动物细胞工程制药

动物细胞工程制药 最基本的有细胞融合技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术 1.比微生物细胞大，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，1. 贴壁依赖性细胞:包括成纤维细胞型，上皮细胞型。生长于支持物表面。 适应环境能力差。 2. 非贴壁依赖性/悬浮细胞：这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培 2.倍增时间长，生长缓慢，易污染，培养时添加抗生素 养液中悬浮生长。来源于血液、淋巴组织，许多肿瘤细胞等均属于此类。 3.需氧少，有些需CO2 细胞一般呈圆形。 4.培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在。 3.兼性贴壁细胞有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养。 如中国仓鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞 非原代细胞(primary cell) 直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液；1g组织约有109个细胞 基传代细胞系(passage cell) 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细 因 (continuous cell lines, CCL) 胞株。2n;有兼性贴壁性；30-50代；无致瘤性 转化细胞系(transformant cell) 通过某个转化过程形成的，失去正常细胞的特点。由于染色体的断裂变成异倍体，获得无限增殖 的能力。为永生化细胞，无限细胞系；更适于大规模工业化生产。 基杂（仙台病毒、聚乙二醇50%、物理方法：电击法，激光法） 因种?细胞融合后，除目的杂种细胞外，还有同合体细胞和未融合的亲本细胞 工细筛选方法：（1）营养缺陷型细胞系或抗性细胞系作为融合的亲本细胞，选择培养基来筛选（2）利用或人为制造两个亲本细胞的物程胞 理差异，如大小，密度等进行筛选（3）利用或人为制造杂种细胞与未融合细胞生化或分生能力的差异，进行筛选。 细重最多用的是CHO细胞 胞组（外源基因在动物细胞中高效表达，首先要将其构建在高效系细表达载体内，表达载体两类：a.病毒载体，牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒的胞 和杆状病毒 b. 质粒载体——穿梭质粒载体(选择性标记+增加拷贝数基因)） 构?建 ?Neor: G418;tk+：胸腺嘧啶激酶 hgprt+： 次黄嘌呤 牛痘病毒感染细菌(牛痘启动子&重组基因)—转化—培养—收集 杆状病毒首先和质粒一起在细胞中培养；质粒“感染”病毒-得到的重组病毒 再去转染其他细胞(重组DNA病毒介导法) 附：PEG：主要用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备 细胞名称 来源 特性 培养条件 用途 W1-38 正常肺组织，成纤维细胞 2N BME+10%小牛血清 制备疫苗 Vero 非洲绿猴肾脏，贴壁成 2N=60 199+5%胎牛血清 增殖病毒，产疫苗，表达外源蛋白 BHK-21 地鼠幼鼠肾脏，成样 2N DMEM+7%胎牛血清 增殖病毒，产疫苗，表达外源蛋白(第二常用) CHO-K1 中国仓鼠卵巢 2N=20~22 DMEM+0.1M次黄嘌呤、胸苷，分泌表达外源蛋白 10%小牛血清，脯氨酸 Sf-9 球粘虫蛹卵组织 Grace培养基+10%胎牛血清 高校表达外源蛋白 Namalwa 肯尼亚淋巴瘤病人 2N=12-1单X染色体 RPMI1640，7%胎牛血清 生产干扰素 SP2/0 小鼠脾细胞+骨髓细胞 2N=62-68 DMEM+10%胎牛血清 生产抗体 1.温度-哺乳动物细胞最佳温度：37?0.5?；昆虫细胞最佳温度：27?； 2.pH：最适pH：7.2-7.4；3、氧+5% CO2的混合气体； 4.防止污染：十分重要 动物细胞培养基：1、平衡盐溶液(Hanks液，Earle液，HEPES溶液)；2、合成营养培养基(199、MEM、RPIM 1640、DMEM；基本培养基的四大类物质：氨基酸；维生素；碳水化合物；无机盐) 克隆培养(clonal culture)：即单细胞分离培养，由单细胞培养成纯细胞系 培养方法：悬浮培养；贴壁培养；贴壁—悬浮培养 在人工条件下在中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。 悬浮 是细菌发酵基础上改进的；主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等,也适用于兼性贴壁细胞 气升式，搅拌式反应器；产重组蛋白和单抗 微载体 60-250um的颗粒，创造大面积供细胞贴附生长；载体体积小，比重轻，在轻度搅拌下即可携带细胞悬浮于培养基 细胞在 工业化生产各种疫苗和细胞产品；载体基质：葡聚糖、交联明胶、纤维素、聚苯乙烯 外 多空载体 大规模高密度的培养方法；多空载体是一种支撑材料，内部有网状小孔，细胞可以在里面生长 细胞在 即可用于悬浮细胞的固定化连续灌流培养，又可用于细胞的贴壁培养，细胞生长于内部，可免受搅拌等机械损伤 里 常用：陶瓷，明胶，纤维素及衍生物，聚苯乙烯等材料 微囊化 把细胞包在微囊里悬浮培养；细胞由于包裹而受到保护，避免了剪切力的损害；可获得较高的细胞密度，一般在107-108个细 胞/ml以上；在控制了微囊的孔径后，可使产品浓缩在微囊内，利于下游产物的纯化。可采用多种生物反应器进行大规模培养 Attention:多空载体不可以使产物浓度聚集在内，仅仅是一个支撑 中空纤维 模拟体内的三维培养状态，细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟人工毛细血管供给营养，使细胞高密度生长 材料有硅胶，聚砜，聚丙烯等，为半透膜 大分子分泌产物如抗体就可通过外腔的无血清培养液直接带走不用分离纯化；小分子入内室不会对培养中的细胞产生毒害作用 动物细胞大规模培养的操作方式 分批操作(batch) 补料-分批操作(fed-batch) ：普遍应用于细菌生产，动物细胞培养中较少用。 半连续式操作(semi-continuous) 连续式操作(continuous) ：除个别情况下用于悬浮细胞的培养生产外，一般用灌流培养来代替。 灌流式操作(perfusion) 实验室规模：小于20L的反应器，培养研究；中试规模：20-100L的反应器，提供一定量的产品，共纯化、临床前的各种检测和临床观 察，工艺优化实验等的需要；生产规模：大于100L，用于生产，提供产品 搅拌式生物反应器 最经典、最早用于动物细胞培养的反应器；通气好，搅拌剪切力小，有利于长时间，高密度培养主要用于悬浮细 国外占主流 胞的培养、微载体培养、微囊和巨载体培养以及结团培养；主要特点是可以避免在向培养基中通气时气泡直接损 伤细胞。笼式通气搅拌器的改进-- NBS装置；分别包括笼式的通气腔和消泡腔； 气升式生物反应器 没有搅拌，气体通过喷管进入；剪切力更小 主要用于悬浮细胞的分批式培养，近年开发用于贴壁细胞的微载体培养，并进行半连续、连续和灌流式培养 和搅拌式生物反应器相比，气升式反应器中产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小；同时反应器内无机械运动部 件，因而细胞损伤率比较低；反应器通过直接喷射空气供氧，氧传递速率高；反应器内液体循环量大，细胞和营 养成分能均匀分布于培养基中。 故在植物培养中也很重要 中空纤维式生物反应器 由数百千根中空纤维束组成；既可培养悬浮生长的细胞,又可培养贴壁依赖性细胞，细胞密度高达109/mL数量级 透析袋或膜生物反应器 培养分为两室或三室，培养基与细胞用滤膜分开；既可用于贴壁细胞培养也可培养悬浮细胞 优点：可使细胞达到很高密度；可随意组合进行操作，达到保留和浓缩产品或及时分离提纯产品的目的 固定床或流化床式生物反应器内装不锈钢、玻璃珠、玻璃环、光面陶瓷、塑料或有孔的陶瓷、玻璃、聚氨酯塑料等载体 反应器 专用于比重较大的多孔微球的培养 附：CellGen plus生物反应器；固定床（微载体）+通气+搅拌 且用于生产疫苗的动物细胞在接种病毒时是在发酵罐中接种的，如Vero+狂犬病毒 获得转基因动物的主要： 外源目的基因的制备?外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞?选择获得携有目的基因的细胞?选择合适的体外培养系统和宿主动物 ?转基因细胞胚胎发育及鉴定?筛选所得的转基因动物品系? 显在光学显微镜下，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物DNA显微注射法的基本程序 微早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动注射妊娠血清和人绒毛膜促进腺激素的激素疗法使小 鼠超数排卵数加大 注物个体的技术。目前是创造转基因动物的最有效，最成功的交配后，从输卵管内取出受精卵； 射途径，非嵌合体 转基因样品注射入受精卵中变大的雄性原核内 法 优点： 转基因范围广基因大，可达数百kb； 将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内 ； 任何病毒基因组片段，绝对安全 。 受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代 ； 缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致子代体内取出DNA样品，杂交，鉴定转基因的整合子代小鼠间再交配 转基因不表达 反将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，(1)反转录病毒基因：顺势作用序列（调控）+反式作用序列（表达） 转人为感染着床前或着床后的胚胎，（也可直接将胚胎与能释放(2)复制缺陷型重组病毒载体的构建只能产生病毒RNA不编码结构蛋白 录逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的）获得提取病毒未整合的环状形式DNA；将环状DNA克隆到适当的载体中；选择病转基因动物的方法 适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除；外源目的基因克隆到载体中 毒在培育转基因禽类研究中有广泛应用 （3）病毒包装细胞：染色体整合除序列的整个病毒基因组，为重组蛋白载 感如果在第一次卵裂之前外源DNA整合到胚胎基因组中，可获体转录的RNA提供包装蛋白 染得转基因动物在第一次卵裂之后整合，会产生嵌合体，其第（4）通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞：利用反转录病毒DNA法 二代可能出现转基因动物。 的LTR区域具有转录启动子的特点，外源基因随病毒RNA转录，并在载体 优点：同时感染大量胚胎；整合率高，转基因整合后能稳定上 序列的作用下，重组病毒转录的RNA和包装细胞提供的包装蛋白就可以 地遗传；单拷贝整合型；不需复杂设备 组装成有感染性的病毒颗粒，病毒收获后感染早期胚胎或直接感染受精卵。 缺点：外源基因难植入生殖系统，成功率低 或构建好的DNA注射入囊胚腔中和重组病毒及辅助病毒共培养进行转染 载量较小，一般只有8 kb 胚胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞 胎1、将ES细胞注入到动物早期胚胎内，可产生嵌合体转基因动物。2、通过核移植将ES导入去核的卵母细胞，在子宫种植发育成个体 干 细3.5天孕鼠?鼠断颈处死?解剖小鼠取出胚胎?体外培养胚胎4-6天后，离散ICM?分离胞ICM酶解细胞团?培养离散细胞?ES细胞集落?：离散ES细胞置四孔培养板中培养?：ES细胞由四孔方板转至培养皿进行常规培养 法 正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：重组DNA导入ES细胞，在含有G418的培养基中，没有整合外源基因的细 胞将全部死亡，只有整合了外源基因的细胞才可以存活下来。 负选择法筛选出特异整合型ES细胞：如果非特异性整合发生，则两个tk基因或其中一个基因很大可能与TG和neor一起整合，这时用 GCV筛选， tk基因表达的胸苷激酶能反GCV转化成有毒的化合物，使细胞死亡。 （先PCR） 优点：整合率高，同源重组实现定点整合而非随机整合；缺点：不易建立胚胎干细胞系，一代是嵌合体，获得转基因动物的周期较长 基因敲除的技术路线如下： 基：靶基因被灭（1）构建重组基因载体? 因活，无功能的外源基因转入细胞与基（2）打靶载体导入ES细胞：重组置换 打因组中同源序列进行同源重组，把具（3）基因敲除ES细胞注射入胚泡 靶 有功能的同源序列置换出来，造成功（4）胚泡植入假孕小鼠的子宫中 能基因的缺失或失活。 （5）嵌合体的杂交育种 引入不存在的基因打靶载体：型载体，序列插入型载体，这类新基因. 将外源有功能的基因转入载体与靶基因组同源重组配对，经过一次交换，前基因组中不存在或已失活的细胞中者插入后者，它发生单交换而将载体序列插入靶基与其基因组中同源序列进行同源重因内，致使染色体DNA部分重复，可能破坏内在正组，在细胞内获得表达。 常基因而发生突变，也可代替原来缺陷基因，纠正基因修正 遗传特征，使靶基因特异失活。 ：胚胎干细胞+打靶载体Neo（新霉素）阳性筛选标志Ω型载体，也称序列取代载体，外来载体DNA和靶（HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病细胞染色体DNA同源配对，经过两次交换，前者取 毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧代后者，此类载体可与靶序列发生双交换，以外源 啶激酶(thymidine kinase)） 序列取代靶序列，其基因组大小并无改变。 方法 显微注射 核移植 胚胎干细胞 逆转录病毒 基因敲除 精子介导 优点 外源基因整合效率较转基因效率高；预测外源DNA的整合率高； 整合可在整合点整合转移基因 该方法简单、方 高，不需要载体，目的基因表达水平；可以在生殖细胞中的比例也很高。 的单个拷贝 ； 便 基因的长度可达100Kb 使用定点整合技术 缺点 精密仪器， 技术操作较供体细胞易衰老 ES细胞株不易建立，长期培养插入的基因有大小限度；嵌应用具有一定局限有些结果不能 难，易造成宿主动物基后出现分化现象；生产的转基合性很高；外源DNA 在动物性 重复 因组的插入突变 因动物都是嵌合体 各种组织中的分布不均 :目的片段在器官或组织中表达的转基因动物 ： 药用蛋白基因?表达细胞株?细胞核 受体动物 ? ? 供体动物?受精卵?无核受精卵?组装的核细胞?胚胎?假孕动物?动物幼崽?转基因动物?乳汁雌性药用蛋白 商业要求：,1g/L 乳腺是外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身的生理反应，从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物，不但产量 高、易提纯，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为动物乳腺生物反应器 1、动物乳腺是一个：表达的蛋白绝大部分不会回到血液循环, 避免大量表达的外源蛋白对动物健康的危害。 2、乳腺组织是一种。奶牛一年生产乳蛋白250-300kg, 山羊生产乳蛋白25-30kg, 家兔生产乳蛋白也可达到3-5kg。 3、乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和后加工， 生物学。 4、动物乳腺表达的外源基因可以遗传，获得生产有价值蛋白质的动物个体 后, 可以生产群体。 可进行商业生产的有近30种,包括人AAT(抗胰蛋白酶；治疗遗传性肺气肿) 、EPO、乳铁蛋白、BSA、血红蛋白，?、?和抗凝血酶?、血纤维蛋白原、 tPA等十余种稀有药品 post-translational modifications 1. human protein C不能正确的形成亚基 2. human antithrombin III未能完全的糖基化 转基因高等哺乳动物乳液蛋白糖基化仍有别于人，可能导致抗原性的变化