N型钙通道在大鼠福尔马林内脏炎症痛中的作用研究

N型钙通道在大鼠福尔马林内脏炎症痛中的作用研究 N型钙通道在大鼠福尔马林内脏炎症痛中 的作用研究 ? 230?ChineseJournaIofPainMedicine2008.14.f4 N型钙通道在大鼠福尔马林内脏 炎症痛中的作用研究 张颜波牛敬忠王轩杨明峰孙保亮 (泰山医学院附属医院神经内科,泰安271000) 摘要目的:观察N型钙通道在福尔马林诱导的内脏炎症痛中的作用.方法:选用成年健康Wistar 大鼠,随机分5组:正常对照组(N);单纯福尔马林直肠致炎组(F);脊髓蛛网膜下腔插管组(IT), 插管内注射生理盐水组(NaC1);插管内注射SNX一111组(SNX.1l1).记录实验组大鼠的疼痛行为 反应,致痛后以15rain为一个时间段,共记录8个时间段,计2h,分别计算疼痛分数;福尔马林致 痛后30min用原子吸收光谱分析和La?阻断技术测定L一s阶段脊髓细胞内Ca含量.结果: F,IT组与NaC1组8个时间段内疼痛分数无显着性差异(P>0.05);IT组与F组相比也无明显差异 (P>0.05);SNX一111组与NaC1组在致痛后75min内疼痛分数明显减少(P<0.01或P<0.05). F,IT组与NaC1组在福尔马林致痛后30min脊髓细胞内Ca含量无明显变化(P>0.05);IT组与 F组相比也无明显差异(P>0.05);SNX一111组与NaC1组相比Ca"含量明显减少(P<0.01).结 论:SNX一111能明显减轻福尔马林内脏炎症痛行为反应,降低脊髓内ca含量,提 示N型钙通道可 能在福尔马林致内脏炎症痛感受中起重要作用. 关键词N型钙离子通道;SNX一111;福尔马林;内脏;疼痛 THEROLEOFN?TYPECALCIUMCHANELIVlSCERALIN'LAMMArl'ORYPAININ - DUCEDBYFoRMALIN ZHANGYan-Bo,NIUJing—Zhong,WANGXuan,YANGMing—Feng,SUNBao— Liang (DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofTaiShanMedicalCollege,Taian271000) AbstractObjective:ToexaminetheroleofN— typecalciumchannelinvisceralinflammatorypainin— ducedbyformalin.Methods:AdulthealthyWistarratsweredividedinto5groupsrandomly:normal group(N);groupF:onlyinjectedofformalininthesubmucosaofrectum;groupIT:intrathecalinsertion ofaPE-10tube;groupNaC1:intrathecalinjectionof0.9%NaC1;groupSNX一 111:intrathecalinjection ofSNX一 111.Thenumericalscoreforpainbehaviorswasrecordedevery15minutesfor2hours.Pain scoreswerecountedrespectively.TheintracellularcalciumcontentsofL6一 S12segmentsofthespinalat 30mintimepointafterformalininjectionwereexaminedbythetechniqueofatomicabsorptionspectecto— mywithLa?blockage. Results:Therewasnosignificantdiffferenceofpainscoresin8timepointsbe— tweengroupForITandgroupNaC1(P>0.05);andbetweengroupITandgroupF(P>0.05);pain scoresofgroupSNX一 111wasdecreasedsignificantlyintheformer75minutesthanthatofgroupNaC1(P <0.05orP<0.01.Therewasnosignificantdifferenceoftheintracellularcalciumcontent sat30min timepointafterformalininjectionbetweengroupForITandgroupNaC1(P>0.05);andbet weengroup ITandgroupF(P>0.05);theintracellularcalciumcontentsofgroupSNX一 111weredecreasedsignifi— cantlythanthatofgroupNaC1(P<0.01).Conclusion:SNX-111cansignificantlyalleviate thereaction 0fvisceralinflammationinducedbyformalinanddecreasetheintracellularcalciumcontents .Whichindi— catesthatN— typecalciumchannelmayplayanimportantroleinnociceptionofvisceralinflammationin— ducedbyformalin. KeywordsN—typecalciumchannel;SNX一111;Formalin;Viscera;Pain 中国疼痛医学杂志ChineseJournalofPainMedicine2008,14,(4 内脏痛是目前临床上一个普遍存在的问,具 有急性,慢性和复发性多种表现形式,是一个复杂的 病理生理过程.其疼痛定位不清晰,描述欠清晰,给 临床上内脏痛的诊断及治疗带来了很大困难.所以 内脏痛发生,发展机制的研究正日益受到重视,对内 脏痛的信号转导方面的探索显得尤为重要?".细 胞内游离Ca?浓度的改变是细胞生理功能的重要 物质基础,也是多种受体激动后信号传递过程的中 心环节,故钙通道在疼痛中的作用是目前研究的热 点之一,高阈值型(N型)钙通道在内脏炎症痛的作 用还尚不清楚L5J.本研究拟通过脊髓蛛网膜下腔 插管内注射N型钙通道高敏感抑制剂SNX一111.., 用疼痛评分和—S阶段脊髓细胞内ca?含量 观察其对内脏炎症痛的影响. 材料与方法 1.试剂与材料 SNX一111,La?(Sigma公司),福尔马林(Forma. 1in,北京西中化工厂),PE一10管(ID:0.28mm;OD: 0.61mm,BectonDickinson公司)o 2.实验动物 选用成年健康Wistar大鼠,体重200,250g,雌 雄不拘(由山东大学动物中心提供). 3.实验方法 (1)实验分组:实验随机分5组:正常对照组 (N);单纯福尔马林直肠致炎组(F);福尔马林+脊 髓蛛网膜下腔插管组(IT),福尔马林+插管内注射 生理盐水组(NaCI);福尔马林+插管内注射SNX一 111组(SNX-111),每组大鼠l2只. (2)脊髓蛛网膜下腔内插管及给药:参照文献2 , 4行脊髓蛛网膜下腔内插管_2J.本实验中 NaCI,SNX一1112个组,分别在福尔马林直肠致炎前 30rain经PE一10插管注射20l0.9%NaC1,20l SNX一111溶液(0.2g/Kg),然后注入10ixl0.9% NaCI冲洗插管,保证注射药品全部进入蛛网膜下 腔. (3)福尔马林直肠内致炎及行为观察:参照文 献2,3行福尔马林直肠内致炎及行为不观察.记录 大鼠各种行为反应的次数,每15rain为一个时间 段,共记录2h,8个时间段. (4)L6一S.阶段脊髓取材及细胞内Ca含量 测定:福尔马林致痛后30rain,37?含【丑?50mM 的生理盐水行主动脉灌注后取出L,s阶段脊 髓_3J,置入37~CLa?溶液温育20min,置70~C, 80~C烤箱,烘干72h至恒重(1天称重l一2次,数值 相差<0.1mg为止),称重后加入浓硝酸和高氯酸 各1ml,常温消化48h后,置于80?,IO0~C烤箱蒸 发12小时,再放入500~C石棉炉使样木无机化. 1%La?,0.INHCI适当稀释后离心(15000转/分, 10rain),取上清液,用原子吸收分光光度计测定脊 髓细胞内Ca"浓度. 4.内脏痛行为指标及评分 本工作采用Marcel(1994)所用的一系列能够 反应内脏痛强度的行为指标J,按照疼痛由低到高 的顺序分别是:(1)腹部舔食和轻咬(L);(2)伸展 身体,特别是后肢向后伸展(B);(3)腹部收缩,侧 扭,有时身体发展成伸展姿势(c);(4)全身收缩,后 背扭曲站立,并通常伴腹部痉挛(W).根据此疼痛 程度依次评分为:L为1分;B为2分;C为3分;w 为4分,每15rain进行一次疼痛计分(s),其公式是 S=1L+2B+3c+4W,其中,L,B,c,w分别代表l5 min内记录到的各种行为反应的次数. 5.数据处理及统计学检验 实验组均以15rain共8个时间段分别记录疼 痛反应.脊髓细胞内ca含量计算公式:ca含量 (g/g干重)=测溶液Ca浓度/样本干重×稀释 倍数.实验结果以均数?标准差(X?S)表示.数 据间差异用SPSS10.0软件包中的单因素方差分析 (ANOVA)处理,显着性水平P<0.05. 结果 福尔马林直肠粘膜下注射致炎后,在乙醚麻醉 恢复后大鼠立即会出现内脏疼痛的行为反应,前60 rain内行为表现主要以W,C,B反应为主;而在后 60rain内主要以L反应为主.分别对实验组8个时 间段内大鼠疼痛分数进行统计计算,实验组大鼠在 注射福尔马林后30rain均达到疼痛评分的的最大 值,从注射福尔马林后45rain至120rain内,疼痛评 分逐渐降低.F,IT组与NaC1组8个时间段内疼痛 分数无显着性差异(P>0.05);IT组与F组相比也 无明显差异(P>0.05);SNX一111组与NaC1组相 比,在前75rain内疼痛分数明显减少(P<0.01或P <0.05),见图1.F,IT,NaC1和SNX一111组分别与 N组相比,在福尔马林致痛后30rain脊髓内细胞 ca"含量明显增加(P<0.O1),F,IT组分别与NaC1 组相比无明显变化(P>0.05);IT组与F组相比也 无明显差异(P>0.05);SNX一111组与NaCI组相比 Ca"含量明显减少(P<0.O1,见表1). 图14组各时段疼痛分数比较 Fig.1Comparisonofpainscoresatdifferenttimepointsinfourgroups :P<0.05,一:P<0.01VSgroupNaC1 表15组脊髓细胞内Ca"含量比较 Table1ComparisonofCacontentsinspinalcellsin avegroups 分组Ca含量(g干重) groupCa"contents(g/gdrywt) 正常对照组 N 福尔马林直肠致炎组 F 脊髓蛛网膜下腔插管组 IT 插管内注射生理盐水组 NaCI 插管内注射SNX?111组 SNX一1】】 讨论 N型钙通道作为一种电压依赖性钙通道(Volt- age.dependentcalciumchannels,VDCC),主要分布于 疼痛传递与调控通路的神经元突触末梢,在感觉传 人的第一级神经元DRG及伤害性信息传人的门户 和整合的初级中枢DH上有大量分布,而且主要分 布于神经元突触部位,主要作用是调控去极化诱导 的Cah内流,是Ca"内流的主要途径之一.Ca"内 流可以触发细胞内ca依赖的一系列生理反应,包 括神经元兴奋性的调节,神经递质释放,激活第二信 使和基因转录等【.近年来,以离子通道为靶标的 镇痛药物的研究成为了一个新的亮点,其中N型电 压依赖性钙通道阻断剂作为一种新型的镇痛药物倍 受关注.较其它钙通道具有明显优势,如:e/Q型则 只在部分疼痛模型或者模型的某一阶段有作用,L 型钙离子通道阻断剂更是会有心血管方面的副作 用].从致幻芋螺(Conusmagus)中分离出的O超 家族【1)一CTXMVIIA即合成品名SNX-I1I,能特异性 的阻断N型钙通道,具有较强的镇痛作用,且不会 中国疼痛医学杂志ChineseJournalofPainMedicine2008.14.(4 产生耐受性和依赖性的特点-o. 但目前N型钙通道在疼痛中的研究多局限于 外周神经病理痛或躯体痛方面],在内脏炎症痛的 作用还尚不清楚,所以本实验通过脊髓蛛网膜下腔 插管内注射N型钙通道高敏感抑制剂SNX.111,用 疼痛评分和IJ6,S阶段脊髓细胞内Ca?含量观 察其对内脏炎症痛的影响,探索其在内脏炎症痛中 的作用.实验采用蛛网膜下腔插管内一次性给药的 方式,研究发现SNX一111能明显减少大鼠内脏炎症 痛的疼痛反应,并未出现SNX-111的副作用,如:大 鼠身体震颤等;且蛛网膜下腔插管并不影响疼痛评 分,使SNX.111更易通过血脑屏障,解决了药物吸 收的问题.在行为学实验的基础上,对福尔马林直 肠黏膜内注射引起的内脏炎症痛相应IJ6一s阶段 脊髓Ca"含量测定发现,SNX一111组大鼠脊髓细胞 内ca"含量明显降低,以上结果表明,N型钙通道 可能在福尔马林致内脏炎症痛感受中起重要作用, 控制疼痛脊髓中枢的Ca?内流是其作用途径之一. 参考文献 1王锦琰译.内脏痛.中国疼痛医学杂志,2006, 12:130,131. 2张颜波,李菁锦,吕国蔚.蛋白激酶C对福尔马 林诱导急性炎症疼痛评分的影响.中国疼痛医 学杂志,2004,10:33,36. 3张颜波,高翠英,李菁锦,等.大鼠福尔马林内脏 炎症痛过程中脊髓PKC,PKCs膜转位的变化. 中国疼痛医学杂志,2005,11:91,95. 4周卫华,李菁锦.蛋白激酶C对内脏炎症痛模型 大鼠脊髓背角神经元电活动的影响.中国疼痛 医学杂志,2005,11:287,293. 5陈志新,曾因明,王俊科,等.T型钙通道在大鼠 神经病理性疼痛维持中的作用.中华麻醉学杂 志,2006,26:68,70. 6BowersoxS,MandemaJ,Tarczy—HornochK,eta1. 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