荨麻提取物对5α-还原酶抑制活性的研究的论文.doc

荨麻提取物对5α-还原酶抑制活性的研究的.doc 荨麻提取物对5α-还原酶抑制活性的研究 的论文 作者:冀保全 杨爱岗 朱永宁 逄越 唐玲 冯宝民 王永奇 【摘要】 目的研究荨麻提取物中水溶性成分的5a-还原酶抑 制活性。方法基于荧光测定的方法，建立一种5a-还原酶抑制剂体外 模型，从大鼠前列腺组织中提取5α-还原粗酶,与底物睾酮 (testosterone)以及供氢体还原型辅酶?(nadph)共同组成了一种 微量反应体系。利用荧光测定仪检测nadph的含量，以荧光的强弱 来判断5a-还原酶的活性，以非那雄胺作为阳性对照。结果同对照组 相比，反应体系中加入荨麻提取物后荧光值有显著升高。结论荨麻 根的水溶性成分在体外能够抑制5a-还原酶的活性。 【关键词】 5α-还原酶 荨麻 双氢睾酮 前列腺增生 abstract:objectiveto study the 5α-reductase inhibitory activity of the aqueous constituents in urtica fissa e. pritz’s ectract. methodsthe 5α- reductase inhibitor’s model in vitro included a mini-reactive system posed of 5α-reductase extracted from the prostates of male rats, testosterone (as a substrate) and nadph (as a hydrogen supplier). the concentration of nadph easured by the fluorescence examinination. the specificity of 5α-reductase arkably higher than the reference group.conclusion the urtica fissa e. pritz’s aqueous extract can inhibit the activity of the 5α-redutase in vitro. key 在寻找其治疗药物过程中，甾体5α- 还原酶抑制剂已成 为研究热点之一,1,。从构效关系看，5α-还原酶是定位于靶细胞 微粒体上的膜蛋白,依赖还原型辅酶ii(nadph) 作为供氢体，该酶广 泛存在于前列腺及其它组织和器官中，是睾酮转变为双氢睾酮的催 化剂,2,，它不可逆地催化睾丸酮 (t)转为生理活性更强的双氢睾 丸酮 (dht)，dht被认为是良性前列腺增生症(bph)的主要病因, 抑制 该酶活性, 减少dht生成，已经成为bph 非手术治疗的主要途径 ,3,。 我们前期的药理实验表明，荨麻根的提取物对去势大鼠前列腺腹 侧叶和背侧叶的增生具有显著的抑制作用,4,。为了进一步研究提 取物抗前列腺增生的作用机理，本实验选取5α-还原酶为作用靶点， 利用荧光测定的方法，研究荨麻提取物是否有抑制5α-还原酶的活 性。 首先建立酶催化反应体系，利用辅酶nadph具有自发荧光特性 (nadph本身有强烈荧光，当nadph与还原酶和底物反应后，nadph 生成nadp+, 荧光随之淬灭)通过荧光检测仪测定nadph的含量来考 察5α-还原酶的活性,5,。 1 材料与仪器 1.1 药品与试剂非那雄胺(保列治), merck sharp & dohme (u.k.)ltd。批号j20050041;睾酮，上海久邦化工公司产品，批号20051106;nadph，biosharp公司产品， 批号041939;其他化学试剂均为国产分析纯。 1.2 仪器荧光检测仪 (型号:fp-6500，jasco公司);台式高速冷冻离心机(型号: biofuge prime， r heraeus公司) ;alpha1-4型冷冻干燥机(christ公司);数显恒温水浴锅(型号:hh-2，常州国华电器公司)。 2 方法 2.1 还原酶的制备,6,雄性sd大鼠3只,体重(200 g?10)g 大连医科大学实验动物中心提供,，禁食不禁水过夜后处死，迅速取腹侧的前列腺组织在冰台上剪碎，用预冷的匀浆液(蔗糖0.73 mol/l，氯化钙1.91 mmol/l)在玻璃匀浆器中匀浆,7,，在4?下以10 000 r/min高速离心20 min，取上清液再以16 000 r/min低温高速离心30 min，即为5α-还原酶提取物，采用lol的小试管，将底物、酶提取液,辅酶等反应成分依次加入，然后加入缓冲液(pbs 2.0 mmol/l, 蔗糖 0.2 mol/l, edtana2 1.0 mmol/l, ph 6.8)至2 ml，在37?下反应1 h。然后用荧光检测仪测定反应体系的荧光值。为了获得最佳酶活性测定反应参数，对反应温度、底物、酶的浓度以及反应时间的反应条件进行优化，同时以特异性5α-还原酶抑制剂非那雄胺,8,9,作为阳性对照。 2.3 荨麻提取物的制备和活性研究取荨麻根50 g，粉碎成1 cm的小段，室温下用水浸泡12 h，将提取液过滤浓缩后，加乙醇至浓度达到80,(去除小分子成分，避免荧光干扰)，沉淀冷冻干燥后配制成2 mg/ml溶液，按照“2.2”的操作向酶反应体系中加入(最终浓度0.1 mg/ml)，酶促反应后测定其荧光值。 3 结果 3.1 辅酶浓度和荧光测定条件辅酶nadph浓度为1 mmol/l，荧光仪测定条件:激发波长340 nm;吸收波长461 nm;狭缝宽度3 nm;响应时间 0.5 s。 3.2 睾酮浓度对酶活性的影响在固定酶提物浓度(1.2 mg/ml)和辅酶nadph的浓度(1 mmol/l)的条件下，逐步增加睾酮浓度，分别是:0.1，0.2，0.5，2.0，20.0 μmol/l和200 μmol/l，在37?条件下反应1 h，测定荧光值。如图1所示，当底物浓度在0,0.5 μmol/l时，随着睾酮浓度变大，荧光值降低，但当底物浓度增加10倍，100倍时，荧光值不再变化，说明当睾酮浓度到0.5 μmol/l时，即可获得较高的酶活性。 3.3 酶提取物浓度对酶活性的影响确定底 物和nadph浓度以后，考察反应体系所需的酶量，以总蛋白含量表示5α-还原酶提取物含量，用缓冲溶液稀释成一系列浓度，浓度分别为:0.3，0.6，1.2，1.8，2.4 mg/ml，在37?条件下反应1 h后测定荧光值。如图2所示，随着酶量的增加，荧光值不断降低，当粗酶浓度达到1.2 mg/ml以后，荧光值趋于恒定，因此将反应的酶浓度定为1.2 mg/ml。 3.4 反应温度对酶活性的影响设置不同的温度值，考察对5α-还原酶的影响，温度值分别是:15，25，37，45，60?。如图3显示，在37?条件下，相对荧光值最低，说明酶活性最高，当温度升高和降低时，活性有所下降，当温度升高到60?以上时，荧光值达到较高，基本上已经失去活性，以37?作为酶反应温度。 3.5 反应时间对酶活性的影响在固定酶的浓度和底物浓度的情况下，测定不同时间点荧光值的变化情况，时间点分别是:5，10，20，30，60，90，120 min。如图4显示，随着反应时间的延长，荧光值逐渐下降，在反应60 min以后，荧光值趋于恒定，说明酶已经反应完全，以60 min作为反应时间。 3.6 阳性对照药对酶活性的影响向反应体系中加入特异性还原非那雄胺，浓度依次为:10，25，50，75，100 μmol/l。结果显示，非那雄胺呈浓度依赖性抑制酶促反应，浓度达到50 μmol/l时，显示较强的抑制作用，表明采用荧光测定建立的5α-还原酶活性测定方法具有专一性。 3.7 荨麻提取物的抑制活性酶促反应体系加入荨麻提取物(浓度为0.1 mg/ml)，37?下反应60 min后，测定相对荧光吸收值，结果显示荧光相对值有显著升高，说明荨麻提取物具有5α-还原酶抑制活性，抑制率达到了60.9%。 4 讨论 在研究底物睾酮浓度对酶活性的影响时发现，当反应体系中不加睾酮时，荧光值也有所降低，可能有两个原因，一是大鼠组织液中本身就存在少量睾酮参加了5α-还原酶反应，二是nadph是一种非特异性的还原型辅酶，它可能作为酶提取物中其它的还原酶的供氢体而在反应中消耗，因此荧光值降低。 文献报道荨麻治疗前列腺增生的作用机理包括抑制芳香酶，抑制na+-k+-atp 酶以及与性激素结合球蛋白(shbg)结合等等，但关于其抑制5α-还原酶活性的报道一直都没有，本研究首次发现荨麻的水溶性成分具有抑制5α-还原酶的活性，至于是哪一个有效部位，多糖，蛋白质抑或其他极性成分还有待于进一步研究。 【