProcNat1AcadSci USA,2000;97:11534—11539 [11]KikuchiS,1waseH,SatoT.LastingchangesinNMDAR1 mRNAlevelinvariousregionsofcerebralcortexinepileptoge— nesisofamygdaloidkindledrat.PsychiatryClinNeurosci, 2000;54:573—577 [12]KrausJE,YehGC,BonhausDWeta1.Kindlinginducesthe long——lastingexpressionofanovelpopulationofNMDArecep—. torsinhippocampalregionCA8.JNeurosci,1994;14:4196— 4205 E13]KohrG,DeKoninckY,ModyI.PropertiesofNMDArecep— totchannelsinneuronsacutelyisolatedfromepileptic (kindled)rats.JNeurosci,1993;13:3612—3627 [14]YuhasY,ShulmanL,WeizmanAeta1.Involvementoftumor necrosisfactoralphaandinterleukin—lbetainenhancementof penty1enetetrazo1e—inducedseizurescausedbyShigelladysen— teriae.InfectImmun,1999;67:1455—1460