年产三百吨螺旋霉素发酵生产工艺设计论文 定稿（可编辑）

年产三百吨螺旋霉素发酵生产工艺论文 定稿（可编辑） 年产三百吨螺旋霉素发酵生产工艺设计论文 定稿 年产三百吨螺旋霉素发酵生产工艺设计 目录 引言 - 2 - 1菌种的选育 - 3 - 1.1材料与 - 4 - 1.1.1出发菌株 - 4 - 1.1.2 培养基与培养条件 - 4 - 1.1.3发酵效价测定 - 5 - 1.1.4诱变处理 - 5 - 1.1.5豆油耐性变种的选育 - 5 - 1.1.6缬氨酸诱导变种的选育 - 5 - 1.2 预计结果 - 5 - 1.2.1豆油耐性变种的选育 - 5 - 1.2.2缬氨酸诱导变种的筛选 - 6 - 1.2.3菌株 XC 4-18的遗传稳定性 - 6 - 1.2.4菌株 XC 4-18与菌株XC 1-19的生产水平比 - 6 - 1.3原因分析 - 6 - 2种子的扩大化培养 - 6 - 2.1孢子制备 - 7 - 2.2种子制备 - 7 - 2.3种子培养 - 7 - 2.4种子质量的控制 - 8 - 2.5种子质量的控制措施 - 8 - 3培养基的设计 - 8 - 3.1碳源 - 9 - 3.2氮源 - 9 - 3.3无机盐和微量元素 - 9 - 3.4生长因子 - 10 - 3.5水 - 10 - 3.5前体物 - 10 - 4灭菌 - 10 - 4.1连续灭菌及设备 - 11 - 4.1.1流程的选择 - 11 - 4.2连续灭菌的操作 - 12 - 4.3连续灭菌的计算 - 13 - 5空气除菌 - 14 - 5.1空气预处理与设备 - 15 - 5.2油水分离与设备 - 15 - 5.3生产规模设置 - 16 - 6发酵过程中的控制参数 - 17 - 6.1发酵主要操作方式 - 17 - 6.2发酵过程中的代谢变化参数 - 18 - 6.2.1物理参数 - 18 - 6.2.2 化学参数 - 19 - 6.2.3生物参数 - 20 - 6.2.4发酵终点的判断 - 20 - 7相关计算 - 21 - 7.1发酵罐的工艺尺寸 - 21 - 8下游加工 - 23 - 8.1发酵液预处理 - 24 - 8.2过滤 - 24 - 8.3醋酸丁酯提取 - 24 - 8.4水洗 - 25 - 8.5水提 - 25 - 8.6脱丁酯 - 25 - 8.7结晶 - 25 - 8.8产品 - 26 - 8.9干燥包装 - 26 - 参考文献 - 26 - 年产三百吨螺旋霉素发酵生产工艺设计 引言 螺旋霉素,英文名Spiramycin。白色或微黄色粉末,微有味;微吸湿;易溶 于乙醇、丙醇、丙酮和甲醇,难溶于水。具有强大的体内抗菌作用和抗菌后效应 (PAE),能够增强吞噬细胞的吞噬作用,广泛分布于体内。本品在组织细胞内浓度较红霉素高,而副作用小于红霉素。可用于治疗由革兰阳性菌和某些革兰阴性菌引起的耳、鼻、喉和呼吸道感染。该品系多组分大环内酯类抗生素,作用机制、抗菌谱与红霉素相似,抗 肺组织菌作用与红霉素相似或略逊,但比其具有更长的抗生素后效应(PAE)。与红霉素有交叉耐药。对革兰阳性菌和一些革兰阴性菌如链球菌、脑膜炎双球菌、百日咳杆菌、梭状芽胞杆菌等包括对青霉素、链霉素、四环素、氯霉素耐药菌均有效。对立克次体等有效。 在抗感染药物市场中,大环内酯类抗生素和头孢菌素类、喹诺酮类、青霉素类一起,成为四大主力军团。而螺旋霉素及其衍生物长期以来一直占据35%左右的大环内酯类抗生素市场份额,正处于销售成熟期。全国有螺旋霉素及其衍生物的制剂生产企业近100家,有稳固的市场,有固定的销售渠道,有叫得响的品牌,有价格低廉的优势,相信今后市场销售额还会稳步上升。 后市发展潜力巨大:目前,我国仍为发展中国家,13亿人口的人均年用药金额不到10美元,与发达国家60美元~100美元的用药水平相比差距很大。今后,随着人民生活水平的逐步提高,医疗保障体系的日趋完善,对药品的总体需求还将不断扩大,医药市场这个蛋糕必将越做越大,螺旋霉素及其衍生物市场销售额也必定水涨船高。 1菌种的选育 螺旋霉素的产生菌是生二素链霉菌S.azmbo-faeiensis,在合成培养基上气生菌丝生长快,白转灰色,基内菌丝为微黄色至微灰色,可溶色素淡黄褐色。孢子丝长,螺旋霉素形,松紧不一,孢子卵圆至球形。国产链霉菌新品种L799,其孢子长方形,孢子表面有疣状凸起并带有粗短小刺。在大多数培养基上产生菌丝 淡紫灰,基内菌丝呈葡萄紫。其孢子形成慢且不易保藏,因此要选择适宜的保藏方法和条件,以保证孢子的存活率。 菌种选择:本设计采用的是中国微生物资源库菌种保藏中心的产二素链霉菌链霉,在实验室其发酵效价可达到1500~3000u/mL。 根据螺旋霉素的生物合成途径对螺旋霉素产生菌产二素链霉菌进行推理选育, 并获得了高产菌株。首先在紫外线诱变的基础上,筛选豆油耐性变株得到菌株 XC 2-37, 其发酵效价较出发菌株XC 1-29提高9%。通过培养基优化, 菌株 XC 2-37 的发酵效价提高61.8% 。再以紫外线处理菌株 XC2-37,并筛选缬氨酸诱导变株, 得到菌株 XC 3-11,其发酵效价较菌株 XC 2-37提高20%。菌株 XC 3-11经自然分 离得到菌株 XC 4-18, 发酵效价达到 4500u/ml,为原始出发菌株 XC 1-29 的 2. 25 倍。传代试验表明菌株XC 4-18的高产遗传特性稳定。菌株XC 4-18应用于50m3发酵罐进行工业化生产,与原始出发菌株XC 1-29相比,发酵效价和发酵指数分别提高84.9%和43.6%。 螺旋霉素 spiramycin, SPM 为十六元大环内酯类抗生素,其内酯环的生物合成是由5分子乙酸、1 分子丙酸、1分子丁酸和1分子未知前体二碳单位组成。支链氨基酸,如缬氨酸等,经分解代谢可产生乙酸、丙酸、丁酸, 作为 SPM 生物合成的前体。现根据SPM生物合成途径对SPM产生菌产二素链霉菌进行推理选育,并获得了高产菌种。 1.1材料与方法 1.1.1出发菌株 产二素链霉菌 Strep tomy cesam bofaciens XC 1-29。 1.1.2 培养基与培养条件 斜面培养基:含淀粉,豆饼粉,MgSO4,NaCl,CaCO3 ,琼脂; 以温度28?0.5?,相对湿度30%-50%,培养12d。 平板培养基:含淀粉, KNO3,K2HPO4,MgSO4 ,NaCl,FeSO4,琼脂;培养条件同斜面(以温度28?0.5?,相对湿度30%-50%,培养12d。)。 种子培养基:含淀粉,豆饼粉,蛋白胨,玉米浆,KH2PO4,NaCl,CaCO3;以温度 28?0.5?,220r/min 培养40h。 发酵培养基:含淀粉,葡萄糖,玉米浆鱼粉,酵母粉,NH4NO3,KH2PO4,MgSO4,NaCl,CaCO3,豆油;以温度 28?0.5?,接种量8% ,220r/min 培养96h。 1.1.3发酵效价测定 杯碟法,检定菌为藤黄八叠球菌28001。 1.1.4诱变处理 将产二素链霉菌 XC 1-29 新鲜斜面孢子制成单孢子悬浮液,吸取5ml于无菌平板中。置于波长253.7nm,功率30W,紫外灯之下30m处,开盖,震荡照射60s。 1.1.5豆油耐性变种的选育 用豆油代替分离培养基中的淀粉, 将诱变存活孢子涂布于这一培养基上, 筛选豆油耐性变株Oil。 1.1.6缬氨酸诱导变种的选育 将诱变存活孢子涂布在含L-缬氨酸分离培养基中, 筛得缬氨酸诱导变种 Val。 1.2 预计结果 1.2.1豆油耐性变种的选育 产二素链霉菌 XC1-29 经UV诱变后的存活孢子,适当稀释后涂布于含豆油的平板培养基上,UV诱变和不诱变孢子也分别稀释涂于不含豆油的平板培养基上作对照。以上3组各挑一定量菌落移种斜面,经二级发酵后测定效价,比较SPM 生产能力。 结果表明:豆油耐性变株的发酵效价高于自然分离株与UV诱变株其中豆油耐性突变株XC 2-37 的发酵效价较出发菌株 XC 1-29提高9%。通过培养基优化,菌株XC 2-37的发酵效价又提高6.8%. 1.2.2缬氨酸诱导变种的筛选 以菌株 XC 2-37 为出发菌株,通过UV诱变处理,并在含L-缬氨酸的平板培养基上筛选缬氨酸诱导变种,UV诱变和未诱变菌株作对照。 结果表明:缬氨酸诱导变株的发酵效价高于自然分离株与紫外诱变株。 其中缬氨酸诱导变株 XC 3-11的发酵效价较出发菌株 XC 2-37 提高20% 。菌株 XC 3-11 经自然分离得到菌株 XC 4-18, 发酵效价达到4500u/ml,比菌株 XC 3-11 提高6.7% 。菌株XC 4-18 的发酵效价是原始出发菌株的2.25倍。 1.2.3菌株 XC 4-18的遗传稳定性 用群体连续传代的方法考察菌株 XC4-18 的传代稳定性,其生产能力波动幅度小, 说明菌株 XC 4-18的高产遗传特性稳定。 1.2.4菌株 XC 4-18与菌株XC 1-19的生产水平比 菌株XC 4-18 与菌株XC 1-29应用于50m3发酵罐的生产。菌株XC 4-18 的发酵效价和发酵指数分别较出发菌株XC 1-29提高84.9%和43.6% 。 1.3原因分析 螺旋霉素为大环内酯类抗生素,其内酯环由五个乙酸,一个丙酸,一个丁 酸和一个未知前体构成。在发酵培养基中加入短链脂肪酸能刺激产二素链霉菌SPM的生物合成。都有分解能产生乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸, 豆油耐性变种能提高菌株利用脂肪酸的能力, 因此能提高SPM产量。 缬氨酸等氨基酸代谢可产生乙酸、丙酸、丁酸,能刺激SPM的生物合成。 缬氨酸诱导变种能多产前体,导致SPM 增产。 2种子的扩大化培养 工业生产规模越大,每次发酵所需的种子就越多。要使小小的微生物在几十小时的较短时间内,完成如此巨大的发酵转化任务,那就必须具备数量巨大的微 生物细胞才行。菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。种子扩大培养的任务,不但要得到纯而壮的菌体而且还要获得活力旺盛的、接种数量足够的菌体。 的种子制备一般包括两个过程,即在 固体培养基上生产大量孢子的孢子制备和在液体培 养基中生产大量菌丝的种子制备过程。 养基中生产大量菌丝的种子制备过程。 2.1孢子制备 孢子制备是种子制备的开始,是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。不同菌种的孢子制备工艺有其不同的特点。 霉菌的孢子培养,一般以大米、小米、玉米、 麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖,而且这类培养基的表面积较大,可获得大量的孢子。霉菌的培养一般为25~28?,培养时间为4~ 14天。 2.2种子制备 种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到 液体培养基中培养,使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。 ? 摇瓶种子制备:某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种,需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐,这就是摇瓶种子。摇瓶相当于微缩了的种子罐,其培养基配方和培养条件与种子罐相似。摇瓶种子进罐,常采用母瓶、子瓶两级培养 ? 种子罐种子制备:种子罐种子制备的工艺过程,因菌种不同而异,一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。孢子或摇瓶菌丝被接入到体积较小的种子罐中,经培养后形成大量的菌丝,这样的种子称为一级种子,把一级种子转入发酵罐内发酵,称为二级发酵。把一级种子转入发酵罐内发酵,称为二级发酵。 螺旋霉素的种子制备需采用种子罐种子植被的方式,并采用二级发酵的方式。 接种龄:接种处于对数期的细菌。 接种量:接种量定为8%。 2.3种子培养 种子培养要求一定量的种子,在适宜的培养基中,控制一定的培养条件和培养方法,从而保证种子正常生长。工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型。 液体深层种子罐从罐底部通气,送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法,相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲,称为液体深沉培养。 其特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通 气、搅拌、温度与培养 基中氢离子浓度等条件,选择最佳培养条件。故采用液体深沉培养法。 2.4种子质量的控制 培养基:与发酵罐中的培养基类似。因为是孢子培养,所以须去掉其中的豆油,动物蛋白 NY等,以使其成为单一氮源的培养基。 培养温度和湿度:要获得高质量的孢子,其最适温度区间很狭窄,必须保证在最适范围。培养温度:28?。查阅资料的其相对湿度应当保持在40%~50%之间。 通气量:生二素链霉菌为严格的好养菌,因其采用的是二级种子发酵罐,故通气量定为1/1.5. 斜面冷藏时间:冷藏时间为不超过七到八天。 2.5种子质量的控制措施 菌种稳定性的检查:取少量保藏菌种置于灭菌生理盐水中,逐级稀释,在含有琼脂培养记得双碟上划线培养,菌液稀释度以双碟上所生长的菌落不至过密为宜。挑选出形态整齐、孢子丰满的菌落进行摇瓶试验,测定其生产能力,以不低于其原有生产活力为原则,并取生产能力高的菌种备用。 无杂菌检查:种子液显微镜观察,肉汤或琼脂斜面接入种子培养液进行无菌试验和对种子液进行生化分析。其中无菌试验是判断杂菌的主要依据。 3培养基的设计 发酵培养基成分为水、淀粉7.0%、黄豆粉饼1.5%、动物蛋白NY0.5%、糊精1.2%、玉米浆0.7%、碳酸钙、硝酸铵、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸铵等。根据螺旋霉素产生菌的代谢情况,在发酵96 h或120 h,以1?0.5比例 补加营养物质提高发酵单位。 成分 小罐%(g/mL) 黄豆饼粉 1.5 0.7 玉米浆 淀粉 7.0 NaCl 0.3 CaCO3 0.5 (NH4)2SO4 0.12 豆油 0.8 糊精 1.2 3.1碳源 凡是构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养并提供能量的物质均称为,并提供能量的物质碳源。目前发酵培养基发酵生产中多用鱼粉或黄豆粉饼,黄豆粉饼的优点是原材料质量稳定,染菌率低,但发酵效价相对较低,以鱼粉作氮源发酵效价相对较高,但鱼粉质量质量不稳定。发酵条件研究发现:不同碳源中以淀粉最好,糊精次之,最差是蔗糖和乳糖;不同氢源中以鱼粉最好,辅加氢源中以硝酸铁最好。对培养基进行改进,在黄豆粉饼中加入动物蛋白NY,提高发酵水平。 3.2氮源 凡是构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质均称为氮源,氮源可分为有机氮源和无机氮源。上文提到的动物蛋白NY,以及黄豆粉饼和一些无机氮源,如硝酸铵。 3.3无机盐和微量元素 无机盐(mineral salt)和微量元素trace element, microelement是生理活性物质的组成成分或具有生理调节作用,磷(核酸)、硫、铁(细胞色素)、镁、钙(调节细胞膜透性)、锰、铜、锌(辅酶或激活剂)、钴、钾、钠(调节渗透压)、氯。一般低浓度起促进作用,高浓度起抑制作用。 3.4生长因子 生长因子是指氨基酸、核苷酸、维生素、脂肪酸等菌体必须地生理活性物质。在这种天然培养集中已然含有无需添加。 3.5水 谁是生命活动不可或缺的物质,是细胞的主要成分,良好的介质,营养传递的道体,调节细胞生长。 3.5前体物 在抗生素发酵过程中加入前提物可以控制菌体合成抗生素的方向和增加抗生素的产量。在螺旋霉素发酵中不同的前体物对发酵有不同的影响。 本设计用正丙醇(3C)作为前体物,加量在0.668%~1.000%之间,分次加入,每隔十六小时加一次。 4灭菌 灭菌是指利用物理或化学方法杀灭或除去物料及设备中的一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法有:化学灭菌法,电磁波射线灭菌法,干热灭菌法,湿热灭菌法,过滤除菌法,火焰灭菌法。因本设计是针对大型工业发酵的设计,因此一般采用蒸汽湿热灭菌法。 在发酵工业中,对培养基和发酵设备的灭菌,广泛采用湿热灭菌法。工厂里,蒸汽比较容易获得,控制操作条件方便,是一种简单又廉价有效的灭菌方法。 用湿热灭菌的方法处理培养基,其加热温度和受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成,所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作的主要矛盾。 4.1连续灭菌流程及设备 培养基的分批灭菌就是将配置好的培养基放在发酵罐或其他装置中,通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程。而规模较小发酵罐往往采用分批灭菌的方法,又叫实罐灭菌。工业生产中大规模的灭菌应尽量采用高温短时间的连续灭菌。连续灭菌具有以下特点: ?与分批发酵相比培养液受热时间短,可缩短发酵周期,同时培养基成分破坏较少。 ?产品质量交易控制。 ?蒸汽负荷均匀,锅炉利用率高,才做方便。 ?适宜采用自动控制。 ?降低劳动强度。 培养基经连续加热、维持和冷却后进入发酵罐。 4.1.1流程的选择 流程可分为:连消塔?喷淋冷却流程、喷射加热?真空冷却流程、板式换热器灭菌流程本设计采用连消塔??喷淋冷却流程。 具体:配好的培养基打入连消塔与蒸汽直接混合,达到灭菌温度后进入维持罐,维持一定时间后经喷淋冷却器至一定温度后进入发酵罐。连续灭菌的基本设备一般包括: ?配料预热罐,将配好的料液预热到60~70 ?,以避免灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声; ?连消塔,连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混合,并使料液的温度很快升高到灭菌温度; ?维持罐,连消塔加热的时间很短,光靠这段时间的灭菌是不够的; ?冷却管,从维持罐出来的料液要进行冷却管冷却,生产上一般采用冷却水喷淋冷却,冷却到40~50 ?后,输送到预先已灭菌过的罐中。 相较于其他两种连续灭菌流程来说连消塔-喷淋冷却流程灭菌较彻底,而喷射加热-真空冷却流程中由于真空的影响,再蒸发室下要安装一台出料泵,或将蒸发室置于离发酵罐液面10m以上的高度,否则物料就不能流进发酵罐而进入真空系统,这就带来了不方便,尤其是对于已经灭菌好的培养基来说,出料的泵的密封要求很高才能避免重新污染。故此不采用。 而板式换热器流程进行连续灭菌时加热和冷却 比喷射式连续灭菌长,灭菌过程中的所需设备多,操作较为麻烦,染菌机会多。故此不采用。 4.2连续灭菌的操作 培养基在采用连续灭菌时,发酵罐应该在连续灭菌前先进行空罐灭菌,通常先把发酵罐的空气过滤器灭菌并用空气吹干。加热器、维持罐及冷却设备也应先行灭菌。组成培养基的不同成分可以在不同的温度下分开进行灭菌,以减少培养基受热破坏的程度。连续灭菌时,培养基在短时间内被加热到131 ?,短时间保温8min后,被快速冷却,在进入早已灭菌完毕的发酵罐 (1)配料 配料罐用于培养基的配置。然后将培养基用泵打入预热桶中。、 (1)预热 预热桶的作用一是定容,而是预热。预热的目的是使培养基在后续的加热过程中能快速的升到指定的灭菌温度,同时避免太多的冷凝水带入培养基,还可减少震动和噪声。一般可将培养基预热到70~90 ?. (3)预热好的培养基由连消泵打入加热器。加热器也称连消塔,使培养基与蒸汽混合并迅速达到灭菌温度。加热采用的蒸汽压力一般为0.45~0.8MPa,其目的是使培养基在较短时间(20~30s)里快速升温。加热器有塔式加热器和喷射加热器两种。 (4)保温 保温是将培养基维持灭菌温度一段时间,使杀灭微生物的主要过程。其设备有维持罐和管事罐两种。保温设备一般采用保温材料包裹,但不直接通入蒸汽。 (5)降温 升降温快是连续灭菌的主要特征之一,为避免培养基营养成分的破坏,保温后的培养基需要迅速降温至接近培养温度(40~50 ?).国内大多采数用喷淋冷却设备,也有采用螺旋板式换热器、板式换热器、真空冷却器等。反应根据培养基的特点、处理量、场地特性选用喷淋冷却设备。4.3连续灭菌的计算 连续灭菌包括升温、保温和降温三个阶段,灭菌主要是在保温过程中实现的,在升温后期也有一定的灭菌作用。 此发酵罐内装培养基835.71?3278.57,在131?下进行连续灭菌,设每毫升培养基中含耐热的芽孢为107个,培养基体积流量G=10m3/h0.17 m3/min 灭菌时间的计算 :连续灭菌时间的确定应参考理论灭菌时间作适当延长或缩短。发酵罐采用300m3容积。在131 ?下进行分批灭菌,此温度下的灭菌速度常数为0.25 s-1。 则培养基中活微生物: N0 278.57×106×1072.8×1015个 经过τ时间灭菌后培养基中的活微生物: Ns=0.001个 根据: Lgk-14845/T +36.127 -14845/273+121+36.127 -1.55 得 k0.0281s-1 理论灭菌时间 τ1/k×ln (N0/ Ns)1/0.0281×ln(2.8×1015/0.001)692.07s 11.5min 实际灭菌取理论灭菌时间的两倍23min,约为1h。 以下是关于灭菌保温时间的计算: C0107个/ml CS0.001/278/106/1033.6×10-15 τln(C0/CS)/k81S 在维持罐内的物料会有反混,为保险起见,实际维持时间取理论灭菌时间 的5倍。 τ81×5405s6.75min 维持罐的体积的计算: 维持罐的体积 VGτ实 培养基体积流量 G=10m3/h0.17 m3/min 则 V 0.17 m3/min×6.75min1147.5L 维持罐的H/D一般为1.2~1.5,装料系数为0.85~0.9(取装料系数为0.85) 则维持罐的实际体积: V实2m3 5空气除菌 空气是由氮气、氧气、二氧化碳、惰性气体、水蒸气以及悬浮在空气中的尘埃等组成的混合物。空气除菌经常可以检测到一些细菌及其芽孢、酵母、真菌和病毒。 无菌空气的制备:原理及简单过程:微生物体积很小,空气中附着在尘埃上的微生物大小为0.5-5μm。过滤介质可以除去游离的微生物和附着在其他物质上的微生物。其原理在于空气通过过滤介质时,颗粒在离心场产生沉降,同时惯性碰撞产生摩擦黏附,颗粒的布朗运动使微粒之间相互集聚成大颗粒,颗粒接触介质表面,直接被截留。气流速度越大,惯性越大,截留效果越好。惯性碰撞截留起主要作用,另外静电引力也有一定作用。 无菌空气的制备一般是把吸入的空气先经过压缩机前的过滤器过滤,再进入空气压缩机,从空气压缩机出来的空气(一般压力在1.96×105Pa以上,温度120~150?),先冷却到适当的温度(20~25?)除去油和水,再加热至30~35?,最后通过总过滤器和分过滤器除菌,从而获得洁净度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。具有一定压力的无菌空气可以克服在预处理、过滤除菌及有关设备、管道、阀门汇总的压力损失,并在培养过程中能够使发酵罐维持一定的罐压。 因此,过滤除菌的流程必须有供气设备??空气压缩机,对空气提供足够的 能量,同时还要具有高效的过滤除菌设备以除去空气中的微生物颗粒。要保持过滤器在比较高的效率下进行过滤,并维持一定的气流速度和不受油、水的干扰,则要有一系列的加热、冷却及分离和除杂设备来保证。 5.1空气预处理与设备 采风塔:在工厂的上风头,高度一般在20m左右,设计流速8m/s。可建在空压机的屋顶上。 粗过滤器:安装在空压机吸入口前,前置过滤器。作用是截留空气中较大的灰尘,保护压缩机,减轻总过滤器的负担,也能起到一定除菌作用。介质为泡沫塑料(平板式)或无纺布(折叠式),流速0.1-0.5 m/s。要求是阻力小,容灰量大。 空气压缩机:作用是提供空气流动的动力。常用往复式、螺杆式、涡轮式空压机。 空气贮罐:消除压缩空气的脉动,用于往复式空压机。螺杆和涡轮式提供均匀连续空气可省去。设置在空压站附近。 冷却器:空气压缩机出口气温一般在120?,必需冷却。在潮湿季节,除湿。空气冷却器的传热系数为105W/m2??。采用双程或四程结构,两级串联使用。第一级循环水冷却,第二级低温水(9?)冷却。设置在发酵车间外。压缩空气每经过1m管道,温度下降0.5~1.0?。 5.2油水分离与设备: 气液分离设备:除去空气中油和水,保护过滤介质。旋风分离器和丝网除沫器两类。 旋风分离器:利用离心沉降原理。结构简单,阻力小,分离效率高。压缩空气的速度15~25m/s,切线方向进入旋风分离器,在环隙内做圆周运动,水滴或固 体颗粒被甩向器壁,而收集。完全除去20μm以上离子,对10μm离子的分离效率为60~70%。 丝网除沫器:利用惯性拦截原理。对1μm以上的雾滴除去率98%。 空气加热设备:空气相对湿度仍然为100%,需要降到70%以下,才能进入空气过滤器。列管式换热器,空气走管程,蒸汽走壳程。套夹式加热器,空气走管程,蒸汽走夹套 空气过滤介质与设备:要求除菌效率高,耐受高温高压,不易被油水污染,阻力小,成本低,易更换。常用的介质有棉花、活性炭、玻璃棉、超细比例纤维纸、石棉滤板等。 纤维及颗粒介质过滤器:圆筒形,直径2.5~3m。孔径10~15mm。空气从下方进入,上方引出。常用介质棉花、玻璃纤维、活性炭等。空气流速0.2~0.3m/s。可作为总过滤器。总过滤器每月灭菌一次。应该有备用过滤器,灭菌时交换使用。 5.3生产规模设置 二、三级过滤器,第一级为总过滤器,二、三级为分过滤器。 空气过滤除菌的工艺流程: 1空气净化的一般流程如下:空气吸入口?粗过滤器?空气压缩机?一级空气冷却器?二级空气冷却器?分水器?空气储罐?旋风分离器?丝网除沫器?空气加热器?总空气过滤器?分空气过滤器?无菌空气。 2为了获得无菌空气,一般采用三个主要工段。第一个工段提高空气的洁净度:前过滤器可减少压缩机活塞和气缸的磨损,减少介质负荷。第二个工段除去空气中油和水:采用分级冷却,一级冷却采用30?左右的水使空气冷却到40~50?,二级冷却器采用9?冷水或15~18?地下水,使空气冷却到20~25?。冷 却后,空气湿度提高了100%,湿度处于露点以下,油和水凝结成油滴和水滴,在空气贮藏罐内沉降大液滴。旋风分离器分离5μm以上的液滴。丝网除沫器分离5μm以下液滴。第三个工段获得无菌空气:分离油水后的空气湿度仍然达100%,温度稍下降,就会产生水滴,使介质吸潮。加热提高空气温度,降低湿度(60%以下)。这样空气温度达30~35?,经过总过滤器和分过滤器除菌后,得到符合要求的无菌空气[10]。 6发酵过程中的控制参数 6.1发酵主要操作方式 根据发酵过程操作方式将工业发酵分为三种模式,即间歇发酵,连续发酵和流加发酵。 (1)间歇发酵:是最常见的工业发酵方式,也称分批发酵或批式发酵。将发酵罐和培养基灭菌后,向发酵罐中接入种子、开始发酵过程。操作简单、不容易染菌、投资低;但生产能力低、劳动强度大产品质量不稳定。 (2)连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基,同时以相同的速度流出培养液,从而使发酵罐内的液量维持恒定,微生物在稳定状态下生长。可长期连续进行,生产能力高;但操作控制要求高,投资高、杂菌污染、微生物菌种变异。主要用于实验室进行发酵动力学研究,在工业发酵中应用不多见,只应用于菌种的遗传性质比较稳定的发酵,如酒精发酵等。 (3)流加发酵又称补料分批发酵,是介于间歇发酵与连续发酵的一种操作方式。它同时具备两者的部分优点,是一种在工业上比较常用的操作方式。流加 发酵的特点是在流加阶段按一定的规律向发酵罐中连续地补加营养物或和前体,由于发酵罐不向外排放产物,罐中的发酵体积将不断增加,直到规定体积后放罐。补料分批发酵作为分批发酵向连续发酵的过渡,兼有两者优点,且克服了两者缺点:可解除营养物基质的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应;可避免好氧发酵在分批发酵中因一次性投入糖过多造成细胞大量生长,耗氧过多,以至通风搅拌设备不能匹配的状况;可在某些情况下减少菌体生成量,提高有用产物的转化率。 又因发酵过程需要定期加入前体物,所以,综上所述需要选择流加发酵,即补料分批发酵。补料分批发酵可分为两种类型:单一补料分批发酵和反复补料分批发酵。反复补料分批发酵是在单一补料分批发酵的基础上,每隔一定时间按一定比例放出一部分发酵液,使发酵液体积始终不超过发酵罐的最大操作容积,从而在理论上可以延长发酵周期,直至发酵产率明显下降,才最终将发酵液全部放出。 在开始时投入一定量的基础培养基,到发酵过程的适当时期,开始连续补加碳源或和氮源或和其他必须基质,直到发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后,停止补料,最后将发酵液一次全部放出,这种操作方式称为单一补料分批发酵。显然需选择单一补料分批发酵。 6.2发酵过程中的代谢变化参数 发酵的各种工艺参数分为物理参数、化学参数和生物学参数。 6.2.1物理参数 温度:是指发酵整个过程或不同阶段中所维持的温度。其高低与发酵中酶反应速率、氧在培养液中的溶解度和传递速率、菌体生长速率和产物合成速率等有密切关系。不同产品,发酵不同阶段所维持的温度亦不同。定为调整期28 ?, 稳定期38 ?,后期40 ?。 影响发酵温度变化的因素:发酵热是发酵过程中释放出来的净热量,由产热因素和散热因素两方面决定的。Q发酵Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q显-Q辐射 (1)生物热Q生物:生产菌在生长繁殖过程中产生的热能,叫做生物热。 发酵过程中生物热的产生具有强烈的时间性;生物热也随培养基成分的不同而变化。 (2)搅拌热Q搅拌:搅拌器转动引起液体之间、液体与设备之间摩擦所产生的热量。 (3)蒸发热Q蒸发:空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后,排出空气引起水分蒸发所需的热能。水的蒸发热和废气因温度差异所带走的部分显热Q显一起都散失到外界。 (4)辐射热Q辐射:由于发酵罐内外温度不同,发酵液中有部分热通过主罐体向外辐射的热能。 压力:是发酵过程中发酵罐维持的压力。罐内正压可防止外界空气中的杂菌侵入,同时与氧和二氧化碳在培养液中的溶解度有关。 搅拌转速:与培养基中氧的传递、发酵液的均一性等有关。 6.2.2 化学参数 包括pH、溶解氧、氧化还原电势、二氧化碳溶解量、排气组分〔二氧化碳、氧气和溶液成分总糖、总氨、各种无机离子等,有些可直接在线检测,如pH、溶解氧和排气组分,有些不能或难以在线捡测。 pH对发酵的影响及其控制:pH对发酵的影响生长繁殖和产物合成 ?影响酶的活性。 ?影响微生物细胞膜所带电荷的状态。 ?影响培养基中某些组分中间代谢产物的解离,从而影响微生物对这些物质的利用; ?pH不同,引起菌体代谢过程不同,使代谢产物的质量和比例发生改变。 ?影响霉菌的形态。 pH的控制 ?发酵培养基的配方,有些成分可在中间补料时补充调控。 ?加入适量的缓冲剂,控制培养基pH的变化,采用内源调节。 ?在发酵过程加酸碱或其他物质进行调节。 溶氧对发酵的影响及其控制:工业发酵微生物多数为需氧菌,少数为厌氧菌;需氧菌发酵过程,发酵液中溶氧浓度的控制是重要的控制参数之一;对抗生素发酵来说,氧的供给更为重要。溶氧异常下降可能原因有:一是污染好气性杂菌,消耗大量溶氧;二是菌体代谢发生异常现象,需氧要求增加,使溶氧下降;三是某些设备或工艺控制发生故障或变化,引起溶氧下降等。 泡沫对发酵的影响及其控制:通气搅拌和代谢产生的气体是泡沫产生的原因。泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系,泡沫间被一层液膜隔开而彼此不相连通。一类存在于发酵液的液面上,气相所占比例特别大,并且泡沫与它下面液体之间有明显界线;另一种是出现在粘稠的发酵液中均匀而细的泡沫,比较稳定,其气相所占比例由下而上逐渐增加,气泡与液面没有明显界限,此类泡沫又称为流态型泡沫。泡沫控制方法主要包括机械消沫和消沫剂消沫两大类。还可考虑从减少起泡物质和产泡外力,或从菌种选育方面考虑。 6.2.3生物参数 菌丝形态:菌丝形态的改变是生化代谢变化的反映。一般都以菌丝形态作为衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程代谢变化和决定发酵周期的依据之一。 菌体浓度:其大小和变化速度对菌体的生化反应都有影响,与补料量、供气量、培养液的表观粘度和溶解氧浓度有关。 脱氧核糖核酸DNA:以DNA为参数可以区分发酵的各个阶段。 6.2.4发酵终点的判断 确定合适的微生物发酵终点对提高产物的生产能力和经济效益是很重要的。 发酵过程中产物的生物合成是特定发酵阶段的微生物代谢活动,有的是随菌体的生长而产生,如初级代谢产物氨基酸等,有的代谢产物产生与菌体生长无明显关系,如抗生素合成在生长的末期完成,因此要提高发酵单位和增加产量,通常采取延长周期的办法。 但菌体细胞总不免要趋向衰老自溶,到后期,产物生产能力相应地减慢或停止,甚至下跌。菌体细胞总不免要趋向衰老自溶,到后期,产物生产能力相应地减慢或停止,甚至下跌。 因此合理地确定发酵周期,准确判断放罐时间,需考虑:(1)经济因素;(2)产品质量因素;(3)特殊因素。合理的放罐时间是由试验来确定的,根据不同的发酵时间所得的产物产量计算出发酵罐的生产力和产品成本,采用生产力高而成本又低的发酵时间作为放罐时间。 7相关计算 7.1发酵罐的工艺尺寸 因生二素链霉菌是严格的好阳菌,故发酵过程中需要用到通风设备,因而采用机械搅拌通风发酵罐。常用的机械搅拌通风发酵罐的结构和主要几何尺寸已标准化设计。其几何尺寸比例如下: H0/D1.7~3.5; H/D2~5; d/D1/3~1/2; W/D1/12~1/8; B/D0.8~1.0; h/D1/4; 单位全部为m。 发酵罐大小用公称体积表示,其中:V0(公称体积)Va(筒身容积)+Vb(底部)??D2H0/4+0.15D3 H0-发酵罐圆柱形筒身高度 D-发酵罐内径 H-罐顶到罐底的高度 D-搅拌器直径 W-挡板宽度 B-下搅拌器距罐底的距离 S-搅拌器间距 h-底封头或顶封头高度 利用生二素链霉菌年产300吨螺旋霉素,年生产日为300天,发酵周期根据菌种的选育中的相关数据定为96h,清理及维修发酵罐总时间为24h,合5d,产 量为11.1g/L,灭菌时间为24min,合1h,发酵液预处理收率约为92%,提取时收率约为93%,浓缩干燥收率为90%,装料系数为70%。 一年需放罐的次数:300天/5天60 次 每批次产螺旋霉素:300吨/60次5 吨 总提取率为:92%×93%×90%77.00% 假设用一台发酵罐,发酵液的体积为:V5×1000/11.1/77.00%/70%835.71 则需V0300m3d的发酵罐3个。 由V0(公称体积)Va(筒身容积)+Vb(底部)??D2H0/4+0.15D3,得 D5.2m(H02.5D) 那么:H02.5D2.5×13 m H3D3×5.215.6 m dD/20.5×5.22.1 m WD/125.2/120.44m B0.9 D0.9×5.24.68 m S2d 2×2.14.2m hD/45.2/41.3m 本发酵过程中选用机械搅拌式发酵罐,国内普遍采用六弯叶或六箭叶圆盘涡轮式,本设计中因罐小要求加强轴向混合,故选用六箭叶圆盘涡轮式。 7.2物料衡算 本系统采用3个发酵罐,体积为300 m3,螺旋霉素产量为11.1g/L, 发酵液预处理收率约为92%,提取时收率约为93%,浓缩干燥收率为90%,装料系数为70%。则: 每个发酵罐在一个发酵周期螺旋霉素产量为: 300×11.1×92%×93%×90%×0.71795(kg) 那么1个发酵罐1年的总产量为: 1795×300/5107700(kg)107.7吨 故符合年产量为300吨的生产要求。 8下游加工 螺旋霉素(spiramycin)是十六碳大环内酯类抗生素,是由生二素链霉菌 (S.ambofaciens)所产生的。螺旋霉素是多组分的抗生素,其主要成分有螺旋霉素?、?、?。其分子式如图所示: 抗生素提取工艺:提取的过程就是浓缩和纯化的过程,因 为发酵液体积大,抗生素浓度低,用一步操作往往是不能满足要求的,因此提取常分几步进行。其中以第1步最为重要,因为第1步处理的体积最大,浓度最低。以后几步处理的体积小,浓度也高,操作易控制。在提取前,需进行发酵液的预处理,便于以后的提取。 抗生素常用提取方法:溶酶萃取法、离子交换法、吸附法、沉淀法。一般采用溶酶萃取法,通过对发酵液的预处理,过滤再离心分离得到BA 萃取液,洗净再提取分离得到磷酸缓冲液,再过滤结晶,真空干燥最后得到抗生素成品。 螺旋霉素发酵液的提取采用溶酶萃取法。步骤如下:发酵液?净化液?滤液?水提液?水洗液?水提液?脱溶液?结晶液?湿晶体?干燥?成品?包装入库。 8.1发酵液预处理 将发酵液加1.0%~1.5%的硫酸铝并调节pH值4.5~5.0,搅拌,静止,使蛋白质充分沉淀。 8.2过滤 发酵液首先通过板框过滤机过滤。各板框机的进料压力相同,过滤压力最初不得超过0.03 MPa,待每个出料嘴都出料后可以提高至0.05 MPa,滤速减慢,至0.10~0.15 MPa,整批过滤完后,用3.5~4.0 m3/次的水顶洗,用30%(V/V)低单位(400 U/mL以下)酸水顶洗。接着过滤液由水输送至滤液贮池,滤液再通过泵送至混合萃取罐。 8.3醋酸丁酯提取 用5moL/L NaOH调过滤液pH值8.5~9.0,将醋酸丁酯泵入混合萃取罐。启动搅拌机搅拌(80~100r/min)混合后静置分层。若干小时后,如出现乳化层,则用高速离心机将丁酯相和水相分开。 8.4水洗 丁酯提取液由萃取罐泵送到水洗罐。然后用40?、50%(V/V)无盐水洗涤2次,每次洗涤均间歇搅拌(转速80~100r/min)1 min,重复3次,静置分层40~60 min,当放水至乳化层为白色时为止。 8.5水提 水洗后再泵入水提灌。按水提液为30000~50000 U/mL计算无盐水。用量:用1moL/L氯化氢和0.05mmoL/L磷酸二氢钠缓冲液调pH值为2.0~2.5,与丁酯提取液混合搅拌1min,重复3次,静置分层40~60 min,分2次提取,合并2次水液,用真空泵抽到脱溶罐。 8.6脱丁酯 水提液通过真空泵缓缓输入脱丁酯罐。用1moL/L氢氧化钠回调pH值5.0~5.5,加碱液要慢,防止局部结膜,用0.02 MPa干净空气和真空彻底去除,至无丁酯味为止,防止跑料。 8.7结晶 晶体成核可分为初级成核(没有待结晶物质以晶体形式存在)和二次成核(已有待结晶的物质以晶体形式存在)两类。 螺旋霉素晶核大小测量困难,因为结晶过程中成核和晶体生长总是相耦合的,并且没有合适的条件可以保存它。光散射提供了一种估计核大小的有效方法,这种方法简便易行。利用光散射测量单分散性球形颗粒的粒径。 螺旋霉素颗粒的真密度可以使用比重瓶法测量,因为螺旋霉素在正辛烷中的溶解度很小,而且正辛烷的密度较小,因此正辛烷可作为测量的流体介质,通过试验测得螺旋霉素的真密度为 1.10g/cm3。 8.8产品检测 加工好的螺旋霉素要进行产品的质量检测,合格的才可以进行下一步加工。 8.9干燥包装 将颗粒在真空干燥箱内真空度为99990Pa以下,水温80?,每 2 h翻料1次,如有结块必须压碎。干燥时间10 h左右,当水分达到15%以下时停止。干燥后进入最后包装阶段,将干粉分装于8 kg的木桶或3 kg的铁桶内,桶内用3层包装,塑料袋外层为1层牛皮纸,最内一层仍为塑料袋,用绳扎好。 参考文献 1 俞俊棠,唐孝宣,邬行彦.新编生物工艺学(上、下册).北京:化学工业出版社,2005 2 陈国豪.生物工程设备.北京:化学工业出版社,2005 3 岑沛霖,蔡谨.工业微生物学.北京:化学工业出版社,2000 4 华南工学院等.发酵工程与设备.北京:轻工业出版社,1985 5 刘国诠.生物工程下游技术.北京:化学工业出版社,2003 6 贾树彪,李盛贤.新编酒精工艺学.北京:化学工业出版社,2004 7 贾士儒. 生物反应工程原理.-2版.北京:科学出版社,2003.1 8 吴思方. 生物工程工厂设计概论.北京:中国轻工业出版社,2009.7 9王欣荣.螺旋霉素发酵工艺的研究[J].中国抗生素杂志,200212:145-148 10金志华.螺旋霉素高产菌种的推理选育[J].中国抗生素杂志,19982:133 11 汪国庆.应对螺旋霉素重新认识[J].中国药学杂志,19955:84-88 12 陈长华.螺旋霉素发酵培养基的改进[J].生物工程学报,199111:295.