雌二醇检测方法

雌二醇检测方法 1.1化学检测方法 化学检测方法有光谱法和色谱法。色谱法包括气相色谱法(GC)、气相色谱,质谱联机法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联机法(LC-MS);此外也可以用毛细管电泳法(CE)。 1.1.1气相色谱法(Gas Chromatography，GC)是色谱法的一种，其原理是利用载气载着待分离的样品通过色谱柱中的固定相，根据不同物质在气、固两相中具有不同的分配系数，当两相相对运动时，样品中各组分就在两相中进行反复多次的分配，从而实现不同组分彼此分开;再配以电子捕获检测器、氢火焰离子检测器、电化学仪、质谱仪等仪器来检测。该法具有检测效率高、选择性好、灵敏度高、操作简单、速度快、应用广泛的分析分离方法。 1.1.2高效液相色谱法(HPLC)用液体作为流动相的色谱法，其原理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。HPLC法检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高。但其要 用适宜的填料柱，容量小，流动相消耗大且有毒性的居多。 1.1.3气相色谱-质谱GC-MS 被广泛应用于复杂组分的分离与鉴定，其具有 GC 的高分辨率和质谱的高灵敏度，是生物样品中药物与代谢物定性定量的有效工具。 1.1.4 液相色谱-质谱色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。 1.1.5 毛细管电泳技术(CE)是 20 世纪 80 年代初期在电泳技术的基础上发展起来的一种分离分析技术。它是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。 1.2免疫分析方法 免疫分析(immunoanalysis)是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间高度互补的立体化学、静电、氢键、范德华力和疏水区域的综合作用。免疫分析方法是利用抗原抗体反应的特异性和标记物的信号放大作用进行检测，其突出的优点是操作简单、速度快、分析成本低。此方法具有单独任何一种理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度，非常适合于复杂基质中痕量组分的分离或检测，而且免疫分析技术作为兽药残留分析的检测手段能使分析过程特别是前处理步骤大大简化，可以作为相对独立的快速检测方法。此检测方法检测限已达到 ng 至 pg 水平级,在仪器设备不高的条件下,便可观察和检测到这种结合,所以免疫检测分析法具有极为广阔的应用前景。免疫分析方法，主要分为两大类，一类为相对独立的分析方法，即免疫测定法，如放射免疫法(RIA)，酶联免疫吸附法(ELISA)，免疫传感器等，另一类是将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，如利用免疫分析的高选择性作为理化测定技术的净化手段，如免疫亲和色谱(IAC)。 1.2.1 放射免疫分析法(RIA) RIA是最早建立的经典的免疫分析方法。RIA 技术由免疫反应系统和检测系统两部分组成，以放射性同位素(如125I，32P 和3H 等)作为指示剂(标记物)，然后用γ-射线探测仪或液体闪烁计数器测定γ-射线或β-射线的放射性强弱。60 年代发展的 RIA 技术在灵敏度方面得到了发展，可以检出生物体内 10-6mol/L~10-12mol/L 浓度的超微量有机物。 据 Frank报道放射免疫分析成本低而且结果准确。目前国内某些大医院采用125I 标记 放射免疫测定雌二醇，方法灵敏度高(检测限 1.4pg/ml)。RIA 技术中由于用作指示剂的标记物为放射性同位素，而检测放射性同位素需要昂贵的仪器设备和辐射防护设施，并需要有专门从事放射性工作的实验室和放射性废物处理装置，操作人员的健康常常受放射线照射的威胁。另外，就 RIA 质量而言，尽管目前灵敏度已达 pg/ml 水平，但不可能有太大的改进，因而其发展前景不大。此外，作为 RIA指示剂的某些放射性同位素，由于半衰期短，如32P 只有 14.3 天，33P 只有 25 天，125I只有 60 天，因而限制了 RIA 试剂的时间。 1.2.2 酶免疫测定法(EIA) EIA 是继 RIA 之后发展起来的一项新的免疫学技术。它将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机地结合起来，可对生物体内各种微量有机物的含量进行定量测定，是目前灵敏度高、适应性强、最有希望在生产和临床中推广应用的免疫测定技术。 目前应用最广的是固相EIA 中的酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)。该法不仅诞生较早，而且操作简便，尤其在分离结合物与游离物时，只需几次洗涤就能完成全部分离过程。 E2是半抗原小分子，不具有免疫原性，与载体蛋白偶联，必须通过“化学桥”连接。偶联的位置有很多，如 C3，C6，C7，C11，C16，C17。汪现等(2003) 合成了均未见文献报道的 4 个 17-α雌二醇 3-醚化合物。李晓莉[18]等以β-雌二醇及其 3 位衍生物为原料，制成 17β-对甲苯磺酸酯，经酯解并转位，得到α-雌二醇及其衍生物。偶联位置不同，所得抗体特异性也不同。一般说来，偶联位置离半抗原分子特征部分越远，半抗原与载体蛋白处于相对突出的地位，所得抗体特异性越好。雌二醇的酶联免疫法于 90年代由发达国家开始在临床应用，并正在探索生物素系统的放大免疫探针。金声[等(1994)应用酶联免疫吸附分析法测定了血清中雌二醇，浓度范围为5~160ng/ml(1.8×10-8,5.9×10-7mol/L)检测限为 1.97ng/ml,相当于 98.5pg/孔。近年来所出现的全自动酶标测定分析仪，不但减轻了实验室人员的劳动强度，而且大大提高了测定的准确性和重现性。顾鸣[22]等(2003)应用固相 C18柱分离禽肉组织中的雌二醇，然后使用自动酶联免疫荧光仪(VIDAS)检测分析处理。这些实验充分显示了酶联免疫分析法具有简单、易操作、无污染和检测速度快的特点。 1.2.3 免疫荧光抗体技术 免疫荧光抗体技术(immunofluorescence antibody technique)是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。其中，最常用的是以荧光素标记抗体或抗抗体，用于检测相应的抗原或抗体。该技术最早是由Coons 等于 1941 年建立的。半个多世纪以来，经过许多学者不断改进和发展，使此技术成为微生物学、免疫学、病理学及免疫组织化学中常用的一种免疫学实验方法。王永成等(2002)将 E2的完全抗原与异丙基丙烯酰胺(NIPA)共聚得到抗原-水凝胶高聚物免疫分析(immunoanalysis) 是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间高度互补的立体化学、静电、氢键、范德华力和疏水区域的综合作用。免疫分析方法是利用抗原抗体反应的特异性和标记物的信号放大作用进行检测，其突出的优点是操作简单、速度快、分析成本低。此方法具有单独任何一种理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度，非常适合于复杂基质中痕量组分的分离或检测，而且免疫分析技术作为兽药残留分析的检测手段能使分析过程特别是前处理步骤大大简化，可以作为相对独立的快速检测方法。此检测方法检测限已达到 ng 至 pg 水平级,在仪器设备要求不高的条件下,便可观察和检测到这种结合,所以免疫检测分析法具有极为广阔的应用前景。 残留免疫分析方法，主要分为两大类，一类为相对独立的分析方法，即免疫测定法，如 放射免疫法(RIA)，酶联免疫吸附法(ELISA)，免疫传感器等，另一类是将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，如利用免疫分析的高选择性作为理化测定技术的净化手段，如免疫亲和色谱(IAC)。 1.2.4酶联免疫吸附试验ELISA 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA)是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种酶联免疫技术。此项技术自 70 年代初问世以来，由于 ELISA 具有快速、敏感、简便、易于化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。ELISA 的原理是利用抗原和抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种高敏感性的实验技术。酶标记抗体或抗原可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。当加入底物溶液后，底物可在酶作用下出现颜色反应。由于颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。因此，可通过 ELISA 检测仪对颜色深浅进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使 ELISA 方法成为一种既特异又灵敏的检测方法。