腺病毒六邻体蛋白型间线性化抗原位点的研究

腺病毒六邻体蛋白型间线性化抗原位点的研究 腺病毒六邻体蛋白型间线性化抗原位点的 研究 中华实验和临床病毒学杂志2OO2年3月第16卷第1期Chin~』ExpClinVirol,March2002,VolI6.No 腺病毒六邻体蛋白型间线性化 抗原位点的研究 张霆辛若雷张勤包怡华昊建新 【摘要】目的对人类腺病毒(adenovirus,AdV)六邻体型间抗原位的特性进行研究.方法 通过计算机对腺病毒六邻体氨基酸序列进行比较分析,结合抗原性的预测结果和六邻体蛋白三维空 间结构的肽段暴露状态,选定了保守性抗原位点进行多肽合成或通过构建重组质粒达蛋 白.将合成 的六邻体肽段和表达纯化的蛋白抗原免疫动物后,用免疫印迹和间接免疫荧光方法抗血清的免 疫特异性结果免疫印迹分析显示,抗多肽抗体和抗重组蛋白抗体均与腺病毒的六邻体蛋白特异 性识别.阃接免疫荧光显示,腺病毒感染HeLa细胞核内荧光着色,并且抗血清有较好的腺病毒型间 反应性合成多肽抗体与含有相同肽段的重组蛋白抗原产生特异性结合.结论在腺病毒六邻体蛋 白中存在有线性化的型间抗原位点,台成的六邻体多肽和表达重组蛋白可用于诊断价值抗体的研制. 【主题词】腺病毒;抗原位电;合成多肽;基因表达 CharacterizationoftntertypespecificepitopesODadenoviruseshexonZHANGTing,XINRuolei.ZH ANG ?,BAOyihtm,WUat~ir*.CapitalInstitute矿,Beifing1000’20,China 【Abstract】ObjectiveTocharacterizetheintertypeepitopesonhumanadenovirus【HAdV)hexonMeth- adsBasedOncomputerizedattalyslsOiladenovimsessequenceofgenomlcalignment.antigenicitypre dictionand 3-Dstructurec[raraeterisliesofh~xonsuhunlt.severalpeptidesofhexonofadenovlmseschosentobesy nthe— sizedOYrecombinantpmtehlsofthehexonwei’~expressedinE.coilbyuseofPGEX-5X.Toidenttheexistence ofinte~ypeepJtopes.theantiseraraisedwithsyntheticpeptldes0rpurifiedrecombinantproteinswerean alyzedwith Westernblotandimmunof[uore.~ieentassayResultsTheresultsofWesternblotindicatedthatbothpepti deand recombinantantibodiesshowedspecificreactivitieswithboxonsdHAdV?3,4.7individually.Meanwhi le.typical stainoflmmun0n……foundonHeLacellsinfectedwiththeseHAdVbyincubationwithpeptideaswell asrecombinantantibodiesAlso.antibodiesraisedagaitlstpeptiderecognizedtherecombinanthexonpr oteinin whichacorrespondingregionofpep’idesw聃coveredConclusionMostofthepredictedinter~ypeepltopesof HAdVh~xonweFeexclusivelyfoundinsyntheticpeptidesandrecombinantproteinsTheseintertypeep ltopes owedtoheeoP,tio.UOUSandsequentialwhichcouldbeemployedfordevelopmentofantibodiesofdiag nosticuse. 【Keywords】Adenoviruses;Epitopes;Pepfides;Geneexpression 腺病毒(adenovirus,AdV)是引起人类呼吸道和 消化道感染的重要病原之一.在<5岁儿童的急 性呼吸系统疾病中,腺病毒引起的肺炎较为严重”, 在大规模流行时,其所导致的病死率较高.在人类 腺病毒感染中,大约50%引发相关的症状.用于诊 断AdV感染的方法有免疫荧光法和ELISA法,其操 作简单,灵敏性较高,还能弥补PCR诊断方法的不 足.在临床上,迫切需要对病毒感染性疾病进行快 速诊断,这有赖于特异性强的抗体.为此,我们通过 作者单位:100020北京首都儿科研究所北京市感染与免疫中 宴验室 . 论着. 计算机对腺病毒六邻体氨基酸序列比较分析,结合 抗原性预测分析以及三维结构图提示的多肽暴露情 况,选择性地合成和表达了若干个抗原性较强的多 肽,并对其具有的免疫原性进行丁初步分析,现将结 果报道如下. 1和方法 11病毒3,4和7型腺病毒购自中国预防医学科 学院病毒学研究所,常规培养. 1.2试剂质粒pGEX.5X.3购自Pharmacie公司, T-Vector购自生物公司.DH5a,BL21(DE3), pLysS为本室保存.所用的限制性内切酶均为Gibco 公司产品.IPTG,Glntathioneagarose及GST单抗购 中华实验和临床病毒学杂志2002年3月第l6卷第】期Chine~JEx口CllnViral,March2O02,Vol16,N0 自Sigma公司.异硫氰酸荧光黄(FITC)标记的羊抗 兔IgG抗体和碱性磷酸酶标记羊抗兔I异G抗体购自 华美公司. 1.3工程菌的培养及诱导表达pGEX.5X重组质 粒转化BI21,LB培养基中37?震荡培养,IPTG诱导 后离心收菌,超声裂解离心收集上清,过GST亲和 层析柱.还原型谷胱甘肽竞争洗脱目的蛋白,SDS. PAGE检测重组蛋白纯度. 14SDS.PAGE和Westernblot按本室建立的方法 操作,具体方法见参见文献[3]. 1.5动物免疫三组纯化蛋白与佐剂相混合,每组 免疫3只小鼠(100fig/只).两次加强免疫后放血, 收集血清,并置一20?冻存备用. 16间接免疫荧光法3,4和7型腺病毒感染He. Ia细胞制成细胞涂片,室温干燥后于80%冷丙酮中 固定;经PBS冲洗后加入一定稀释度的抗血清,于 37?湿盒中孵育45rain后,PBS洗三次,每次5min; 加002%伊文斯蓝稀释的荧光抗体,置37?湿盒中 作用45min,洗涤同前.封片后于荧光显微镜下观 察.同时设立正常兔IgG,正常细胞以及不加抗体的 空白对照. 1.7多肽合成和抗肽抗体制备由GeneMed公司 固相F—moc法化学合成HAdV.2六邻体保守区抗原 多肽,每个多肽含有10,20个氨基酸残基.经 HPLC纯化,将9个多肽混合成三组(A,B,C).每组 500ttg混合多肽与同体积的FCA乳化,于雌性家兔 背部皮下免疫.四周后,加强免疫一次.两周后试 血,两周后放血,收集血清,置一20?冻存备用. 2结果 21人类腺病毒六邻体蛋白基因与合成表达区段 的选择用Anthep~t50软件对HAdV.2六邻体抗 原性进行预测分析,在六邻体前段,中段有大量抗原 性高峰以及高亲水性峰区.综合抗原性预测分析三 维结构图,在HAdV.2六邻体同源区上选出9个肽 段,分别定位于暴露性的环区(1l1,I.2,L4)和相对暴 露的基部区(P1,P2)的同源性区域.将9个合成多 肽又分成三组(A,B,C),分别代表六邻体前段(L1), 中段(,P2)和后段(P1,P2,IA).免疫动物后共获 得三组抗肽抗体. 选择六邻体不同环区和基部区蛋白基因的937. I230及2167.2607编码序列.通过引物用PCR法, 从3型腺病毒感染的细胞中扩增出目的DNA片段, 定向克隆至原核表达载体pGEX.5X.3上,构建了重 组表达质粒pGEX.5X.3/HAdVf2及pGEX一5X一3/HAd. Vf3(表1).用重组质粒转化受体大肠埃希菌BL21, 诱导表达后经SDS.PAGE鉴定特异表达蛋白.利用 GST亲和层析柱纯化后获得相对分子质量分别为 36000和41000的可溶性蛋白(图1). 】:蛋白标准;2:纯化的表达蛋白2;3:pGEX一5X-3/HAdVf3诱导后. 4:pGEX-SX一3/HAdVf3诱导前;5pGEX一5X.3对照质粒诱导后;6: pGEX-SX一3对照质粒诱导前;7:受体苗诱导后;8:受体菌诱导前 围1重组人类腺病毒六邻体表选蛋白SDS—PAGE电林图 1:Mol~ularwei曲t2ReeombJ~tpro~eiapurified3:pGEX-5X-3/ HAdV~afterinduction4:pGEX-5X一3/HAdVf3befo~induction5:PI曲一 midconl~lPGEX-5X一3afterindueti~6:Plazmideon~olPGEX一5X一3 befo~indueti~7CellcontrolBL2lafterinduction8:Celle~tmlBL2I before[ncktction .1SDS?PAGE~alysisnfthe~mbinamp~teinHAd~ 衰1六邻体蛋白合成多肽和表达蛋白的基本性质 Tab.1Charactefsticsofsyntheticpepfidesand expressedproteinsofHAdVhexon P1108—119 Ll209-219 L1244—253 Pl372—383 pI404421 12543.560 Pl592.604 P275O-766 1.4837—856 L2.L2.P】3】3.4l0 L3.1.4,P2723—869 ?m蛐站 ;乌加?醯如虮北 ?眦阱”??一一一, 中华实验和临床病毒学杂志2002年3月第16巷第l期cneJEChnv】 ml,March2OO2,V0II6.No1 2.2重组蛋白抗体和合成多肽抗体对腺病毒感染 细胞的免疫荧光反应将重组蛋白抗体和抗肽抗体 对腺病毒感染的HeLa细胞进行免疫荧光检测,二类 抗体均能与3,4和7型腺病毒感染细胞发生特异性 反应,而正常培养细胞无着色(图版?).感染的细 胞核内有散在的呈颗粒状的绿色荧光染色或整个细 胞核被染色,其中重组蛋白抗体的荧光滴度高于合 成多肽抗体(表2). 裹2合成多肽和表达蛋白positivenfade~vLm+{rLd’0|】 ?*Flu,rcscentrea~li~negative 2.3重组蛋白抗体和合成多肽抗体对腺病毒六邻 体蛋白的反应性取化学裂解法制备的腺病毒感染 细胞的裂解物,经SDS.PAGE分离蛋白,电转到硝酸 纤维索膜.Westernblot结果表明,抗肽抗体和重组 蛋白抗体在1:500稀释度时均与HAdV一3,4和7型 相对分子质量为1160OO的六邻体亚单位发生反应. 二类抗体与正常细胞未见有阳性反应(表3).表达 六邻体蛋白为抗原上样,Westernblot显示,C组混合 多肽抗体与2号表达蛋白反应(图2). 3讨论 一 般认为,抗原位点由6个左右氨基酸组成,其 取决于多肽的一级结构或空问构型,而且在蛋白质 分子内部的抗原位点只有在暴露后才能表现出其抗 原性.运用计算机分析抗原位点,往往是综合考虑 肽段局部的亲水性,柔性,二级结构以及抗原位点的 可接近性.因此,计算机预测抗原位点对于抗原性 强的多肽或表达蛋白有着重要的指导意义.. 腺病毒六邻体是病毒的主要抗原蛋白,含有型, 型间,组特异性抗原表位及中和性抗原表位,但大部 分抗原位点在蛋白的一级结构上尚未最后定位.一 般认为,在三维结构图上,型特异性抗原位点主要定 位于六邻体的环区7个高变区内.型问特异性抗原 表位定位于高变区之间及基部区表面的同源区域, 这些表位是不同型别腺病毒六邻体所共有,不受人 类腺病毒亚属分组的影响.型间特异性表位可 以作为腺病毒的特征性标志,作为抗原靶位点用于 腺病毒感染的快速诊断. 23123MMr(×】01 ABC l8 90 70 55 38 M:相对分子质量标准;A:台成多肚A组抗体;B:台成多肚B组抗 体{c:台成多肚c组抗体;1:表达蛋131;2:表达蛋白2;3:对照牛 血清白蛋白 圈2用免疫印迹法检测音成多肽抗体对 H.~IV表达蛋白的反应性 M:Mol~ularwei曲tA:Antil:s~diesrai~dwithsymhe~icpeptidegroupA B:,Mtlibodlesraisedwiths1.a1]tetiepeptidegroupB.C:?mtibodiesraised withsyntheticpepfidegroupCt:Re~mbinantproteint.2:Recombinant protein23:BSA舶control Fig.2W~temmanalysis0f~acfivifiesofsyntheticpeptide anfbodi~*dth…bln口tproteinofHAdVbon 表3免疫印迹检测多肽抗体和表达蛋白抗体 对腺病毒六邻体蛋白的反应 Tab.3aeactivifiesofpeptideandrecombinantproteinantlsera toFbXdVhexonbyWe咖皿blot 组别 G删? 苎!竺常目血}奇 A组B组c组表连蛋A1表过蛋A20?r-a【 cecc…一 3型嗥病毒 npe3aden0~ 4型腺病毒 Tvpe4atte~ims 7型腺病毒 Type7a啪 HeLa细胞 HeL日cell *指荧光反应阴性 n—sl1?nev 扣 盛 宴 垃 再 蠹 羊 条 吉 华实验和临床病毒学杂志2002年3月第16卷第1期—jExpClJnViii,March200”2,Vol16,No 对引起呼吸道感染的HAdV一2,3,4,5和7型六 邻体氨基酸序列进行比较分析发现,不同型别的腺 病毒六邻体有很高的同源性(78%,95%).其同 源性区域主要集中在基部区(PI.P2).在环区(LI, 12,L4)的高变区之问亦存在一定的同源性区域., 型间与组特异性抗原表位定位于这些同源性区域 这些区域2/3保守性残基是疏水性氨基酸.对维持 六邻体的空间结构具有重要作用. 用Antheprol软件对HAdV一2六邻体抗原性进行 预测分析.在六邻体的前段和中段有丰富的高抗原 性峰及较密的高亲水性峰区域.六邻体的前段和 中段主要是由环I,环2及P1区组成,并且在六邻 体的三维结构图上位于三角形顶端(LI,t2)和基部 区表面(P1)的区域,在病毒颗粒表面处于易接近的 位置该区域含有大量的保守性区域,可能具有较 高的抗原性及很好的暴露性,并期望是型间特异性 表位:因此,我们选择HAdV.2六邻体的9个抗原 位点,分别位于环1,环2,环4,P1和P2区的同源性 区域将9个多肽分成三组(CPI,CP2,CP3),免 疫动物,制成抗多肽抗体,分别代表六邻体前段,中 段和后段同源性区域的抗原特性.同时,选择克隆 了六邻体蛋白基因937—1230及2167.2607编码序列 并进行表达,此两区域所涵括的预测抗原位点在呼 吸道腺病毒间具有很高的同源性.在腺病毒颗粒上 可能具有较好的暴露性并可能含有型间或组特异性 抗原表位 用免疫印迹方法和免疫荧光检测二类抗体,结 果发现这二类抗体均能与3,4和7型腺病毒抗原发 生特异性反应,表现出一定的交叉反应性.表明重 组蛋白或合成多肽所含有或代表的特异性表位,在 不同型别的腺病毒问有很高的同源性,并且具有较 高的免疫原性,免疫后可诱导动物产生腺病毒型问 反应性抗体 免疫印迹结果显示在变性的条件下,腺病毒六 邻体三聚体裂变成相对分子质量为I16000的六邻 体亚单位,并仍具有与抗肽或抗表达蛋白抗血清较 强的免疫反应性并且抗合成多肽抗血清仅与涵括 有相应胩段的重组蛋白抗原发生免疫反应.昕合成 多肽表位,其基因在表达后的空间构型可能发生变 化,但抗原性位点依然存在.这两项实验结果提示 了两种抗体识别的抗原表位具有线性化特征,与我 们预期结论基本一致 既往,对腺病毒六邻体的抗原性分析以及抗原 位点的确定,主要是通过抗六邻体抗体与腺病毒抗 原反应,根据抗体的交叉反应性模式确定腺病毒六 邻体的抗原性以及抗原表位分布情况.本实验结 果表明,应用计算机进行腺病毒基因保守区域的确 定和抗原预测分析,可以有效地实现线性化抗原位 点的合成或表达,从而可制备出特异性高的抗体,用 于病毒抗原特性的分析和诊断试3ZhangT.M…cCA.MitchellLA.etalDetectionofrubella”nJ specific…】?.buhnc(I占G).1gM丑rIdT丑rI[Ib0di酷by…bob】m 柚ahsJCllnMierobio1.I992.30:824-830 4ChingWM.Wyc~owskC,BdL町,Hallmmct_.川innn~a withtpepfid~ec~rrespoedingtothestrucnnIproleln~gionof hepatitisC*SinsP瑚iN’~LAe?dsc【USA.I.89:31~O-3l96 5Bm~ttHM.The帅tuof?de~qras.In:C16uW.Bmnet~HM. OxfordNY.edsSlnteturalBi01ofrinses209?233 6‰odCI—CromptonJ,HayRTAnfipeptlde8e『adefineneutral- iringepit~sDnthead~*SmshexonJGenVirol,1992,73:1429? 1435 i~TH…q…ofad~mo? …type7andcomparisonwithmh叮s州?…ofb”usBR vj.1呻5.146:383-3船 10CekoCL.Whetat~CA.SharpPA.Aden~,irush…口?b- bodythatisgr~pspeeifiepotentialnsofu]asdia~aosfierenIJ ClinMiembirJ.1螂.】7:360-364 (收稿I:1期:2001.09-18) 本刊承接国内外与医药卫生,医学病毒学,医疗器械有关的产i ;品及生物技术产品,保健品的广告业务.i