脑白质损伤新生大鼠脑白质P75NTR蛋白与RhoA mRNA的表达及意义

脑白质损伤新生大鼠脑白质P75NTR蛋白与RhoA mRNA的表达及意义 脑白质损伤新生大鼠脑白质P75NTR蛋白 与RhoA mRNA的表达及意义 第9卷第4期 2007年8月 中国"-3代儿科杂志 ChinJContempPediatr V01.9No.4 Aug.2007 新生儿脑损伤专栏?实验研究 脑白质损伤新生大鼠脑白质P75NTR蛋白 与RhoAmRNA的表达及意义 李德渊,陈娟,石晶,李晋辉,姚裕家 (四川大学华西第二医院儿科,四川成都610041) [摘要】目的最近研究发现NgR—P75NTR.RhoA信号通路在神经损伤和重塑方面发挥关键作用,但其确 切传导机制及在缺氧缺血后新生动物P75NTR对下游分子RhoA调控变化尚不清楚.该实验在建立新生大鼠缺氧 缺血性脑白质损伤(WMD)模型基础上,观察WMD新生大鼠脑白质P75NTR和RhoAmRNA表达变化,探讨WMD 时两者的关系及意义,为临床治疗早产儿WMD提供新思路和实验依据.方法制备新生大鼠WMD模型,光镜及 电镜观察脑组织形态学改变.应用免疫组织化学方法及荧光定量RT—PCR检测对照组及WMD12,24,48,72h和7 d组病变侧脑白质P75NTR蛋白及RhoAmRNA表达变化.结果光镜和电镜形态学发现WMD组缺氧缺血48h 后即有显着的脑室周围脑白质损伤.WMD组大鼠纹状体和胼胝体P75NTR蛋白水平12h开始升高,48h达峰值, 至72h略有下降,与对照组比较差异有显着性,均P<0.01,之后下降明显,第7天 与对照组比较差异无统计学意 义(P>0.05).WMD组大鼠脑白质RhoAmRNA表达12h开始升高,48h达到峰值, 与对照组比较,差异有显着 性,均P<0.05.72h仍高于对照组水平,之后开始下降,第7天与对照组比较差异无 显着性(P>0.05).结论 WMD新生大鼠脑白质中P75NTR蛋白水平呈现先上升后下降的趋势.其升高与 介导神经细胞凋亡和抑制神经轴 突再生可能有关,表达下降则与缺氧缺血性损伤加重神经细胞坏死相 关.RhoAmRNA的表达变化趋势与P75NTR 一 致,提示P75NTR水平升高可促使RhoAmRNA高表达.[中国当代儿科杂 志,2007,9(4):317—320】 [关键词】缺氧缺血;脑白质损伤;P75NTR;RhoA;新生大鼠 [中图分类号】R一33[文献标识码】A[文章编号】1008—8830(2007)04—0317— 04 ExpressionofP75NTRproteinandRhoAmRNAinthebrainofneonatalratswith whitematterdamage De—Yuan,CHENJuan,SHIJing,LIJin—Hui,YAOYu— Jia.DepartmentofPediatrics.WestChinaSecondUniversityHos— phal,SwhuanUnwersity,Chengdu610041,China(ChenJ,Email:chenjuan2000@163.com ) Abstract:0bjectiveRecentstudieshaveindicatedthatthesignalpathwayofNgR—P75NTR —RhoAplaysakeyrole innerveinjuryandremodeling,butitsexactmechanismandtheroleofthedownstreammolec uleRhoAregulatedby P75NTRremainunclearinhypoxia— ischemia(HI)neonatalanimals.Thepresentstudywasdesignedtoassessthe expressionofP75NTRproteinandRhoAmRNAinneonatalwhitematterandtoinvestigateth eirrelationshiDinnewbom ratswitllwhitematterdamage(WMD).MethodsTheratWMDmodelwasestablishedbytheligationofrightcommon carotidartery,followedby6%hypoxiaexposurefor4hrs.I'hecontrolgroupwassham— operated.withoutHItreatment. Thehistologicalchangesofbraintissuewereobservedunderlightandelectronmicroscopes. Expressi0nofP75NTRDrotein andRhoAmRNAinthebrainwhitematterafter12,2448and72hrsand7daysofH1weredetectedbvRT—PCRand immunohistochemistry.respectively.ResultsPeriventricularwhitematterdamagewasobservedby48hrsofHI. ExpressionofPr75NTRproteinincreasedinthestriatumandeallosumzonesat12hrs.peakedat48hrs.andremainedata hJigherlevelthancontroluntil72hrsofHIintheWMDgroup(P<0.O1).After7daysofHIexpressionofP75NTR proteinwasnolongerstatisticallydifferentfromcontrols.TheRhoAmRNAwashigherintheWMDgrouDforthefirst72 hrsandthendeclinedtocontrolvalues.ConclusionsIncreasedP75NTRproteinmightmediateapoptosisofnervece11s andinhibittheregenerationofneuronaxons.Thesubsequentdeclinebacktocontrolvaluemaybeeorrelatedwiththe aggregationofnecrosisofnervecellsafterHI.ThepatternsofRhoAmRNAexpressionwereconsistentwiththoseof P75NTRprotein,suggestingthattheincreasedP75NTRlevelmaypromoteRhoAmRNAexpressi0n. [ChinJContempPediatr,2007.9(4):317—320] Keywords:Hypoxia—ischemia;Whitematterdamage;P75NTR;RhoA:Neonatalrats [收稿日期]2007-02—10;[修回13期]2007—03—23 [作者简介]李德渊,男,在读博士研究生,主治医师.主攻方向:新生儿疾病. [通讯作者]陈娟,女,博士,副教授,l~lJtl大学华西第二医院新生儿科,邮编:610041. - 3l7? 第9卷第4期 2007年8月 中国当代儿科杂志 ChinJContempPediatr Vo1.9No.4 Aug.2007 脑白质损伤(whitematterdamage,WMD)是早 产儿神经系统远期后遗症的主要原因之一,而神经 细胞生长锥的崩溃和异常出芽,导致神经细胞间正 常连接的破坏和异常连接的出现,是WMD早产儿 神经系统远期后遗症的基本神经病理学改变. 最近研究发现NgR—P75NTR—RhoA信号通路在神经 元生长锥调控中起着关键性作用,已成为当前研究 的新热点.目前该信号通路确切传导机制尚不清 楚,但P75NTR起着关键作用,它调控分子开关 RhoA,进而影响神经损伤和重塑.本研究在成功 建立新生大鼠WMD动物模型基础上,采用免疫组 化和荧光定量RT—PCR方法检测WMD新生大鼠脑 组织P75NTR蛋白和RhoAmRNA表达变化,探讨两 者的相互关系及在中枢神经损伤后抑制轴突再生的 机制,为临床治疗WMD提供新思路和实验依据. 1材料与方法 1.1实验动物及分组 120只2d新生SD大鼠,雌雄不限,动物随机 分为12,24,48,72h和7d对照组及wMD组,每组 动物12只用于实验. 1.2动物模型制备和取材 参照Back等方法,将2d新生大鼠行颈正中 切口,分离并结扎右侧颈总动脉,缝合切口恢复1h, 然后置于含6%氧气和94%氮气混合气的缺氧舱中 4h(流量2L/rain),再放回常氧母鼠笼中饲养.对 照组仅分离右侧颈总动脉,不结扎,亦不作低氧处 理.分别于缺氧后12,24,48,72h和7d处死对照 组及WMD组动物,取脑组织固定,切取侧脑室周围 胼胝体,纹状体区用于P75NTR免疫组化染色及苏 木精一伊红染色,电镜观察.用于荧光定量RT—PCR 只需分离结扎侧脑白质,存于液氮中,留备RNA 提取. 1.3免疫组织化学法测定P75NTR水平 按照75NTR免疫组化染色说明,切片脱蜡水 化,室温孵育,抗原修复,羊血清封闭,滴加1:500 P75NTR(购自UPSTATE公司)一抗,滴加生物素化 羊抗兔IgG室温孵育,滴加SABC试剂,DAB显色, 苏木精复染.阴性对照片除用3%正常羊血清替代 一 抗外,余步骤相同.每张切片于同一部位随机取 2个视野采图,棕黄色为阳性表达,Imageproplus 4.5图像分析软件对图像进行分析,阳性结果选择积 分光密度(IOD)作为参数进行统计分析. 1.4荧光定量RT-PCR测定RhoA表达水平 将制备好的右侧脑白质按TRIzol说明书操作 抽提总RNA.2g总RNA用于逆转录反应,反应 体系2OL,包括Oligo(dT)18primer,H2O5×buff- er,NasinInhibitor,10mMdNTPmix,AMV等离心混匀 后42?孵育60min,70~C加热l0min后结束反应, 冰上冷却后一20?保存待用. RhoA基因序列行引物检索自NCBIGenebank, 上游弓I物:5一AATGTGCCCATCATCCTAGTT一3(128 bp),下游弓I物:5一TGTTTGCCATATCTCTGCCTT一3, 扩增产物长度为128bp.内参Beta—actin上游引物: 5一CCCAACACACTCCTCTCT-3,下游弓l物:5一AG— GAGCAATGATCTTGATCTT一3.引物由上海生工生 物公司合成.PCR反应体系30L,包括Taq 酶,RhoA及Beta—actin上下游引物,SYBERGreen—I 染料及cDNA模板等.扩增条件:94~C2min,94? 2OS,55oC30S,72oC40S,45个循环.扩增反应结 束后,绘制各反应管扩增动力学曲线,确定扩增循环 数Ct值,以13一actin作标准校正,计算产物相对量. mRNA的相对含量根据公式Foldchange=2一A (ACt),whereACt=Ct(target)一Ct(B—actin)andA (ACt)=ACt(treated)一ACt(untreated)计算. 1.5统计学分析 免疫组化IOD数据以均数?标准差(x4-s)表 示,统计学方法采用t检验和单因素方差分析q检 验,LSD法比较各WMD组两两间差异.荧光定量 RT—PCR统计以相对含量2Ac作为参数,以中位数 M(P.)表示,行秩和检验,分析工具为SPSS10.0软 件包. 2结果 2.1光镜所见 各时间点对照组纹状体和胼胝体细胞无明显变 化.WMD组随缺氧时间延长,病理改变越重.HI 后12h,WMD组侧脑室旁纹状体区细胞出现水肿; 48h出现核固缩,胼胝体细胞稀疏;72h可见侧脑 室旁白质呈筛网状坏死;7d可见侧脑室旁白质出 现疏松,液化灶.见图1A,B. 2.2电镜所见 对照组少突胶质细胞结构正常.WMD组缺氧 缺血后12h可见少突胶质细胞线粒体肿胀明显,线 粒体嵴减少;48h可见少突胶质细胞凋亡,细胞核 染色体边集,核膜完整,突起减少;72h可见少突胶 质细胞坏死,染色质分布不均,胞浆空,核糖体消失. ? 318? 第9卷第4期 2007年8月 中国当代儿科杂志 ChinJContempPediatr Vol,9NO.4 Aug.2007 一一图1对照组,WMD组纹状体细胞48h改变(A,B苏木精.伊红染色x400倍).A: 对照组细胞排列有序,细胞胞核大,胞 浆少;B:WMD组细胞排列紊乱,核固缩.(C,DP75NTR免疫组化染色x400倍).C:少 量免疫阳性细胞表达(如黄色箭头所指),胞浆 着色浅;D:WMD组大量免疫阳性细胞表达(如黄色箭头所指),棕黄色细腻颗粒弥 漫分布在胞浆内,少部分位于胞核,胞核浓缩深染. 2.3免疫组化染色结果 对照组各时间点纹状体,胼胝体区有P75NTR 蛋白的少量表达.HI后12h,右侧大脑纹状体,胼 胝体区阳性细胞表达增加,48h达高峰,可见大量 免疫阳性细胞表达,棕黄色细腻颗粒弥漫分布在胞 浆内,少部分位于胞核,着色深,细胞失去正常形态 见图1C,D.随之蛋白表达开始下降,至脑损伤后 72h仍保持较高水平,以上各组IOD值与对照组比 较差异均有统计学意义(P<0.01).脑损伤后7d 与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表 1,图2). 表1纹状体与胼胝体P75NTR免疫组化图像IOD值分析(X?S) a与对照组比较,P<0.叭;WMD各组间两两比较均P<0.叭 一纹状体 (Conlr~l 一纹状体 (WMD) 口胼胝体 (Control 口胼胝体 (WMD) 时间点 图2纹状体与胼胝体P75NTRIOD值变化 2.4荧光定量RT-PCR结果 各组在128bp位置出现一条电泳条带与待测 基因片段长度符合,证实产物为RhoA基因.WMD 组l2,24,48,72hRhoAmRNA扩增产物相对含量 2一AAQ均较对照组升高,均P<0.05,而7d与对照 组之间无统计学差异,P>0.05.WMD各组间 RhoAmRNA相对含量两两比较,差异有统计学意 义,均P<0.05,(见表2). 表2不同时段RhoAmRNA相对表达量与对照组比 较(M/P~o) 分组//,12h24h48h72h7d !:::!:::!::: Z一2.169—2.508—2,923—2.500—0.574 P<0.05<0.05<0.05<0.05>00 aWMD各组间两两比较P<0.05 3讨论 本实验借鉴Back等动物模型进行研究,在建 立2dSD大鼠WMD动物模型基础上,探讨WMD 新生大鼠脑白质P75NTR蛋白和Rho—AmRNA表达 变化.WMD的主要原因是缺氧缺血性脑损伤,而 缺氧缺血后诸多机制所致的神经细胞生长锥崩溃和 异常出芽,是WMD早产儿神经系统远期后遗症的 基本神经病理改变.NgR—P75NTR—RhoA信号传导 通路对维持神经细胞生长锥的正常形态和功能,起 着十分重要的作用.作为NgR共受体,神经营养素 低亲和力受体P75NTR传递中枢神经系统产生的髓 磷脂基生长抑制体(MBGIs)的生长抑制信号到胞 内,并作用于下游RhoA这一分子信号开关,通过一 系列细胞内信号传导最终作用于细胞骨架蛋白 F—actin从细胞膜表面特定位点脱落,导致生长锥塌 陷和崩溃以及新的,异常的伪足出现,产生神经元间 的异常连接J. 既往研究表明,P75NTR在中枢神经系统发育 阶段广泛表达,而生后表达明显减少,P75NTR表 达与神经元生理或表型关系到目前还没有明确,推 测与CNS发育过程中神经元选择性死亡有关J. ? 319? , ??如?如?如?如o 443322ll 遥口0H霉器医寿 第9卷第4期 2007年8月 中国当代儿科杂志 ChinJContempPediatr Vo1.9No.4 Aug.2007 有文献报道[7],成年大鼠急性前脑缺血早期(6h) 即可见到P75NTR阳性神经细胞表达增高,48h达 到高峰,7d后基本恢复正常.亦有报道,在体外 实验中,成年大鼠海马P75NTR水平在短暂缺血后 持续高表达.本实验通过建立WMD模型,采用免 疫组化法检测P75NTR蛋白的表达变化,结果显示 P75NTR蛋白在HI后12h开始升高,48h达到峰 值,72h开始下降,至第7天降至正常.这一趋势与 文献报道有所不同,可能与动物发育不同阶段及试 验的方法和检测途径不同有关.有关CNS损伤后 P75NTR基因上调的机制报道甚少,可能与脑缺血 后可引起许多即刻早期基因如c—fos,c-jun基因的过 度表达,编码转录因子,引起一些后效基因表达增高 有关.10J.诸多研究表明P75NTR的高表达与神经 细胞的凋亡有密切关系,这在成年大鼠的实验中得 到证实u.我们也注意到P75NTR的高表达时段 在HI后48h,正是WMD少突胶质细胞凋亡的高峰 时期,这在本研究的光镜及电镜形态学检查中亦得 到证实.而随着HI时间的延长,少突胶质细胞和其 他神经细胞的坏死加重,数量进一步减少,神经再生 又受到抑制,与P75NTR表达减少有一定的关系. P75NTR的高表达暗示缺氧缺血性脑损伤可能与神 经营养素受体的信号传导不平衡有关,P75NTR与 某些毒性蛋白结合能抑制细胞死亡和加速轴突延 伸,这将为开发新药提供新的药物靶位. 本实验亦对新生鼠HI后P75NTR下游信号分 子RhoA这一细胞肌动蛋白细胞骨架的重要调节因 子表达变化进行了研究.结果显示HI后12hRhoA mRNA开始升高,48h达到峰值,72h开始下降,但 仍高于对照组水平,至第7天降至正常.与成年动 物脊柱损伤相比,后者24h后才出现RhoA活性增 高Ll.本实验缺氧缺血新生动物RhoA表达变化 出现早,持续时间更长,这可能与新生动物的神经元 及少突胶质细胞发育不完善,对缺氧缺血损伤更为 敏感有关.RhoA在HI后表达变化与P75NTR的变 化一致,据此我们推测RhoA活化可能与P75NTR 的高表达有关.正如Dubreuil等?报道,脊髓损伤 后,神经胶质细胞和神经元RhoA的活化依赖于 P75NTR.在P75NTR基因敲除(P75NTR一/一)神 经元生长锥中RhoA活性和它的P75+/+同类相 比,其生长锥的GST—RBD着色减少了32%.也有 报道急性脑损伤后P75NTR基因敲除动物RhoA活 性直到72h之后出现增高,均证实了P75NTR在调 控RhoA活性中的重要作用Ll.但缺氧缺血性脑 损伤后引起RhoA表达升高的具体机制还有待进一 步研究. [参考文献] [1]BackSA.Pefinatalwhitematterinjury:thechangingspectrumof pathologyandemerginginsightsintopathogeneticmechanisms[J]. MentRetardDevDisabilResRev,2006,12(2):129?140. [2]DomeniconiM,FilbinMT.Overcominginhibitorsinmyelinto promoteaxonalregeneration[J].NeuralSci,2005,233(12): 4347. 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