人α防御素3前体蛋白对克雷伯菌和大肠杆菌的杀菌作用

人α防御素3前体蛋白对克雷伯菌和大肠杆菌的杀菌作用 人α防御素3前体蛋白对克雷伯菌和大肠杆 菌的杀菌作用 中国组织工程研究与临床康复第11卷第船期2007—09—23出版 — J— oumalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearchSeptember23,2007Vo1.11.No.38 基础医学 人OL防御素3前体蛋白对克雷伯菌和大肠杆菌的杀菌作用?? 周立强',辜臻晟,张毅,,刘建华, Antibacterialroleofhumanalpha--defensin--3proproteininKlebsiellapneumoniaeand Escherichiacoli Abstract A:Tostudytheantibacterialeffectofhumanddefensin-3proproteinonKlebsie//apneumoniaeandEschench~cD肛 soastoprovidereferencesforthestudyontheantibacteriaImechanismofdefensin. M匝 TH0DS:TheexperimentwasperformedatLiuJian-hua'slaboratoryofLifeScienceandTechnologyCollege ShanghaiJiaoTongUniversityfr0mNovember2005toSe}ptember2006.Thegenescodinghumanddefensin.3 proproteinsequencewereclonedtovectorpDEST17.andtheresultingvectorsweretransformedintoEco//DE3cells. Thehumanddefensin-3proproteinswereobtainedthroughinduction/nvitroandaffinitychromatographypurification. TheantibacterialactivityoftheproproteinwasanalyzedaccordingtotheproportionofsurvivedKlebsie//apneumon~e andEscherichiaco//underproproteinatdifferentconcentrationsandthelethaldosesofddefensin.3proproteins inducing50%.90%and99%microbiaIlethality. 砌ULTS:? Approximately12mgpurifiedfusionproteinswereobtainedfrom1Lculturemediumwiththerenaturing rateof15%to20%.(ThesurvivalratesofKlebsie//apneumon~ewere50%.33%, 10%and4%under5.10.15and 30mg,Lproteins;theratesofEschenchiaco//were50%,10%.5%and1%under10.20.30and45mg/Lproteins.? Theconcentrationsofrecombinantproteinsresultingin50%and99%microbiaIlethalityforKlebsie//apneumoniaewere 5and35mg/Lrespectively.whilethoseforE.coliDH5dwere10and45mg/L. CONCLUS10N:Recombinantandpurifiedhumanddefensin-3proproteincouldkillbothKlebsiellapneumoniaeand Eschenchiaco//DH5defficiently. ZhouLQ?GuZS.ZhangY,LiuJH.Antibacterialroleofhumanalpha-defensin.3proproteininKlebsiellapneumoniaeandEscherichiacoli. ZhongguoZuzhiGongchengYanjiuyuLinchuangKangfu2007;11(38):7643-7646(China) [www.zglckf.comlzglckflejoumallupfileslO7-38138k-7643(ps).pdq 摘要 目的:分析a防御素3前体蛋白对于克雷伯菌和大肠杆菌的杀菌效果,为进一步研 究人类a防御素3的杀菌机制提供依 据. 方法:实验于2005—11/2006—09在上海交通大学生命科学技术学院刘建华实验 室完成.将d防御素3前体的编码基因克隆到 载体pDEST17中,载体转化人大肠杆菌DE3细胞,通过体外诱导及亲和纯化的方 法获得d防御素3前体蛋白.根据在不同 蛋白浓度下生存下来大肠杆菌和克雷伯菌所占的比例以及导致50%,90%和99% 细菌死亡(LD50,LD90和LD99)时人d防 御素3前体蛋白浓度来判断前体蛋白的杀菌作用. 结果:?在1L培养基培养条件下,可获得纯化后d防御素3前体蛋白12mg,复性效率为15%-20%.(蛋白浓度为5,10, 15和30mg/L时,克雷伯菌存活率分别为50%,33%,10%和4%.蛋白浓度为10,20,30和45mg/L时,大肠杆菌存活率分别 为50%,10%,5%和1%.(克雷伯菌50%和99%致死率的蛋白质浓度为5和35mg/L.大肠杆菌50%和99%致死率的蛋白 质浓度为10mg/L和45mg/L. 结论:重组纯化的人d防御素3前体蛋白具有有效杀灭大肠杆菌和克雷伯菌的作用. 关键词:人d防御素3前体;杀菌作用;克雷伯菌;大肠杆菌 周立强,辜臻晟,张毅.刘建华.人防御素3前体蛋白对克雷伯菌和大肠杆菌的杀菌作用【J】.中国组织工程研究与临床康复,2007.11(38) 7643-7646[www.zglckf.comlzglckflejoumallupfilesl07-38/38k-7643(ps).pdq 0引言 防御素是一类长度为29-54个氨基酸组 成的多肽,富含带正电荷的精氨酸,并有3对 分子内二硫键.它对革兰氏阳性菌,革兰氏阴 性菌,真'】及包被病毒【】都具有杀伤作用.根 据氨基酸组成,二硫键位置和连接方式,人们 将防御素分为3类,即ot防御素,13防御素和 O防御素【.人防御素在人体多种器官和组织 中广泛存在,如皮肤【引,黏膜,呼吸道【引,泌尿生 殖道上皮组织以及嗜中性细胞等,发挥重要的 沈阳1200邮政信箱110004kf23385083@sina.commM?.zglckf.com 屏障防御作用.人Ot防御素1—4是一类存在 于中性粒细胞中的阳离子多肽,又称人中性粒 细胞肽,具有强烈的,广谱的杀灭病原微生物 的作用【引.人Ot防御素3含有30个氨基酸,内 有6个的保守半胱氨酸分别结合形成1—6, 2-4,3—5相连的三个二硫键,从而构成三条反 向平行的13一片层结构【.其中人ot防御素1 和人ot防御素3的氨基酸序列基本一致,仅在 N端的第一个氨基酸有所区别,而人ot防御素 2与前两个多肽相比少了1个N端氨基酸,其 余部分完全相.人Or.防御素4则是由35 个氨基酸组成,它同人Or.防御素1—3的氨基 'CollegeofLife Scienceand Technology,Shanghai JiaoTongUniversity, Shanghai200030, China;ZDepartmentof Ophthalmology. XinhuaHospffal. MediceICollegeof ShanghaiJiaoTong University,Shanghai 200092,China ZhouLi-qiang? Studyingformasters degree.Collegeof LifeScienceand Technology.Shanghai JiaoTongUniversity. Shanghai200030, China GUZhen.sheng? Studyingfor doctorate,Associate chiefphysician, Associateprofessor. Departmentof Ophthalmology, XinhuaHospita1. MediceICollegeof ShanghaiJiaoTong University.Shanghai 200092.China poohgu@hotmailcom Correspondenceto: LiuJian-hua. Professor.TutorOf doctor,CollegeofLife Scienceand Technology,Shanghai? JiaoTongUniversity, Shanghai200030, China jhliu@sjtueducn Received:2006-11-06 Acce}pted:2007-01-23 7643 '上海交通大学生命 科学技术学院,上海 市200030;上海 交通大学医学院附 属新华医院眼科.上 海市200092 周立强?.男,1981 年生.安徽省合肥市 人,汉族,上海交通 大学生命科学技术 学院生物化学与分 子生物学专业在读 硕士,主要从事蛋白 表达与功能研究. Iqzhou@sjtu.edu.cn 辜臻晟?,男,1968 年生.上海市人.汉 族.上海交通大学医 学院在读博士,副主 任医师.副教授.主 要从事白内障及眼 表疾病的防治研究 工作. poohgu@hotmailcom 周立强,辜臻晟为并 列第一作者 通讯作者:刘建华, 教授,博士生导师, 上海交通大学生命 科学技术学院.上海 市200030 jhliu@sjtueducrl 中图分类号:R574.6 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2007)38-07643-04 收稿日期:2006-11-06 修回日期:2007-01?23 (06-50-11-8622/M-A) 漂题背景国内 报道大肠杆茵重 组表达的Or.防御 素3对金黄色葡 萄球茵具有良好 抑茵作用.各型 成熟的人防御素 蛋白相继在各类 细胞中成功表 达.但是表达和 复性效率普遍较 低.仅能通过 ELISA或者 WesfemBlotting 才能检测出来, 因而无法用于大 规模的生产.究 其原因,是由于 成熟的防御素蛋 白对于大肠杆茵 具有毒性.目前 解决的方法有两 种.其一是使用 融合表达的策 略.用化学切割 的方法将融合蛋 白切割开,其二 是使用无细胞的 蛋白表达系统. 7644 ISSN1673.8225CN21.1539/R 周立强,等.人防御素3前体蛋白对克雷伯菌和大肠杆菌的杀菌作用 ww~zglckfcomkf23385083@sina,corn 酸序列同源性的较低,仅为32%【8】. 人仅防御素3的前体蛋白由94个氨基酸 组成,其中第1,19个氨基酸残基构成信号肽, 能够引导其插入内质网中,然后经过进一步修 饰和剪切构成由30个氨基酸组成的成熟人仅 防御素3【3】.一般认为,成熟的仅防御素3具 有杀菌作用,而前体蛋白由于自身氨基酸所 带电荷的中和作用,因而不具有明显的杀菌 效果【9l伯】.本文观察仅防御素3前体蛋白对于 克雷伯菌和大肠杆菌的杀菌效果,探讨防御素 抗菌机制. 1材料和方法 :开放性实验. 单位:上海交通大学生物技术系实验室. 材料:实验于2005—11/2006—09在上海 交通大学生命科学技术学院刘建华实验室完 成.寡核苷酸引物由上海申能博彩生物技术有 限公司合成.RNA抽提试剂盒和RT-PCR扩 增试剂盒购自上海申能博彩生物技术有限公 司.Gateway克隆试剂盒是美国Invitrogen生 物技术公司的产品.大肠杆菌菌株BL21(DE3) 和Ni—NTAHis.Bind树脂购自Novagen公司. 大肠杆菌菌株DH5o~和克雷伯菌株(K. pneumoniae)为本实验室保存.蛋白质分子量 标准品(SM0441)购自Fermentas公司.其他 化学试剂都为分析纯级别. 设计,实施,评估者:研究设计为第一作 者,实施干预为全部作者,评估为第四作者. 方法: pDEST17一HNP一3前体蛋白表达质粒的 构建:按照公司提供的操作手册,从人体白细 胞中提取总RNA,利用反转录一PCR(Reverse transcription—PCR,RT—PCR)方法获得HNP-3 前体的编码DNA,上下游引物序列分别为 5'.GGTGGCCCTGCAGGCCCAGGC T.3.和5'.ATAGCAATTCCCTGTAGC TCTC3..根据公司提供的操作手册,设计 gateway所需引物序列分别是上游引物 5..ACAAGTTTGTACAAAAAAGCA GGCTGAGCCACTCCAGGCAAGAGC TG一3.和下游引物5.一垒!工工工垒垒 AGAAAGCTGGGTTGCAGCAGAATG CCCAGAGTC一3.(下划线部分序列用于后 续的DNA重组反应),PCR扩增HNP一3前体 的编码DNA,将其克隆到质粒pDEST17中, 构建成表达质粒pDEST17一HNP一3.DNA测 序证明表达质粒序列和翻译的阅读框架正 确. 人仅防御素3前体的制备: 表达:将构建后的载体转化到大肠杆菌 BL21(DE3),在含有100mg/L氨苄青霉素的 LB平板上过夜培养,挑取单克隆.在37?条 件,将挑取后的菌株培养至,4600=0.6,0.8,加入 异丙基硫代一13一D一半乳糖苷(IPTG)到终浓度 为1mm0I,L后继续培养6h. 纯化:4?,8000r/min离心15min收集 菌体,加入裂解缓冲液(100mm0I,LNaH2PO4, 10mm0I,LTris-HCI,6mol/L盐酸胍,pH8.0) 进行裂解.裂解之后将裂解液在室温下以 12000r/min的速度离心45min,收集上清液 加入装有N..NTA树脂的柱子(含有3mL的 树脂,2.5cm高)进行亲和纯化.N..NTA树脂 预先需要用裂解缓冲液进行平衡.装有N_.NTA 树脂的柱子经过洗涤缓冲液(100mm0I,L NaH2PO4,10mm0I,LTris—HCI8mol/L尿 素,pH6.3)洗涤,直到洗涤液的.0值小于 0.001,再用洗脱缓冲液(100mm0I,L NaH2PO4,10mm0I,LTris—HCI,pH6.3,8mol/L 尿素和400mm0I,L咪唑)洗脱目标蛋白.洗脱 时的流速为12mUh. 复性:将变性纯化后收集到的目标蛋白合 并,并用洗脱缓冲液将蛋白浓度稀释成2g/L. 装入最大透过M8000的透析袋中,用缓冲 液1(20mm0I,LTris-HCI,pH8.0,50mm0I,L NaCI,1mm0I,LEDTA,5mm0I,L13一巯基乙 醇,8mol/L尿素)在4?透析,除去咪唑. 然后往透析过的液体中缓慢加入缓冲液2 (20mm0I,LTris—HCI,pH8.0,50mm0I,L NaCI,1mm0I,LEDTA,5mm0I,L13一巯基乙 醇),直到蛋白溶液中的尿素浓度为0.5mol/L, 再装入透析袋中,用缓冲液2进行透析,除去 尿素.蛋白浓度以小牛血清Bradford标准曲 线法定量,蛋白分子量和纯度以SDS—PAGE 蛋白电泳鉴定.然后,用Heto—Drywinner (Heto—Holten,丹麦)冷冻干燥透析后的蛋白溶 液得到冻干粉,一20?保存备用.使用前将蛋 白溶解到溶液(20mm0I,LTris—HCI,pH8.0, 10mm0I,LNaCI,10%甘油)中,终浓度为 500mg/L. 杀菌实验:在37?条件下将大肠杆菌和 P.O.Box1200.Shenyang110004kf23385083@sina.comwwwzglckf.com ISSN1673.8225CN21.1539/R vvwvzzglckf.comkf23385083@sinacorn周立强,等.人防御素3前体蛋白对克雷伯 菌和大肠杆菌的杀菌作用 克雷伯菌振荡培养到A0o=0.4,0.5,利用无菌 水稀释到A0o=0.1(1×10们CFU/L).取菌液 10L,在0-100mg/L范围内分别以5mg/L 和10mg/L递增使用不同浓度的人防御素 3前体蛋白,利用无菌水定容至100L.37? 水浴1h后,取10L反应液涂LB平板, 37?过夜培养后,计数平板上形成的菌落数. 主要观察指标:根据在不同蛋白浓度下生 存下来细菌所占的比例以及导致50%,90%和 99%细菌死亡(LD50,LD90和LD99)时人 防御素3前体蛋白浓度来判断前体蛋白的杀 菌作用. 2结果 2.1人防御素3前体蛋白的纯化将亲和 层析纯化到的蛋白质进行蛋白质电泳,结果表 明在15%的SDS-PAGE中纯化到的人防 御素3前体蛋白的分子量大概是M10000 (见图1),这与利用氨基酸计算出的分子量相 一 致.其中在每升LB培养基可以纯化到约 12mg的人防御素3前体蛋白,复性效率为 15%-20% M M 117000 85000 49o00 340o0 250o0 19000 M:ma~er;1:纯化后的人q防御黍3前体篮臼 图115%的SDS-PAGE分析纯化后的人d防御素3 前体蛋白 2.2人防御素3前体蛋白的杀菌作用分 别观察人防御素3前体蛋白对于大肠杆菌 DH5o~和克雷伯菌的杀菌效果,实验结果如表 1和图2所示.对于大肠杆菌DH5o~,蛋白浓度 为10,20,30和45mg/L时,细菌存活率分别 为50%,10%,5%和1%;而对于克雷伯菌,蛋 白浓度为5,10,15和30mg/L时,细菌存活 率分别为50%,33%,10%和4%(见图2).该 结果和已发表的成熟人防御素3蛋白的杀 菌作用没有数量级差异【1. 沈阳1200邮政信箱110004kf23385083@sina.comwwwzglckfcom 1020304050 C(人防御素3前体蛋白)/mg?L. 图2人d防御素3前体蛋白对于大肠杆菌DH5仅和克 雷伯菌杀菌作用曲线 3讨论 自1993年首次报道在大肠杆菌表达系统 中获得重组蛋白防御素1【1】以来,2004年 在转染的COS-7细胞中重组表达了防御素 3【他】,国内也有报道在大肠杆菌重组表达的 防御素3对金黄色葡萄球菌具有良好抑菌作 用】.各型成熟的人防御素蛋白相继在各类细 胞中成功表达,但是表达和复性效率普遍较 低,仅能通过ELISA或者WesternBlotting才 能检测出来,因而无法用于大规模的生产.究 其原因,是由于成熟的防御素蛋白对于大肠杆 菌具有毒性.目前解决的方法有两种,其一是 使用融合表达的策略,用化学切割的方法将融 合蛋白切割开…】,其二是使用无细胞的蛋白表 达系统【15】.而在本实验中,诱导表达的人防 御素3前体蛋白多呈折迭不正确的包涵体, 对表达宿主没有毒性,所以产量高.而在复性 过程中,由于前体片段(propiece)X~于蛋白的 正确折叠具有促进作用,因此复性的效率较 高【16]. 成熟的防御素一般带有2个或两个以上 的正电性,可以与带负电的细菌外膜,如革兰 氏阴性菌的脂多糖,革兰氏阳性菌的多聚糖 和磷壁(酸)质良好结合,然后竞争性地替代 脂多糖和多聚糖分子之间起桥连作用的Ca 或Mg等二价阳离子.通过在外膜上形成大 量由抗菌肽分子积聚而成的多聚孔,从而造 成膜的通透性大大增强,防御素经这些多聚 应用要点:文章 克隆的基因序列 是人d防御素3 前体,诱导表达的 人d防御素3前 体蛋白多呈折迭 不正确的包涵体 形式,对表达宿主 没有毒性,所以产 量高.而且,试验 采用蛋白稀释复 性,由于前体片段 对于蛋白的正确 折叠具有促进作 用,复性的效率相 对较高.通过对 前体蛋白的杀菌 实验的研究,结果 表明重组纯化的 人d防御素3前 体蛋白具有有效 杀灭大肠杆菌 DH5d和克雷伯 茵的作用,这将为 以后进一步研究 人d防御素3前 体蛋白对于革兰 氏阳性菌,真菌和 病毒的杀灭作用, 探究人类d防御 素3的杀菌机 制,以及影响防御 素杀菌效果的因 素打下良好基础. 同行评价:文章 采用大肠杆菌表 达系统制备具有 生物活性的人d 防御素3前体蛋 白.通过抗菌实 验.发现制备的 人d防御素3前 体蛋白具有明显 的抗大肠杆菌 DH5d和克雷伯 茵作用,与以前 报道不尽相同 由于成熟的,具 有生物活性的防 御素蛋白对于大 肠杆菌具有毒 性,因此很难实 现通过大肠杆菌 表达系统进行防 御素蛋白大规模 的生产,因此,本 实验可通过研究 人d防御素3前 体蛋白对于革兰 氏阳性菌,真菌 和病毒的抗菌作 用.对进一步研 究人类d防御素 3的抗菌机制具 有重要意义. 7645 ?5;???加?加们0 周立强,等人防御素3前体蛋白对克雷伯菌和大肠杆菌的杀菌作用 JSSN1673.8225CN21.1539/R www.zglc~.comkf23385083@sina.com 孑L进入细胞后,破坏生物膜,引起DNA,RNA和蛋白—— 合成中止,导致细胞死亡【们.所以,防御素通过正负电4参考文献 荷的亲和作用与细菌外膜结合是防御素杀伤细菌的 关键步骤.如果防御素本身正电性的消失,或者细菌 外膜结构和带电性的改变,都会直接影响防御素对于 细菌的杀伤效果【伯q. 根据目前的文献报道,成熟的oL防御素1对于革 兰氏阳性菌L.monocytogenes有很好的杀菌作用, 而人oL防御素1前体肽基本没有杀菌作用【,原因在 于前体片段(propiece)所带有负电荷中和了成熟的 人oL防御素1的正电荷,使它无法和带负电荷的细 菌外膜上的目标位点顺利结合. 根据以上的研究,在本实验中前体人oL防御素3 杀菌作用的原因可能是由于以下两个方面的因素: ?成熟的人oL防御素3对于革兰氏阴性菌的杀菌作 用普遍好与革兰氏阳性菌和真菌,因此人oL防御素3 前体蛋白可能对于同为革兰氏阴性菌的大肠杆菌和 克雷伯菌细胞外膜上的受体比较敏感,容易与其结'' 合,因而杀菌作用较好.?由于实验中用于蛋白纯化 的His-tag由六个带正电的组氨酸组成,带有较多正 电荷,所以能使纯化后的人oL防御素3前体蛋白带 有很强的正电性,可以较好地与带负电荷的细菌外 膜相结合,这也可以解释本实验中所发现的人oL防 御素3前体蛋白杀灭大肠杆菌DH5oL和克雷伯菌的 蛋白浓度与已报道的成熟人oL防御素3的杀菌浓度 相当. 结论:通过对前体蛋白的杀菌实验的研究,结果 表明重组纯化的人oL防御素3前体蛋白具有有效杀 灭大肠杆菌DH5oL和克雷伯菌的作用,这将为以后进 一 步研究人oL防御素3前体蛋白对于革兰氏阳性菌, 真菌和病毒的杀灭作用,探究人类OL防御素3的杀菌 机制,以及影响防御素杀菌效果的因素打下有利基 础. 7646 AgerberthB.GudmundssonGH.Hostantimicrobialdefencepeptidesin humandisease.CurrTopMicrobiollmmunol20O6;306:67.90 HazratiE,GalenB,LuW,eta1.Humanalpha.andbeta-defensinsblock multiplestepsinherpessimplexvirusinfection.Jlmmunol20O6:177 f12):8658?8666 SchneiderJJ,UnholzerA.SchallerM,eta1.Humandefensins.JMol Med2005:83(8):587.595 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