【doc】斑马鱼的克隆：囊胚细胞核移入正常具核卵子的发育

【doc】斑马鱼的克隆：囊胚细胞核移入正常具核卵子的发育 斑马鱼的克隆:囊胚细胞核移入正常具核卵 子的发育 高技术通讯2000.7 ?午斑马鱼的克隆:囊胚细胞核移入正常具核卵子的发育@ 圭蒸士璀?王锐查垦蓥:王梅林 (青岛海洋大学海洋生奇学院青岛266003) (中国科学脘海洋研究所青岛266071) 摘要将囊胚细胞核直接移植到来去棱的斑马鱼来受精卵子中,首次获得了正常发育 的幼鱼.染色体检查结果显示移棱胚胎众数为二倍体;组织切片检查结果表明卵子中来 去掉的原有的雌原核在供体核移八之后退化,不参与胚胎发育.细胞棱移植在模型鱼斑 马鱼上迄今未见报道,棱移植方法不但简单省时,而且供体胚胎仍可正常发育,为移核胚 胎提供理想的对照.细胞核移植在模型鱼斑马鱼上迄今来见报道. 关键词,垡,胞顿 0引言 细胞核移植即克隆技术在阐明核质关系,细胞 核全能性以及培育新品种方面都是一项非常有用的 技术1963年童第周等首次将克隆技术应用于 鱼类,开创了鱼类克隆的新领域.目前,鱼类的克隆 不仅局限于对细胞核和细胞质相互作用等基本理论 问题的探讨,还通过不同属,亚科甚至目的鱼类之间 的克隆,获得了不同发育时期的胚胎,幼鱼甚至获得 了具有优良生产性状的克隆杂种成鱼应用于生 产:. 以往的鱼类克隆技术绝大多数是先使受体卵入 水激动,待其排出第二极体后针刺挑去雌性原核,然 后注入经过预先分散的囊胚细胞核.这不坦费时, 而且挑核这一步的操作,往往易使卵子损伤失去部 分卵质,使移核后的卵子发育受到影响.能否省去 挑核及分散细胞这些步骤,使克隆技术变得既简便 又保证受体胚胎发育更正常呢?童第周等[曾报 道了将中期囊胚的细胞核移人未去核的卵子中,卵子也能发育成为正常幼鱼,其发育过程及形态与去 核的受体卵没有什么明显的区 别.余来宁等J对红鲤核与鲫 卵(属间组合),草鱼核与团头鲂 卵,鲢鱼核与团头鲂卵(亚科间组 合)以及尼罗罗非鱼核与金鱼卵 (目问组合)这四种组合的挑核和 ?863资助项目(81904—06). ?女.1968年生,博士.讲师;研究方向:发育生物学 @联系』,: (收稿日期:2000-0311) 一 24一 不挑核的克隆方法进行了试验,结果证明不挑核的 克隆鱼在各发育时期的成活率比挑核组高;通过对 前三种组合的未挑核卵发育至囊胚的染色体检查, 证明克隆杂种鱼为二倍体,核型与供体核相同;对鲤 鲫未去核克隆杂种鱼的LDH同工酶及血红蛋白电 泳结果证明和供体红鲤相同,从而推测未挑去的雌 原核在发育过程中被排斥掉.但是,该文作者对雌 原核发育命运并未作组织切片观察,提供雌原核退 化的细胞学证据. 斑马鱼是广泛应用的模型鱼,有关其胚胎发育 已有大量研究报道.但是,迄今未见有克隆斑马鱼 的报道.本文将囊胚细胞核直接移植到未去核的斑 马鱼卵子内,首次获得一尾存活26天的幼鱼,并从 细胞学水平证明雌原核在供体核移人之后退化,不 参与胚胎发育. l材料与方法 1.1材料 实验用鲤科短担泥属的斑马鱼(Brachydaniore— rio)幼鱼购自自由市场,在本实验室于28.5?水温 下饲养至性成熟.人工授精斑马鱼卵去膜,发育至 囊胚时直接用作核供体.待供体发育至囊胚时,挤 出斑马鱼卵子入水中,去膜后不去核,用作受体. 1.2方法 (1)核移植:从去膜囊胚的胚盘上用毛细吸管 直接吸取囊胚细胞核插入受体胚盘中央,将单个核 李荔等:斑马鱼的克隆:囊胚细胞棱移^正常具核卵子的发育 注入受体卵中.供体胚胎虽然有少数细胞被破坏, 但仍能正常发育. (2)染色体的制备:按余先觉等H的方法,制备 正常囊胚以及发育至囊胚期的59个移核胚胎的染 色体. (3)组织切片:将入水激动后2O分钟以及注核 后25分钟左右的卵子固定于Smith液中,每组l2 , l8粒卵.常规脱水浸蜡后,连续切厚7微米切 片,经Harris苏木精伊红染色.Olympus显微镜观 察并拍照. 2结果 在28.5?的培养条件下,未去核斑马鱼卵子接 受囊胚细胞核后,约3O分钟左右开始卵裂.移核卵 的第一次卵裂速度比正常受精卵快约15分钟左右, 但从第二次卵裂开始,其分裂速度与正常对照的一 致,约每隔l5分钟左右卵裂一次.移核胚胎发育到 原肠胚和尾芽胚的时间分别为4.5小时和9.5小时 左右,也与对照基本一致. 表1列出了未去核卵子接受囊胚细胞核后发育 至不同时期的胚胎数目及其比倒数.受体卵发育至 囊胚期,原肠胚期,尾芽期,肌动期,心跳期,血液循 环期及仔鱼的比例分别为61.87%,19.40%, 4.35%,2.68%,1.67%,1.67%和1.67%.各期胚 胎数以胚胎发育的外部形态进入该期的初期之后被 计人,其中囊胚期以正常囊胚计算,发育成部分囊胚 的胚胎未计算在内.在598粒移核卵中,共有l0个 发育成仔鱼,其中一条存活26天(图1A),图1B是 为该移核仔鱼提供了囊胚细胞的供体胚胎发育成的 仔鱼. 裹1来去核卵接受囊胚龋胞核后发育统计裹 图1A:发育79小时的移核仔鱼l{:发育8l5小时核供体仔鱼 染色体数目 A.止常囊肛细胞的染色体(2n=50),×99(IB.移植卵发育至囊胚的染色体(2n×50). ×990;c正常囊胚和移核卵发育至囊胚期的 染色体频率分布 国2正常斑马鱼囊胚和移辕舜发育至囊胚期的染色体【2n:501 — 25— 高技术通讯2000.7 A:箭头示^水激动后20分钟卵子B箭头示移棱卵子首次卵裂的中期 雌原棱,(×330);染色体,(X330); 圈3鼓动卵子和注核卵子的组织切片圈 未去核斑马鱼卵子接受囊胚细胞核后发育至囊 胚的染色体倍性检查结果显示不存在三倍体胚胎 (图2A,B).图2C表示正常囊胚和未去核斑马鱼 卵子接受囊胚细胞核后发育至囊胚的染色体频率分 布.正常胚胎和移核胚胎染色体数目分别为42, 50和26,50条,但两者众效染色体都为50条.这 表明移核胚胎和正常胚胎一样为二倍体.对人水激 动的未注核卵子切片观察发现:激动后20分钟卵子 的雌原核位于胚盘中央质膜下面(图3A).对注核 后的卵子切片观察表明:在注核后25分钟左右,卵 子已形成首次分裂的中期相(图3B),有时可见正在 退化的雌原核(图3C). 3讨论 自1963年童第周等_1首次开展鱼类细胞核移 植以来,已经进行过核移植研究的鱼类有:金鱼,鲤 鱼,鲫鱼,草鱼,团头鲂,螃皱鱼,泥鳅,罗非鱼,草鱼, 鲢鱼和鲮鱼等十几种_2J.本课题成功地将囊胚细 胞核移植到斑马鱼未去核卵子中,获得了正常发育 的个体.据查询,这是斑马鱼本种克隆的首次报导 斑马鱼囊胚细胞核移植到来去核卵子可以正常 发育,所获得原肠胚和正常发育个体比例分别为 19.40%和1.67%.童第周等_5将金鱼囊胚细胞核 移植至去核金鱼卵,所获得的原肠胚和正常发育个 体比例分别为28.7O%和7.40%.童第周等J的 结果是对质量差的卵子只统计发育为幼鱼或成鱼的 数目,因此统计比例较高.作者认为移核斑马鱼卵 子发育率低的原因是,斑马鱼的卵子几乎同时成熟, 待供体鱼卵发育为囊胚时,受体鱼卵已经过熟,因此 c:B图移棱卵子的另一切面. 箭头示退化的雌原棱,(X330) 总体发育率才会比金鱼低. 童第周等【]最先用未去核卵子作受体,获得正 常幼鱼.余来宁等_3分别将细胞核移植到去核和 不去核卵子中,证明去核对胚胎发育有一定影响,并 推测供体核注入来去核卵子后,雌原核在发育过程 中被排斥.本研究首次提供直接的细胞学证据,证 明了供体核注人未去核卵子后,卵子原有的雌原核 退化,从而证实了余来宁等的推操I结果.在非洲 爪蟾上,Fischberg等_6也证明移植到非洲爪螗卵子 中的核与卵核一般不会合并,后者消失,前者成为胚 胎细胞的核,仅在1%的例子卵核与移植核有合并 的现象.本实验的染色体观察表明斑马鱼移核胚胎 均为2倍体,未发现有3倍体的胚胎,这又从另一个 侧面证明卵子原有的雌原核并不参与胚胎发育过 程. 与过去鱼类细胞核移植方法相比,本文采用的 移核方法既简单又省时.再者,供体胚胎仍可正常 发育,这为移核胚胎提供了理想的对照. 参考文献: :1]童第周,吴尚憨,叶境芬等.科学通报,1963,7:60 [2]YanShaoyi(严绍颐).Hongko~g:IUBSEducati.na1aad CulturalPress,1998 [3]余来宁,杨永铨,柳凌等淡水渔业,1989,3:3 【4]余先觉,周暾.李渝成等.中国淡水鱼类染色律.北京: 科学出版杜,1989,140 [5]童第周,叶境芬.陆德裕等.动物,1973,19(3): 201 [6]FischbergM,GurdonJB,EkdeTR.Ex#.CellRes, 1958.6:161 李荔等:斑马鱼的克隆:囊胚细胞棱移入正常具棱卵子的发育 CloningofZebrafish:DevelopmentofNon—enucleatedUnfertilizedEggs ProvidedwithNucleifromBlastulaCelIs LiLi,ZhangShicui,WangRui,LiGuomng,WangMeilin (DepartmentofMarineBiology,OceanUniversityofQingdao,Qingdao266003) (*[n~itmeofOceanology,ChineseAcademyofSciences,Qingdan266071) Abstract Nucleifromzebrafishblastulaeweretransplantedintothenon-enucleatedeggsofthesamespecies.There? cipienteggscleavednormally,andcouldgiverisetolarvalfish.Thechromosomenum~ranalysisshowedthat themajorityoftherecipientembryoswerediploidThehistologicalexaminationalsorevealedthattheoriginal femalepmnucleiintherecipienteggsbecamedegeneratedatearlycleavagestage.Itsuggestedthattheydidnot takeptinembryogenesisThisisthefirstreportondoningofzebrafish.Thenucleartransplantationmethod— ologydescribedinthisstudyisnotonlysimplebutalsotimesaving.Inaddition,thedonorembryosaremain— tainedtodevelopnormally.andthusprovidedanidealcontrolforthedevelopmentofrecipientembryos.Cloning ornucleartransplantationofzebrafish(Brachydaniorerio)withinsamespecieshasnotbeenr eportedthusfar. Keywords:Zebraflsh,Cloning,Nucleartransplantation 中国高新技术产业与资本市场论坛在鄂开幕 由国家科技部,湖北省政府联合主办的"中国高新技术产业与资本市场论坛",近日在武汉科技套展中 开幕.本次论坛以高新技术产业化和风险投资为主题,汇象了国内外科技界,金融界和实业界的800多名专 家,学者.科技部垂I部长徐冠华为本嵌论坛发支指出:随着经济全枣化的加快和加入WTO在即,我国发展 高新技术产业既面临难得的机遇,同时也面临严峻的挑战,要在高新技术产业发展这个全新的幡局中处于有 利地位,睹了需要培养造就大批创新型人才外,还必须充分发挥资本市场的作用. 据夼绍,全国各地目前已正式注册成立了9O多家风险投资机构,筹集风险资本总顿达到80多亿元人民 币,与此同时,证券市场即将设立科技板块为我国风险投资提供一个有效的融资渠道.与论坛同期举行的投 融资项目洽谈套,将首次整体推出"武汉?中国光谷"等160余个招商合作项目,近百家光电子信息企业推出 近千项新技术新产品招商合作展示信息. 举办此次论坛,旨在深入探讨适合我国国情的风险投资制度,分析研究高新技术产业发展的金融环境, 找出解决问题的办法与,进一步促进我国高新技术产业与资本市场的全面结合. (王芷) 一 27—