【doc】稀释液中加入低密度脂蛋白对牛冷冻精液的影响

【doc】稀释液中加入低密度脂蛋白对牛冷冻精液的影响 稀释液中加入低密度脂蛋白对牛冷冻精液 的影响 《黑龙江畜牧兽医》科技版2009年4月(上)43 周圣贤,李青旺,胡建宏,张树山,潘巧莲 (1.西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;2.燕山大学环境与化学工程 学院, 河北秦皇岛066004) 中图分类号:$814文献标识码:B文章编号:1004—7034(2009)04-0043-02 研究在传统稀释液的基础上,探索鸽蛋中提 取的低密度脂蛋白(LDL)对牛精液的冷冻效果,以冻 后精子活力,活率,顶体完整性,质膜完整性等作为质 量评定指标,同时分析比较低密度脂蛋白,法国Opti— dyl稀释液冻后精子参数,为牛冻精的基础研究提 供理论依据,对生产中进一步提高牛冻精质量具有重 要的指导作用. 1与方法 1.1LDL的提取 用等渗盐溶液(0.17mol/LNaC1)分别将鸽蛋和 鸡蛋卵黄稀释至2倍体积,并不断搅拌1h,然后在 4?离心(10000g,/rain,45rain),使上清液与沉淀物 分离.再将第2次离心后的上清液与40%的硫酸铵 溶液混合,在4?充分搅拌1h,混合物离心 (10000g/min,45min),使溶液分层.然后将离心 后的沉淀物弃去,上清液用纯化水透析12h.溶液再 次离心(10000g/rain,45rain),所残余的漂浮物即 为低密度脂蛋白. I.2冷冻基础液的配制 基础液配制:果糖1.O0g,柠檬酸1.48g,Tris 2.42g,甘油6.4mL,青霉素钠0.06g,硫酸链霉素 0.1g,然后分别加入鸡蛋低密度脂蛋白8g,鸽蛋低 密度脂蛋白8g,加双蒸水至100mL.另外,利用法 国产的OptidylTM调节浓缩液,按比例将基础液稀释为 冷冻基础液. 1.3精液的收集与处理 在陕西省种公牛站随机抽取2—4岁中国荷斯坦 成年种公牛,用假阴道法采集原精液,鲜精活率, 活力达0.8以上的用于试验. 精液均分成3份,分别用Optidyl稀释液,8%鸡 蛋低密度脂蛋白稀释液,8%鸽蛋低密度脂蛋白稀释 液稀释精子密度至1.2×10.个/mL,将稀释后的精 液放入盛有37c【=温水的大烧杯中,置于4cC冰箱平 衡1.5h,然后在4?下装入0.25mL的细管平衡 收稿日期:2008—10—31 作者简介:周圣贤(1982一),男,硕士研究生. 通讯作者:李青旺(1956一),男,教授,本科,博士生导师 2h,再将细管放置距液氮4om(一120?)上方熏蒸 10min,最后投入液氮(一196oC)进行保存. 1.4精子活率检测 利用计算机辅助精子分析系统对精子活率进行 评估,每个样品均取3个细管用37c【=温水解冻45s, 然后混合置于1mL离心管,在37?孵育10rain,取 5随机分析5个视野下的100,150个精子运动 参数:活率,曲线运动速度(VCL,单位n/s),直线运 动速度(VSL,单位txm/s),线性指数(LIN,LIN= VCL/VSL×100),头侧摆幅度(ALH,单位m),平 均路径速度(VAP,单位i~m/s). 1.5精子顶体完整率测定 利用FITC—PNA进行染色,在400×荧光显微镜 下观察.因FITC—PNA可与精子顶体膜上的受体特 异结合,在激发波长480am,发射波长530nm的紫 外光激发下可区分出4种不同类型的精子:1)顶体 顶部发强光,为顶体完整精子;2)顶体前杂乱发光, 为顶体部分破坏精子;3)仅在赤道区有荧光,为顶体 前帽缺失精子;4)无荧光,为顶体完全破坏精子.每 次至少数200个精子,重复5次以上. 1.6精子质膜完整性测定 解冻冷冻精子后,利用低渗膨胀法(HOST)测定 精子质膜完整性.精液用精子低渗液(37oC)孵育 30min,混匀,400×显微镜下观察,计算弯尾精子百 分率.每次至少数200个精子,重复5次以上. 1.7统计分析 采用SPSS软件进行方差分析和t检验处理数据. 2结果与分析 2.1精子活力测定结果(见1) 2.2顶体完整性测定结果(见表2) 2.3精子质膜完整性测定结果(见表3) 3讨论与结论 3.1精子活率 方差分析结果表明,8%鸽蛋低密度脂蛋白稀释 液冻后精子活率显着高于法国OptidylTM稀释液中的 冻后精子活率(P<0.05).稀释液在构成成分上不 同:法国Optidyl稀释液包含20%鸡蛋卵黄,而鸡 蛋卵黄包含50%干燥物质,在干燥物质中66%是低 HeilongjiangAnimalScience andVeterinaryMedicineNo42009 表1不同稀释液对精子运动参数的影响 注:同行数据肩标字母相邻表示差异显着(P<0.05),字母相间 表示差异极显着(P<0.01). 表2不同稀释液对精子顶体完整性的影响 表3不同稀释液对精子质膜完整性的影响 密度脂蛋白.这意味着法国Optidyl稀释液中自然 地包含6%,7%低密度脂蛋白,相当于用到了低密 度脂蛋白稀释剂的量.这一结果和MoussaM等比 较鸡蛋低密度脂蛋白稀释液和Optidyl?稀释液获得 的结果基本一致,他们还提出卵黄可能包含减少精液 能动性的一些有害组分. 3.2精子顶体完整性和质膜完整性 精子在雌性动物生殖道获能才具有受精能力,精 子与透明带结合促使其发生顶体反应(AR),使顶体 膜与精子质膜融合在一起.在受精过程中,胞吐这一 生理学现象导致水解酶释放,使精子顶体膜溶解. 射精后若精子顶体受到损伤则无法与卵母细胞结合, 导致精子无法使卵母细胞受精.因此,顶体完整率是 评价精子品质和受精能力的一个重要参量. 评估顶体的状态可根据许多外源凝集素和顶体 膜上相互作用的糖蛋白质,它们包括花生凝集素 (PNA),刀豆蛋白A(ConA),豌豆凝集素(PSA)和蓖 麻凝集素(RCA).目前,常使用异硫氰酸荧光素连 接的花生凝集素(PITC—PNA)检测.这些外源凝集 素显示,一D一葡萄糖基末端和糖蛋白类的一 D一氨基酸残基是哺乳动物顶体质膜的主要成分. 顶体完整性是细胞功能的一个重要标志.从微观(通 过荧光图像法)看,多数精子在低密度脂蛋白稀释剂 里冷冻稀释后,在精子顶体区域显示了一个绿色荧 光,这荧光预示了顶体的状态.最初精子低渗膨 胀试验(HOST)是用于调查人的精子质膜完整性,其 根据是低渗透压的溶液中精子的尾部会弯曲胀大,当 低渗溶液进入精细胞时为了维持渗透压平衡,质膜完 整的精子会发生顶体膨胀,尾部呈现不同程度的弯 曲J,死精细胞膜丧失通透性,形态没有明显变化, 这一结果可借助普通光学显微镜进行观察,而且通过 光学显微镜观察单个精子的尾部弯曲比观察头部更 容易,因为尾部的精子质膜比头部质膜更加容易松弛 变形.质膜损坏的精子不发生顶体膨胀,并且尾巴也 不发生膨胀或卷曲.而HOST检验作为公牛体外生 育力的一个有预测性的工具却未被广泛应用. 由于不同种细胞特性与膜弹性,最大膨胀容量, 水渗透性,细胞形态有关,因此在低温冷冻保存程序 以及相近的程序中,从鸽蛋中提取的低密度脂蛋白明 显提高了牛冻后精子活率,而低密度脂蛋白没有比 Optidyl更多地介入顶体损伤和质膜损伤保护,相关 机理有待进一步研究. 参考文献: 【1]MOUSSAM,MARTINETV,TRIMECHA,eta1.Lowdensitylip- oproteinsextractedfromheneggyolkbyaneasymethod:cryopm— tectiveeffectonfrozen—thawedbullsemen[J].Theriogenology 2002,57:695—706. [2]李青旺.动物繁殖学[M].西安:西安地图出版社,2000. [3]HOSSAINAM,RIZKB,BARIKS,eta1.Timecourseofhypo— osmoticswellingsofhumanspermatozoa:evidenceoforderedtransi- tionbetweenswellingsubtypes『J].HumReprod1998,13:78一 (010)