人乳头瘤状病毒HPV感染与抑制癌基因p16突变在食管鳞癌中研究（可编辑）

人乳头瘤状病毒HPV感染与抑制癌基因p16突变在食管鳞癌中研究（可编辑） 人乳头瘤状病毒HPV感染与抑制癌基因p16突变在食管 鳞癌中研究 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师 或指导小组 的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则，承担相应法律责 任。 (。0蠢I ?? ‘??? ‖? 二级学院领导盖章: ’ 研究生虢蚜导师繇 0吖乙年弓月3，D日 河北医科大学研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写， 文责自负。 研究生躲射 b日 刷篡0冀日沙fL年;月(j 灿lllllIllIll|111llll||l||l„1|111111II四 05802 Y21 目 录 中文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 6突变在 研究论文人乳头瘤状病毒 肿V 感染与抑癌基因p1 食管鳞癌中的研究 前言„„„??„„????„„„„????„„„„????„????„????„“„””„“„„“7 刚吾„„„““„”„„„„”„„„„”„“„”„“„””„“„„“, 材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„7 结 果??????????„„??„„„„„??„„„????„((„„„((”„??„”一一“„((。16 8 附图„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 讨 仑??„„„„„„„„„„„„„„„??„??„„„????„„一„„“26 结论„„„„„„„„„„„„„„„„„“((„„„„”„„„28 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„28 6突变在食管鳞癌中 综述 人乳头瘤状病毒 HPV 感染与抑癌基因p1 相关研究的进展„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„31 致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„44 个人简历„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„45 中文摘要 人乳头瘤状病毒 HPV 感染与抑癌基因p16突变在 食管鳞癌中的研究 摘 要 背景:食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，死亡率较高。发病率有 明显的地区特点，河北省中南部，太行山地域及河南省北部是本病世界 发病率最高的地区，其组织类型主要为食管鳞癌 95, 。本病早期症状 不明显，易被忽视，早期治疗预后较好，中晚期患者占大多数，症状明 显，预后较差，因此针对此病的病因学研究成为预防、早期诊断、治疗 的关键。人乳头瘤病毒 HPV 自20世纪初被发现以来，其与多种肿瘤 的关系陆续得到确认。以宫颈癌为例，现已开发出针对HPV感染的相关 疫苗，这成为宫颈癌预防上的一座里程碑。1982年S ，l ianen首先提出 HPv感染与食管癌的发生有关，1987年我国学者周健等首次在国内进行 食管鳞癌与HPV感染关系的研究，之后困内外学者针对HPV感染和食 管癌的关系进行了大量研究，发现在一些地区，HPV感染与食管痛有 关，在另一些地区，二者之间则无关，甚至同一地区，不同研究方法和 研究人员都会得出相反的结论，因此，HPV感染与食管鳞癌之间的关系 6基因是近年来发现的一种新型抑癌基因，是第一种 仍未得到确定。p1 能作刚于细胞周期的抑癌基因，其在肿瘤发生发展中的作用逐渐受到重 6基因 视。p16基因在肿瘤发展过程巾发生改变，究竟是何原因导致p1 发qj变异，HPV感染是否是导致食管鳞癌中p16基因变异的原因仍未得 到证实。 目的:本研究旨在应用聚合酶链反应技术 PCR 联合DNA探针技 术对河北省中南部地区食管鳞癌患者HPV感染情况进行研究，以明确二 者之间的关系，为进一步研制HPV疫苗提供依据。本研究应用单链构象 6基因第二外显子突变进行初筛，以明确 多态性 SSCP 技术对标本p1 其在食管癌发病过程中的变化以及HPV感染与p16基因突变的关系。 方法:对47名河北省中南部地区食管鳞癌患者以及37名河北省石 DNAmini kit试 剂 家庄+m健壤志愿者食管组织进行取材，采用QlAamp ARRAYl-1PV Test试剂盒对 禽提取组织DNA，应用LJNEAR Genotypiilg 中文摘要 内对照，检测DNA质量。除试剂盒阳性、阴性对照外，同时采用mV 阳性宫颈癌组织做阳性对照，DEPC水做阴性对照，并采用船VE6基因 引物对标本DNAmV感染情况进行复检，排除由于实验操作、污染、 技术、设计等问题造成的假阴性及假阳性结果。mV感染检测完成之 后，使用标本DNA进行SSCP分析:应用p16基因第二外显子引物对组 引物分为三段进行设计 ，PCR产物加入变性液后高温变性5分钟，然 后立即骤冷保持DNA单链状态，进行4?恒温非变性聚丙烯酰胺凝胶电 1 泳，电泳结束后银染观察结果。统计学分析采用SPSS3(O及SAS8(O完 成。 结果: 1食管鳞癌患者中HPV感染率O,，正常对照组HPV感染率为O,，试 剂盒阳性对照呈现i5订性，宫颈癌标本HPV感染呈现阳性，食管癌患者中 HPV E6基因为O,，正常对照组HPVE6基因为O,，宫颈癌标本mV E6基因为附陛，此结果和试剂盒检测结果一致。 6第二外显子基因缺失率为O,，基因突变率为 2食管鳞癌患者中p1 44(7,。正常对照组p16第二外显子基因缺失率为0,，基因突变率为 o,。以病理分期为标记分组，采用k个独立样本的非参数检验方法检验 ,fi同病理分期的p16基因是否呈现差异;结果显示，渐近显著性p值为 O(035，卡方值为6(691，认为痫理分期越晚，p16第二外显子基因突变率 越商。 6基因第二外显子在食管鳞癌中与性别、年 3采用Pearson相关分析，pl 龄、吸烟史、饮涌史、家族史及淋巴结转移的渐进显著性p值分别为: O(496、0(143、O(000、O(547、O(113、O(005。 6基因变异是否 有 4以HPV感染为标记分细(，检验HPV感染与否与p1 与p16基因第二外显子在食管鳞癌中的变异无关。 结论: 1中(国河北省中南部地区HPV感染与食管鳞癌无关。HPV感染可能不是 食话;鳞癌的病冈。 中文摘要 2 p16基因第二外显子基因变异与食管鳞癌有关。 3食管鳞癌病理分期越晚，p16基因第二外显子突变越明显。p16基因第 二外显子突变与患者吸烟史及淋巴结转移情况有关。 4船V感染可能并非食管鳞癌中p16基因第二外显子突变的原因。 关键词:食管鳞癌;HPV;p16基因 英文摘要 and Human Theresearchabout papilloma cellcarcinoma mutationin esophagealsquamous p16gene ABSTRACT the isoneofthemost carcinomaof esophagus Background:The insouth with inChina common mortality(ThepreValence malignancies high ofHenan andnoIrth mountains ofHebei proVince Taihang province，the is oftheword(The isthe esophageal re mainlyhistologicaltypes gions hi曲est ofthisdiseasearenot ceU symptoms carcinoma 95, (Theearly squamous treatment and overlooked(An appropriate obvious，and earl ，diagnosis easily when areinadVanced ofthe leadabetter stage prognosis(Mostpatients of Sothe reasonof whichisthe preVention diagnosed， poorprognosis( to are andtreatment VerylmportantlmproVe etiologyearlydiagnosis assoclatewlth demonstratedto prognosis(Humanpapilloma、m’us HPV was ofthe20th foulldatthe tumoursinceitwas century(For manV beginning is forthe Human necessar 7 example， papillomavirus HPV infection Vaccine successofHPV forcervicalcancer(The develoDment proph 7lactic cancer ofhulllankind( milest011eofcervical isthe develoDment preVention in HPVandESCC onthelinkbetween the氕rstreseal’c11 Svrianencomplete f-orthenl’sttinlein didthesaJneresearch like 1982(SomescholarsZhouiian bet、veenHPVand workoutthe ESCC，much in1987(To China relatjonship f(oundthatin andabl’oad(Therasearches beendoneathonle researchhas anotherareathe ofESCC(Butin HPV bethereason areathe some might methodsand aerathedif佗rent inthesarne contrary(Even resultmight between the coulddif(ferent researchersget l‘esults(Theref-ore，relationship l6 new notbeen hasstill HPVinfectionandESCC connnned(pgene，a thefirstonewhichcall in ofthetulnor member suppressorgenespeople，is ln andmore role cell a1110re actsatthe preVentlng lnlportant cycle(Itplays reason tulllourcell(Butwhatisthe 16 in isknownthat cancer(It change p gene f(orthe inESCC? inf’ecti011tjlereal1’eason HPV ofthe change chan2e?Is 英文摘要 chain use reaction PCR applicationpolymerase Objectives:Thisstudy ofHPVinfectionin todetectthesatuation DNA technologies joint probe forVaccine basis areaofHebeiand允rther ESCCinsouthcentre provide use chain reasearchalso P01ymerase development(The screenthe cancer strandconfomation esophageal polymo巾hism sscp to andtoworkout for the ofl6 exon2 andcontrol findingchangep gene groups HPVinfection andthe between intheESCC the relationship change process andESCC( SCC came仔omtwo Methods:Thetissue samples groups(EsophageaI fromsouthem of47 from wereobtained samples surger ，specimenspatients micosawereobtained thecontr01 ofHebei area esophageal province(In group f(romthe of volunteerswhocame from37 city healthy endoscopically DNA(AndHPV wasusedtoex”act DNAminikit Shijiazhuang。QIAamp TestkitoftheDNA( ARRAYHPV wasdetectedwithLlNEAR Genotyping additionto a1controltoensureDNA wasusedasintem quality(1n 6一Globin cen7jcalcancer ofthe and control the kit，HPVpositiVe positivenegative controlandDEPC usedas the water，the tissreswere negatiVe positive 16 E6 DNAwasdetectedHPV contr01(HPV p genes using geneprimer tothree toenhance usedto the exon2 primer parts primers、、jas PCR design with intoPCR hightemperature degenerationproducts sensitiveness ，andjoin DNA of for5minutes(The to gel degeneration electrophoresispolyacrylamide methodwas stain outin4?(Af:[erthe wascarried electrophoresis，silVer wasconductedSPSS usedtoviewthe using expression(StatisticalanaJysis 13(OandSAS8(O( Results: cellcarcinoma rateofHPVwas0,in 1 Theinfection esophagealsquamous the Vecontrolofthe control in the kit， positi group，positiVe patients，0,in wasO,in E6 inthecervical geneexpression positive specimen，HPV cerVicalcancer control the 0,inthe cancer，and group，positiVein esophageal samples is mutationrate Deletionu’as0,incontrol Pl6exon2 2 2ene group，the 5 英文摘要 16exon2 mutationratewasO, incontrol Deletionwas O,，the 44(7,(p gene the of16 inthe testwasusedtodetect group(Rank―sum changep gene showedthatthe different Theresults ficant path0109icalstage asymptoticsigni was 12(738(Theresultsshowedthatthe Value valuewas O(002，chi-square Va“ation( later 16 exon2 stages，the pathology higherp gene be、Vteen16 3 Pearsonrelated gradualsigni丘cant p genes Using analysis，the exon2of patients’age，gender，smokinghistory，drinkinghistory， f(amily nodemetastasis histo巧andlymph O(005( 4 detectthe betweenl 6 exon2andHPV To inf’ ection， relationshipp gene Fisher methods showedthat exactly analysis p O(05( Conclusion: 1 Inthesouthcentreofhebei in cell theesophageal China， proVince squamous carcinomaandHPVinfectionisirrele、7ant(I PVinfectionnotbethe may reasonof cellcarcinoma( esophagealsquamous 2 l6 exon2andESCChaVesome relationships( p genes more16 exon2 3 Thelater ofESCC ，thep genes Esophageal patholog 7stages 16 exon2 hi node and mutations(pgenes patientsslnokingsto叫andlymph metastasishaVesome relatiollships( of 6exon2mutations( 4HPVinfectionisnotthereason1 1 16 Key?70rds:ESCC;HPV;pgene 6 研究论文 6突变在 人乳头瘤状病毒 HPV 感染与抑癌基因p1 食管鳞癌中的研究 (^上--J一 刖 舌 食管癌是一种恶性程度高、死亡率高的消化道恶性肿瘤，在我国癌 症发病率中居第四位，以食管鳞状细胞癌多见 95, 。患者早期通过 手术治疗，预后较好，但由于早期无明显特异性症状，常被忽视，一旦 出现相关症状，如吞咽困难，吞咽痛，胸骨后疼痛，声音嘶哑，体重下 降等，已是中晚期，预后较差。因此针对其病因进行预防成为当前研究 的重点。 食管癌的病因学研究目前已取得较大的进展，但尚未完善。20世纪 初HPV首次被人类所认知，通过一个世纪的努力，HPV感染与宫颈痛 982年HPV 之间的关系则已经确定，并已研制出相关疫苗进行预防，1 感染首次进入食管癌病因学研究的范畴，1987年我国学者第一次研究 HPV感染与食管癌之间的关系，通过近30年的研究，目前HPV感染在 食管癌病因学中的地位仍未确定，各种研究之间结果各异，而食管痛的 发病率和夕E亡率仍居高不下，如HPV被证明是食管癌的瘸因，那么就可 进一步针对感染型别进行疫苗的研制，从根本上降低食管癌的发病率。 p】6基因是第一个被发现作用于细胞岗期的抑癌基因，其与恶性肿 1 6基因变异在食管癌中也 多 瘤之间的关系越来越得到研究者的关注。p 有报道，究竟是何种凶素导致p16基因发生变异，HPV感染是彳、 是原因 之一仍不可知，本实验应用PCR结合DNA探针技术对食管鳞癌中HPV 感染情况进行探索，并应用sscp技术对p16基因第二外显子变异情况进 行研究，从而明确其在食管鳞癌中的作用，为临床预防、诊断提供依 据。 材料与方法 1材秘 研究论文 1(1组织标本 本研究采用病例对照研究方法，病例组标本为食管鳞癌组织标本， 均经由患者同意，并通过伦理委员会审批，采白河北医科大学第四医院手 术切除新鲜标本。用O(5mlRNAlater迅速完全浸泡，(80?超低温冰箱冷 冻保存。 正常食管组织标本均经由健康志愿者同意，并通过伦理委员会审 批，采自河北医科大学第四医院食管镜室。用O(5mlI?A1ater迅速完全 浸泡，(80?超低温冰箱冷冻保存。 HPV阳性宫颈癌组织标本经由患者同意，并通过伦理委员会审扎匕，。 采自河北医科大学第四医院手术切除新鲜标本。术前己确诊为HPV阳 性。用O(5mlRNAlater迅速完全浸泡，(80?超低温冰箱冷冻保存。 所有标本均来自中国河北省中南部地区。 根据统计学计算样本含量，病例组共取47例，对照组共取37例。 9例，女性18例，男女比 岁，平均年龄为61(64土7(25岁。对照组男性1 瘤平均分期:2(72土O(498。两组性别分布经X2检验 F O(1 13，p (7365 0 O(05 无统计学意义，两组性别分布无差别。两组年龄分布经两样本t 检验 p O(05 ，有统计学意义，说明两组年龄分布有差别，经 6 基冈 pearson相关性分析，证实年龄与本实验所研究的HPV感染及p1 变异无关 p O(05 。 1(2仪器 数显水浴恒温振荡箱 SHA―C型 江苏省金坛市江南仪器厂 PCR仪 VERlTI型 美国ABI公司 德国Heraeus公司 低温高速离心机 TTICH一400型 (20?低温冰箱 青岛海尔公司 (80?超低温冰箱 日本三洋公司 核酸蛋白测定仪 NANODROPl000型 美国NanoDl。op公司 凝胶成像系统 美国Image公司 DYY(6C型r乜泳仪 北京市六一仪器厂 上海l 1达陕学应用研究 黟j ZD一11Ib快速生物医学实验仪 研究论文 DYC(24EN电泳槽 北京六一仪器厂 似(1050恒温循环器 河南兄弟仪器设备有限公司 DYY(1 OC型三恒电泳仪 北京六一仪器厂 JA2003N电子天平 上海上平仪器公司 790 1型电磁搅拌器 上海华光仪 器仪表厂 85(2B恒温磁力搅拌器 金坛市医疗仪器厂 单道可调移液器 O(1(2(5u1 德国eppendorf公司 单道可调移液器 O(5(10u1 德国eppendorf公司 单道可调移液器 10(100u1 德国eppendorf公司 单道可调移液器 20一200u1 德国eppendorf公司 单道可调移液器 100一looOul 德国eppelldorf公司 1 OuI带滤j签无菌盒装短吸头 美国 AXYGEN公司 200u1带滤芯无菌盒装黄吸头 美国AXYGEN公司 l000u1带滤芯无菌盒装蓝吸头 美国AXYGEN公司 1(3主要试剂 蒸馏水 河北医科人学第四医院制剂科 DNAMinikit 250 QIAamp 德国QIAGENE公司 LINEARARRAYHPV Test 美国Roche公 司 Genotyping 白色体系 美国 Promega公。司 DEPC才 美国Promega 公司 30,聚丙烯酰股溶液 上海 双螺旋公司 Alfa 硝酸银 99(9+, Aesar公司 琼脂糖1009 Invitrogen公司 TEMED】001111 美国sigllla公司 溴酚蓝52 美国Amresco公司 二甲苯蓝l g 美国s酒11a公司 其它试剂为国产分析纯 2方法 2(】食管组织标本取材 预先将冻存鹤;高压灭菌，烤箱56?烘干备用。超净台内将RNAlater 何个冻存管rfl分装0(5111l，4。C侏存。食管纷f驯ji4二墩材时选取手术切除 研究论文 的新鲜食管鳞癌标本 术前食管镜已活检病理确诊 ，使用无菌剪刀， 快速剪取癌组织约黄豆大小，迅速浸入装有RNAlater的冻存管中，并立 即送(80?超低温冰箱冻存。正常食管标本取材时选取健康志愿者，使用 组织，迅速浸入装有RNAlater的冻存管中，并立即送(80?超低温冰箱 冻存。 宫颈癌组织标本同食管癌组织标本处理法。 2(2食管组织HPVDNA分型检测 2(2(1 DNA提取步骤 1 将冻存管取 用QIAGENE公司DNA提取试剂盒提取DNA。 出，室温放置，直至管内RNAlater彻底融化，用无菌镊子将组织块从 RNAlater中取出，用目艮科剪剪下一小块组织 约绿豆大小 ，剩余细(织 2 加入l 菌的大EP管中，用眼科剪将其尽量剪碎。 80ulATL，加入 20ul蛋白酶K，盖上盖子，放在涡旋振荡器上振荡混匀，放入56?1亘温 一般1(3小时即可完成 水浴箱中进行组织裂解，直至标本彻底裂解。 0 5秒，70。C水浴l 此步骤 3 低速瞬时离心，加入200ulAL，涡旋l 分钟，加入200ul无水乙醇，涡旋15秒，将大EP管巾所有液体移至收 集管中，加入500ulAW1，室濉8000转离心1分钟，取出后弃去收集 0800转离心6 管，将吸附柱放入新的收集筒:中，加入500ulAW2，室温1 分钟，弃去收集管，将吸附柱放入新的收集管中，室温全速离心1分 钟，弃去收集管，将吸附柱放入无菌大EP管中，加入1ooulAE室温放 置1分钟，室温8000转离心1分钟，弃去吸刚柱，(20?保存大EP管中 的DNA提取液。 2(2(2 DNA浓度和纯度的测定 用1ulDEPC水将核酸测定仪初始化调零，取1ulDNA样r钎，进行检 2(O之间说明DNA纯度较高，提取过程正确，无蛋白质等污染。可用于 后续实验。 2(2(3 PCR扣。增 研究论文 ―――――――――――――――――――――――――――――――― ――――――――――――――――――――――一一 PCR扩增采用Roch公司的LINEARA对认Y船V Test， Geno妙ping 系如下: 聚合酶链反应 PCR 体系 100u1 试剂名称 体积 50ul 。工作液 5ul 萎样本DNA 45ul 管AE 共计 1 00ul 50ul 对工作液 照阳性,阴性对照液 50ul 管共计 100ul P 应条件 ?预变性2分钟，95?预变性9分钟，循环参数:95?变性30 秽 ?退火1分钟，72?延伸1分钟，共40个循环，升降温速率 50,。72?终末延伸5分钟，72?保存。升降温速度 。 2(2(4 HPV DNA分型I令测 将PCR产物从PCR仪中取出，迅速J]口入1 00u1DN，并用移液器充 分混匀。使PCR产物充分变性。 打开水浴篇进行力H热至53?，将SSPE和SDS放入37?水浴箱中至 充分溶解，备用。 Buf隆r 1 配锈!?701(king Hybl(idization00个样,4丈量 试剂名称 体积 SSPE 100ml 三蒸水 388m1 SDS 12(5ml 共计 500(5m1 ―――――――――――――――――――――――――――――――― ――――――――――――――――――――――一一 AmbjentWash Buffer 1 酉己制Working 00个样本量 试剂名称 体积 研究论文 SSPE 133ml 2520ml 三蒸水 SDS 13(3ml 2666(3ml 共计 AmbientWash Wash Buffer:从Working 配制WorkingStringent Buffer中按照每个样本5ml的量取出。放入无菌烧杯中。 Wash Buffer放 将WorkingHybridizationBuffer和WorkingStringent 入53?士2?的水浴箱中备用。 CitrateBuffer 1OO个样本量 配制Working 试剂名称 体积 CIT 25ml 475ml 三蒸水 500ml 共计 将HPv检测条用无菌镊子取出，标记，依次放入24孔板内，每孔 Buffer，按编号依次加入75ul 内加入4ml预热的WorkingHybridization 变性的PCR扩增产物，振荡混匀。盖上盖子后将24孔板放入53?士2? 水浴摇床内，60RPM振荡30分钟。 配制Workil(19Conjugate 100个样本量 试剂名称 体积 1(5ml SA(HRP AmbientWashBut’fer500m1 Working 501(5ml 其计 将24孔板从水浴摇床中取 I，『 j真空泵将孔内的液体吸干。每孔加 入4ml AmbientWashBuffer，前后振荡3―4次后，立刻用真空泵 Worl in2 WashBuffer， 将孔内液体吸干。每孔加入4nll预热的Wol‘kingStringent 盖上盖子，放入56?士2?的水浴摇床中，60I冲M振荡15分钟，真空泵 吸干孔内液体，每孔加入4m1 WorkingConjugate，盖上盖子，室温摇床 60I计M 孵育30分钟。真空泵吸干孔内液体，每孔加4mlWo水in2 Amb;c11t、、，ash 研究论文 Wash Ambient 孔加4ml Working AmbientWashBuffer， 钟。真空泵吸干孔内液体，每孔加4m1 Working Citrate Buffer，盖上盖子，室温摇床 60I冲M 孵育5分钟。 Working Substrate 1OO个样本量 配制Working 试剂名称 体积 SUBA 400ml SUBB 】00mJ 500ml 共计 本试剂避光保存 真空泵吸干孔内液体，每孔加入4ml Substrate，室温摇床 Working 60RPM 显色5分钟。真空泵吸干孔内液体，每孔加4ml三蒸水，将 HPV检测条用无菌镊子夹出，置丁洁净平面，读取结果。 2(2(5读取检测结果 将HPV检测条置于比对卡中心的缺口内，并将检测条上的黑色条带 色情况。 2(2(6阳性对照复检 本复检采用HPVE6基因进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分离检 测。 采用引物序列为上游: 一F游 试剂名称 体积 1Oul 白色体系 6u1 DEPC水 2u1 DNA模板 1ul E6基因上游引物 1ul E6基因下游引物 20ul 共计 研究论文 反应条件:94?预变性5分钟，循环参数:94?变性45秒，55?退 存。 PCR结果采用2,琼脂糖凝胶电泳分离，扫描成像，用凝胶成像分 析系统进行分析。 2(3 p16基因突变情况检测