洛伐他汀高产融合子的筛选及其发酵条件的优化

洛伐他汀高产融合子的筛选及其发酵条件的优化 ‰,,～ 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果(也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 一虢邶帆坶钿份 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此) 研究生签名: 船支 ， 时间:》钗游,月,,, 导师签名 ,家州 时间:瑚,捧占月声 中瓒教监天学颀士攀拉论空 中文摘要 洛找毽汀(,,,,,,,,,,)楚一转采澈予微生秘瓣羟绎蒸貔二二装麓薄,逐撩酶镩翱翔，是,囊离散、安全、低毒驰治疗高照凋酵症的勰物熘饕轿廖好梗ǎ粒螅穑澹颍纾椋簦欤酰?,,,,,,,)翱鼓魏霉(,,,,,;,, ,,,()。 为获褥蹇产洛饯毽玎毂蕤趣蒜麓拣，零文将裹产洛霞憩漳她?魏霉,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,与低产洛伐他汀的红曲霉,,,,,;,, ,,,, ,一,进行原生质体融合。在,,,株融台子中筛选得到,,株整黪摹髓薅予爨发莲捧鹣焘产融金子，其中毒,,拣发薅革位熬提塞旗度越进?,。 经过发酵窑验研究，初步确定了遗奄予红姗霉液体笈酵产生洛饯弛汀的初始髓,德、碳源、氨滚、潺含氮深。避过正交嶷验确定了筚一氮溺墙葬蒸最后配魄鞠混合氮溪培养慕簸佳配院。磷究了,,,,,,,,,,,翻,,,,，，,,,,对发酵瓣彰嗽。瓢蘑拐步确定,红麴寒渡髂发簿产生洛筏他汀的培莽基为:,,,葡萄糖，,。,,牛肉潦鬻，,(,,,(,,,),,,,，,,蔷茄酱，,(,,,,,,,,,,,，,(,,,,,,,，,,,(,。鞋,发蓝捧在诧象襻下戆发酵攀往为,,,,,,,,,，融合子在诧条件下发酵单位为,,,,,,,,,,,。关键词;游戏健浮(,,,,,,,,,,)，?麴霉(,,,,,,,,,,, ,,,,,,,)，荭蓥霉(,,,,,;,,※扭)原生质体融合，发酵 中斓农业大学娥,,学位,幺立 ,,,, ,,;, ,,,,,,,,,, ,, ,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,?,,巧,, ,(,,, ,,,),,,,;,,,, ,,,, ;,,,,,,,, ,,, ,,,,;,,,, ,, ,,, ,,,(,, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ;,,,,,,,,,,(，, ,,,,, ,,,,;,,,, ,,, ,,,, ,,,,;,,, ,,,,渤,, ,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,, ,,;, ,, ,,,, ;,,,,,,,,,, ,,, ,,曲,,,,, ,,,,,,,,(,, ,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,, , ,,;,,,,,,,,,, ,,;,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,蕊,,,,,,,(? ，, ,,,, ,,,,,，,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,?,,,,,;,,, ,,,,,, ,,,,,,,;,, ,,,融,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,一, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,(,,,,;,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,，,, ,,曲?,,,,,;,,, ,,,,,,,畦,,,蕊;辩,,,, ,,,,,,,,,,,,(,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,(,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,( ,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,，,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,, ;,，”,,, ,,,,;, ,,, ,,,,,,,, ,,,,;?,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,(,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,?,,,,,,，,,, ,,,, ,,,,,;,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,，, ,,耱,,,,,,,,。,,, ,,,,;, ,, ,,,,,‘‘,,,, ,,, ,,,,,‘,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,舔,,,,,,;,,,，,;;,,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,，,,, ,,,, ,,,’,,,,,,,,, ,,,,,,、?壮;,,,,,,, ,, ,,,,,,;,,,，,(,,,,,, ,,,,,;,(,。,,耗(,,,,,,,,，,,,,,,,, ,,,,,。,(,,,,,,,?,,,,，疆,,,,,,,。，, ,,,, ;,,,,,,,,。,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,, ,,,, ,,,,?,,,,,;,,, ,,,,,, ,, ,,,,，？,,,, ,,, ,,,,,,,,,,，,,, ,,,,,:,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,, ,,,,,,，,,,,,;, ,,,,，,,,,,,,,,, ,,,,,,，,,,,,,,,,,,,。 , 孛蕊农韭大学磺,‘学位论文 洛钱德浮(,,,,,,,,,,)，义稼,,,,;,,,, ,，筵一种黔簪蒸线二醮辕簿,(,,, ,,,),丕原酶抑制剂(是一类,,,丁治疗高妇日嗍酵瘫的药物，它能阻,,动脉硬化发服，减～,心机梗塞等发缡的危险，因此在医学上具有重要意义。洛伐他汀是一种来源予擞生物的高效、安全豹酶胆溺薛药物，主要产生壤必?(热鼯(,,,,,,,,,,, ,,,,,,,)拳,红鹃霉(,,,,,;,, ,,,()。 ,丽虢本文相关内容的黼瞧外研究和开发进震做一个综合介绍。一、洛伐他汀(,,,,,,,,,,)的研究进展 (一)洛,釜他汀(,,,,,,,,,,)的发瑰致其结构特征 最早从傲生物代谢产耪中分离劐酶艟隧醇骑彩静是鳍本兰共制药株式会社帮曩嗣的,,,;,公司。,,,,荦，磊奉兰莛豹逡藤章(,,,,, ,,,,)教授麸,,,,;,,,,,, ;,,,,,,,鲍培养携中曾浚分离出具有抑制,,, ,,,迸原酶活性的物质。命名为,,,,,;,,,。尽管其鼯胆潮醇敲粜不错，但由于其副作用犬，安全性低，子,,,,年中止研究。,,,,年遁鼹章又从,,,,,,,, ,,,,,的培养液中分离出活性更高的,,,,;,,,, ,(,,,,，,，，,,,,、,,,,,，,,,,)，此物蕨与美垦,,,;,公司的,,,,,,,等于,,,,年鼠士曲霉(,,,,,,,,,,, ,,,,,,,)培养液中分离得到的,,,,,,,,, 捆同 (,,,,,,，,,，,,(畦,,。,,,,)，质壤冀壤统一鑫名为,,,,,,,,,。洛搜恁汀每上遽懿,,,,,;,,,属于弼系物。但药效更塞，蕞？作用磁低。此后，磷究人员叉分离】出活性和结构捆似的,,,,;,,,,,、,、,等，述有一然加氨产物(如,,,,,,,;,,,,;,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,;,,,,以及,,,,,,,,,,,,,,,,等(马荚荣，,,,,)(这缝经过化学修慷豹毅挺分子豹降胆篷酵辘力更强，毒剐作用受低。安全性更高。 ,,,,;,,,,炎匏葳戆萎本结构都禽露羟基痰醚嚣和萘强络稳，蒺嚣主有,,、,,嚣令墓溺，不婀的,,,,;,,,,类物质在邀甄个位鬻土羽基掰幂同。缮椽上的差剐导致这些榜震的理纯性斌不同和对照固醇裔成的抑制能力也裔掰不蔺(见衰,，,，,。,)。 寰,几种,，,,，;,,,,类物艘的基本结构硬刖、,,基嗣 基毒锈,匈 诧合物 ,, ,, ,,,,;,,,,,(,,,,,,,,,,) ,,, ,,, ?,(,。 , , ,张， —?,,’,, 。?, , ? ,: , , ,,, , , ,强, , , 串鬻农韭天擎龋:,:学位论文拦曼—鼍鼍曼兰尊删， ,，，,, ，，，,,,鼍皇曼蔓曼曼?鼻舅曼曼鼻鼎期鼎皇鲁曼～曼皇～ 裘, 几种,,,,,,,,,,粪糖质触璞他特性 化台物 熔点(?) ,？】‖ 分了盘 分下式 ,, ，, (甲酵中) ,,,,;,,,, , ,,,一,,, ，,,,(, ,,, ,?,，扣, ,,,，,,,，,,, ,,,,，,,,,，,,,, (,,,,,’黯,,,) , ,,,,;,,,, , ,,, ,,,,,,,, ,,馥,, ,’,,, ,,,, ,,,,;,,,, , ,,, ,,,,,,仉 ,, ,’,,,(,,, ,,,,，,,, ,(,,,, ,,,,;,,,, , ,,, ，,,,(, ,,, ,甜,,?,, ,,,，,,,，,,, ,,,,，,,,,，,,,, ,,,,;,,,, , ,,, ,,，,’,,, ,,,，,,,，,,, ,,,,，,,,,，,,,, 褒,是种,,,,;,, ,,类蘸镑辩蕤效 药品名 ,,蛐值 药效特征 ,,,,;,,,, ,(,,,,,,,,,,) ,(, ,(,,,,,, 需鬻柱体内激活后才有活性 ,,,,,,,,, , ,:, ,,,,,,, 需嚣糖体内激括后才有活性 ,,,,;,,,, , ,(, ，,,,,,, 需骤在休内激活后才有话性 ,,,,;,,,, 纛赛簌律痔蠢蒋君才存活蛙 ’ , ,，, ,,,,,(,, ,,,,,,,,, , ,(, ,(,,,,,, 需熏程体蠹激活后考有活性 ,,,,,,,,,,,,(阿托伐他汀) ,, ,,,,，, 翻服吸收后即可有活性 ,,,,,,,,,,,(普伐他汀) ,,,, ,,,,,, 瞄服碾收后即可有活性 涟:，,,,是奉药对”黼州避蛾麓抑制作用的,,,抑制浓壤 表, ,,,,;,， ,,粪豫台镑靛产生蘩疑麓发琏年静 他台物名称 产生蘸 发现年份 ,,,,,;,,, ,,,,;,,,删， ;,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, , ,,,,,;,, ,,,,,, ,,,, ,;,,,,,,, ,,,,,,,,,,,船,‘, ,,,, ,,,,,,,,, , ,,,,,;,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, , 硒,,，,,,,,,, ,髂, ,,,,;,,,, , ,,,,,;,, ,,,,,, ,,,, ,,,,;,,,, , ,,,,,;,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, , ,,,,,;,, ,,,,,, ,,嚣, ,,,,,,,;,,,, ;,,, ,,,,;,,,,, ;,,,蜘;? ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, , 孛蠲农整支擎赣:,,学位沦曳十 ，，皇曾曼蔓～曼曼曼鼍～毫曼窖篡鼎燃蜷基曼曼,皇皇毫皇苎量皇—曾,曼詈曼～舞期黑，，————————————一—— (二)洛饯德汀(,,,,,,,,,,)的作用机理 人体血消中胆州醇水平过高是引起高,压、动脉粥样城化和冠心痛的重要艨闲。人体内胆，翎尊来源于食物和体内生化合成(后者，,全部胆髑醇来源的,,,,,,,，其中,,,以上是在肝驻合成的。圆戴拇制体内过多的勰黼醇台成跫貉瀹心血管疾瘀静一种有效途径。人体蠹疆固酵生耗合成是瑷食镌孛懿己酸盐为蘸髂，获乙醚辏酶,开娥。大约经过饕多个步骤戆终金成疆圈酵，其中一个隈速步骤是,，,,疑甲慕戊二酰辅酶,(,,, ,,,)经过,,, ,,,还原酶盼作,,后，经,，甲(,，,(二羟甲戊酸至拭烯。最后生成胭固醇(见圈,)。若这个限速还原反应被抑制，就可以抑制胆阍醇的生成(码荧荣，,,,,)。 , 器 重,(,?,,,(,)与,,,,,,,,,,的酸瓣绪构(,)比较 乙酰辅酶,——————————’卜乙酝乙酰辅酶——一……一》 乙酰辅酶,兰竺苎量兰竺?篓篓篓》乙酝乙酰辅酶,篓?巡槿靡钴崖描德?〔(,,,、,, ， ,,,,,,,,,,,,,, 羟甲基戊,酰辅酶,————————,,二羟甲戊酸——,,焦磷酸,盎嘴酯 ,,, ,,,还原酶 (,,, ,,,) ? 捧制作用, ,,,,,,,,,, ,面商嚣溢嚣—》鲨烯,胆阉醇————面磊茹茹磊,—翱固醇酯 鲨烯合成酶 脂酰辅酶,:腮固醇脂酰转移酶 豳,腥荫群生物鸯藏途径殛,,,,,,,, ,,辩剿整熹 , 中瑚农业人学贼,:学位论奠?，， 。，, ，，，，，，，～蔓舞曼蜘糕笪曼～寡,,～ 如图,所示，由，洛伐他汀的羟基内酯酸氆绪构与,,, ,,,避原酶的底物分子,,, ,,, 根接近，因此潞伐他,(,,,,,,,,,,)就竞争性她抑制了羟甲基戊二酰糙】舀蟮,(,,, ,,,)还原酶 的侔耀位点(蔸篷,)，双而醚断了,休肉耪斑酵的生耪合成。 另外，人体内还存在着两裟负责转运目,(,,,醇的蛋向:低密度腊蛋白(,,,)和高密度腊鬣 爨(,,,)。一方蠹，耱淘薛念残受隧嚣，会露,激蒡,,,缨骢袭蟊匏羝密塞驻虽趣(,,,)受俸数 目的增加，,,,受体的增加导致,,,的减少，惭,,, ,，勺功能是将胆固醇转运到人体其他细 照，冀提供仑成类崩醇拣翦体，扶夏提裹人体盘渡串疆援黪鳇浓度。鞭班,,,豹疆少簿抵了人 体血液中胆同样的水平。另一方面(胴删醇合成受阻会增加血液中,,,的浓度，而,,,的功 能恰悖与,,,相反，宦负责将周碗细胞的积瑚酶转运到黔细胞，用以合成腮酸和胆汁，从而降 低了越液中髓阉酵的浓成。所啦,,,的增船也酶低了天体照液中簸嘲酵的浓度。 (觅黼,)。 删一阻,,眦,,,壤辨瓣二二二二二羹 练上所述，,,,,,,,,,,作为,种,,, ,,,逐原酶抑制荆，其作用主要是通过竞争性抑制,,, ,,,:,丕缣酶静律耀谴点，遴磊蓬断耱蠢醇会成，灌妻嚣,,,受律霸,,,静浓度，献两达刭 降低人体内的胭固醇禽螭的作抖,，。 (三)其它徽生物来澈障胆固醇药物的讲究进展 泛年来，磷究太爨镑瓣太钵疆毽酵仑成途径串菩荦孛荚镳酶，发璇了豫滠俊链汀戳努箕宅数生物来源的腮固醇台成抑制荆(,,,,年，,,,,,,,,,报遵从真菌代谢产物中发现了一种活性物痍——,稻,、,,,，它澍驱疆酵会成途径中豹乙戮艺鼓辘酶,琉解瓣寿特舅驰撺铡捧髑。,,,,年(,,,, ,报递分离祷剐了一种化台物—川,,,,,,,,,,,,(它能够选择性地抑制,,, ,,,合成酶，但活性较低。几乎间时，研究人员从冀菌代谢物中发现丁戏,,,,,,,,,,,和,,,,,,,,; ,;,,的类截优食钫群，它们,,砉鏊烯合成酶霄,,鬻强靛稚耩作用。这戆钫震静结构阀餮烯合成辩反应串闻体的结构类似(因而具有特异幔抑制作用。今后裟烯合成酶抑制剂荫望发展为新型的酶,,,,司醇势秘,马美絷，,,,,)。 另外。脂酰辅酶,:胆圃醇脂酰转移簿(,,,,)是俄化胆固酶生成胆同酵酯的酶，在生物转砖髓强簿代潇过程中起薏重娶熬终耀(爨瑟，,,,,被认蠹是酶低疆巍群期虢滚动躲疆纯药物的,个好的靶酶。双上个世纪,,年代，日率的学者开始集中耩力从微生物代谢产物中筛选,,,,抑制荆，主要产生落有青霹、烟曲檬等。这些抑制荆中以,,,,,,,,,,,,的活性援强，它楚徽整窃来源的最有希攮成鸯新酌防治动酥硬纯的药钫，箕今后静麓嶷令,注目。 , 串霉敷监大学碳(,:掌拄论文 (四)洛伐他汀(,,,,,,,,,,)的开发现状和前景 犬量统计数据说弱，心脑擞管疾瘸戆,,超人癸矩亡筏次子癌瘥鲸第二大疾病，高瞧精症楚造成心脑血管疾病的匿耍因素(随着人瞻生活水甲的提高带,生活方式的改变。患高,脂症的人群将越来越多，两曼零龄东秘越寒越冬轻纯。为调萤盘鼗，人类器茇了一整渡疗裹巍囊症羲蓊物，但是疗效单一，露削作用较大， 不尽如人意，人”,期特着一种既有确切的调脂作用又能避免毒剿捧捌熊新型、安全、巅效的保健食晶来颈黪积减少心脑血管疾病的发生和发鬟。强蔻酶脂药物主要商四类;树脂类，烟酸类，氯贝特类，他汀粪。其中以洛伐德汀为代表的他汀类药物魑目前最射尚的一类降眙药。经临床实验，洛伐他打是商效、安企、低毒的治疗岗魈圃醇巅症的建好药物。 ,,,,,,,,,,是第一个开发投产的羟甲基戊二酰辅酶,(,,, ,,,)还原龄抑制荆药物，由美嚣,,,;,公霹挎毒专弱，产生蘩莛?麴霉(,,,,,,,,,,, ,,,,,,,)。双近嚣年魏市场链售现获来看，,,,,年，全世界调脂药的垒年销售额达,,,亿美元，其中他汀类药物的全球销售额达到,,,多亿美元，是谖,,药缒主力军。要翦镑踺最好熊翦,,荦孛心盘蛰黉药物孛，洛我魏汀年销黉额,,(,,亿黄元，排名第三。,,,,年，世界降疯腊药物市场销售撷达,,,亿美元左右。可见洛伐他汀的进一步开发具有报好的市场前景。二、红曲霉的研究及应用 经曲霉怒我匿巴使埽数千年的食箍发酵菌(商籍中对萁特殊功效及在食蘸上的应桶早育记载。李时珍税《本草纲目》中霹道:红曲生泊消食话虹，健脾燥胃。治赤白痢，下水谷，治打羚伤摈，滩女天盎气臻投产嚣瑟斑不尽。,,,,年(法墨学者,,, ,,,,,,,簌骂铃薯培养基上分离到两株真簿，建立了红曲霉属。之后世界各地学者在谷类、新鲜牧草、泥土、橡胶、鱼千、河列表嚣沉淀物秘拴楗摄鳃缓上帮菠瑗了缎夔霉。绂藏霉袭代淫过程审萄产生簿、鼗、蘸、多秘水解酶和各种次级代谢产物。这烘物质可广泛应用于食品、医药等行址(路秀玲，,,,,)。 筑麴霉怒一属小型丝欺腐生真菠，属子囊蓠豫,,(,,,,,,,,,,,,)不羧囊蕴纲 (,,,;,,,,,,,,,)散囊菌苷,,,,,,,,,)红曲科(,,,,,;,;,,,)，主鼷种类祷红曲霉 (膨棚轫)、烟色红地霉(,,,,,,,,,,,,)、紫红曲襟(,(,,,,,,,,,)和红色红曲霉 (,(,,,,,)簿(陈义毙, ,,,,)。红鞠霉静形态必不麓刘静分支藩熊，落墼粪有太赘渡泡，鏊丝具横隔，多梭，分棱多而不规则:分擞孢子梗幽蔼丝生出， 顶部产生分生袍子，单生或向藏式垒藏,,,个藏链，努裳燕子夫多为黎形、多菝，藕内生型分生疆子，并麸主麓下逐瀑藏熬，趣囊壳球形、具柄、长短不一、内嫩，,多个子囊，予囊球形，内含,个子囊孢子(成熟后子囊蹙孵掺，孢子饔我薄壁鹩子囊壳内(蓬落镪为骞琶，老熟螽变成滚红色，紫红色、橙红色等。藏落量绒状或皮腋状，量皮膜状的菌落多横纹或具辐射状。一般多采用麦芽汁琼脂或曲汁琼脂培养(张纪忠，,,,,)。 譬 中删取照,学蛾,。学垃避奠 (一)红曲辩菌丝体艇其培养物中的生理活性物质 经过近、,个髓籍的研究攥素，龋竞,樊逐港发獬出垃鹣霉及其培养耪中掰含育静其有至疆活性的物质，主要包括以,,,人类: ,、数基色素 纽曲霉以其能产媲大量红曲色素丽褥名。红随亡，古以来在我国一直用于食品着色，特剐最 痰畿的羞色。照着人,】汉识剑合成色素育可能诱发癌症蕊逐渐设禁耀后，缎麴色素作为微生物犬然发酵产物，越来越受到髓羿各国的认可，其市场消费艟也逐年增加，我陶和日本等砭洲国家的雾家企业已经实现了红曲色素弁勺,:业化生产。红曲色寨是多种色素的混台物，目前确认的有红色系，黄色系帮稳色系二天类(蹲秀泠，,,,,)。红鹣色素暴商穰离鹃燕稳定幢(能辩,踯一,,,”,高温)、蛋白精色力强、色调震羊?、对酸城稳定、安全性商等优点，且不含黄曲霉毒素。这些撬舞馒其在禽赭烹琵、凌类羲黩等方瑟褥裂非露广泛豹瘦蠲(陈义必，,,,,)。在雯产,二艺上，已经由传统的固体.