【word】 大鼠空肠形态学及肠壁交感神经的增龄变化

【word】 大鼠空肠形态学及肠壁交感神经的增龄变化 大鼠空肠形态学及肠壁交感神经的增龄变 化 塞力等大鼠空肠形态学及肠壁交感神经的增龄变化第19期 大鼠空肠形态学及肠壁交感神经的增龄变化 崔宏力李非曾艳芳刘梦霞(首都医科大学宣武医院普通外科,北京100053) ? 1849? [摘要]目的探讨大鼠空肠形态学及肠壁交感神经的随龄变化.方法雄性sD大鼠104只,按不同发育阶段分为6组.光镜观察空肠形 态学变化,增殖细胞核抗原(PCNA),交感神经酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase,TH)进行免疫组织化学染色,观察空肠增殖能力及交感神经的变 化.结果自1月龄开始大鼠空肠绒毛高度和数量,肠壁肌层厚度逐渐增加,至6月龄达到高峰,而后逐渐降低,24月龄显着降低.不同月龄的大鼠 空肠PCNA,交感神经TH也呈现相同变化趋势.结论老化状态下,大鼠空肠形态学发生明显变化,黏膜细胞增殖能力减弱,肌间神经丛交感神经 减少,交感神经合成去甲肾上腺素能力下降. [关键词]空肠;年龄;增殖;交感神经;酪氨酸羟化酶 [中图分类号]R656.7[文献标识码]A[文章编 号]1005-9202(2007)19.1M9~5 Thestudyofthechangeinjejunummorphologyandsympatheticnerveofintestinewallintheagingrats CUIHong-Li,LIFei,ZENGYan-Fang,eta1. DepartmentofGeneralSurgery,XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China 【Abstract】 ObjectlveTounderstandthechangeofjejunummorphologyandsympatheticnerveofintestinewallintheaging rats,Methods104maleSDratsweredividedinto6groupsbydifferentgrowthstagesrandomly,Themorphologicalchangesofthejejunum wereexaminedbyopticalmicroscope;theexpressivealterationsofjejunalproliferatingcellnuclearantigen(PCNA)andsympathetictyrosine hydroxylasewereobservedbyimmunohistochemistry,ResultsTheheightandamountofiejunumvillusandthicknessofieiunalmuscleofthe ratsincreasedgraduallyfromthe1stmoBth.peakedinthepostnatal6thmonthanddecreasedgraduallyfromthenon.Thesesamevaluesof ratsinthe24thmonthwereevidentlydepressed.ThechangesofieiunumPCNAandsympathetictyrosinehydroxylaseshowedoffthesame trendindifferentagerats.ConclusionsInaging,significantchangesexistinjej unalmorphology,suchastheweakenedproliferousability ofmucosalcells,thereducedquantityofiejunalmyentericsympatheticneuro ns,andthedescendentsynthesisofnoradrenalin, 【Keywords】 Jejunum;Age;Proliferation;Sympatheticnerve;Tyrosinehydroxylase 小肠上皮细胞是哺乳动物体内增生最活跃的组织,处于 不断增生,衰老,死亡的动态平衡中,以维持小肠正常的形 态,结构和功能,保证机体的生存.小肠绒毛的特殊形态和 结构是小肠吸收功能的保证,而小肠在不同生理状态下的增 殖能力是维持这种动态平衡的关键.同时受自主神经系统支 配,肠神经不仅调控着小肠的运动和腺体分泌,而且肠道交 感神经所释放的去甲肾上腺素还是调节肠道及全身免疫功能 的重要神经递质.因此小肠的功能可能由于肠道神经的减少 和发生在细胞水平的细微变化而改变,进而引起机体功能发 生改变.目前,对于增龄情况下小肠形态学变化的研究尚不 完善,而且局限,并不足以小肠形态学在增龄过程中的 真实改变,而对于小肠交感神经随龄变化的观察甚少报告. 本文系统研究了空肠形态学和肠壁交感神经随龄变化趋势, 从而观察随增龄,特别是老化状态下空肠形态学和肠壁交感 神经的真实变化,以期为进一步研究老年小肠功能变化提供 理论依据. 基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划,2003CB517104) 1承德医学院附属医院老年病科 2首都医科大学宣武医院神经生化室 通讯作者:李非(1961-),男,博士,教授,博士生导师,主要从事胰腺, 胃肠外科疾病的研究. 作者简介:崔宏力(1970-),男,硕士,主治医师,主要从事胰腺,胃肠外 科疾病的研究,现就职于北京市垂杨柳医院普通外科. 1材料与方法 1.1实验动物及分组雄性SD大鼠104只,由北京大学医学 部实验动物科学部提供,SPF级.动物按不同发育阶段分为6 组:1月龄16只,3月龄16只,6月龄20只.12月龄20只,18 月龄19只,24月龄13只.每组随机各取10只为实验对象. 1.2标本采集各实验组大鼠麻醉,剖腹,迅速取距Treitz韧 带下10em的近端空肠3em,清除肠内容物,冰浴下以PBS液 清洗3次,置于中性甲醛液中固定,以备病理学检查. 1.3标本处理标本经常规石蜡包埋,做肠管横切面的连续 切片,切片厚度为3m. 1.3.1HE染色检查HE染色后,随机全盲法4JD倍光镜下观 察,以半自动图象分析仪摄片,应用Imageproplus图像分析软 件测值.每只动物取5张不连续切片,观察切片中间部位,每 个部位观察10个绒毛,测量绒毛高度,肌层厚度;同时每张切 片取2个视野,观察每个视野内的绒毛数量,以其均值作为测 定数据,均以任意单位示. 1.3.2免疫组织化学染色每只动物取3张不连续切片,行 免疫组织化学染色. 1.3.2.1交感神经TH免疫组化染色抗酪氨酸羟化酶抗体 为CHEMICON公司产品,Envision放大显色系统工作液购自丹 麦DAKO公司.切片脱蜡后人蒸馏水取出,3%双氧水中10 min灭活内原酶,蒸馏水洗3次,0.01mol/L枸橼酸钠抗原修复 液中微波炉内96—98~C10min,取出置于室温中20min,蒸馏 ? l850? 水洗3次,入PBS液中10rain,10%羊血清封闭10in,滴加适当 浓度的一抗(TH),4?湿盒过夜.次日取出PBS洗3次,滴加 辣根过氧化物酶(HRP)标记的Envision放大显色系统工作液, 37?中30min,PBS洗3次,切片人DAB显色液中10min,蒸馏 水洗2次,苏木素浅染细胞核.切片脱水,透明,封片.阴性对 照用PBS代替一抗,其余相同. 1.3.2.2PCNA免疫组化染色PNCA试剂为美国Zymed公 司产品,方法同上. 1.3.2.3测定方法随机全盲法200倍光镜下观察,rH,100 倍光镜观察PCNA以半自动图象分析仪摄片,应用Imagepro plus图像分析软件测值,每张片取8个视野,以棕色染色为阳 性表达.测定阳性表达的累积光密度(IOD,×10).取平均数 为测定数据,均以任意单位表示. 1.4统计方法所有数据均以方差分析(one—wayANOVA) 进行统计学处理,采用SPSS11.5软件包在计算机上进行. 2结果 2.1HE染色结果自1月龄开始空肠绒毛高度,绒毛数量, 肠壁肌层厚度逐渐增加,至6月龄达到最高,然后逐渐下降. 细长浓密的绒毛出现于6月龄,24月龄大鼠的空肠绒毛稀疏短 而宽阔,肠壁肌层菲薄.图象分析结果显示24月龄组大鼠空 肠绒毛高度明显低于1,6,12月龄组(P<0.01);绒毛数量明显 低于6,18月龄组(P<0.01);肠壁肌层厚度明显低于3,6,18 月龄组(P<0.01)(图1,表1). 2.2空肠肠壁交感神经TH,肠黏膜PCNA免疫组化染色结果 大鼠空肠交感神经TH阳性表达主要位于空肠肠壁肌间神经 丛,镜下表现神经纤维横断面为棕色,阴性对照不显色.1月龄 阳性表达的神经纤维散在分布于肠壁肌层,横断面呈圆形或椭 国老年学杂志2007年l0月第27卷 圆形棕色点状,其后阳性表达的神终纤维逐渐密集;6月龄达到 最强,随后逐渐减弱;24月龄大鼠空肠肠壁阳性表达的神经纤 维稀少而纤细,部分区域呈细丝状.PCNA阳性颗粒为棕黄色, 佗于细胞核内,阴性对照片细胞核不显色.本实验显示阳性细 胞主要位于空肠黏膜绒毛的基底部和肠隐窝,随年龄的改变与 空肠交感神经TH阳性表达随增龄的变化趋势相似.应用Im- ageproplus图象分析软件进行半定量,6月龄大鼠空肠PCNA, 空肠交感神经TH阳性表达水平最高,24月龄时显着减弱.经 统计学分析表明24月龄组大鼠空肠交感神经TH阳性表达明 显弱于J…3612月龄组(P<0.05,P<0.01)(图2);24月龄 表1不同月龄大鼠空肠绒毛HE染色结果 与24月龄相比:1)P<O.05,2)P<O.01;下表同 表2PCNA,交感神经TIt免疫组化染色结果 A1月龄;B3月龄;C6月龄;D12月龄;E18月龄;F24月龄 图1空肠HE染色病理图片(~40) 崔宏力等大鼠空肠形态学及肠壁交感神经的增龄变化第l9期 A1月龄;B3月龄;C6月龄;D12月龄;El8月龄;F24月龄 图2不同月龄大鼠空肠肌层交感神经酪氨酸羟化酶免疫组化染色(x200) A1月龄;B3月龄;C6月龄;D12月龄;E18月龄;F24月龄 图3不同月龄大鼠空肠PNCA免疫组织化学染色(×100) 大鼠空肠PCNA阳性表达明显弱于3,6,12月龄组(P<0.01) (图3,表2). 3讨论 本研究发现大鼠空肠绒毛的高度,数量及空肠肌层厚度存 在着随增龄变化趋势:自1月龄开始增加,6月龄时达到高峰, 而后逐渐下降,24月龄明显降低.同时,对小肠细胞PCNA的 观察发现,随增龄其阳性表达也存在着相同的变化趋势.小肠 上皮细胞是哺乳动物体内增生最活跃的组织,它的更新和再生 保持着数量的动态平衡,小肠细胞的周期仅为12h….不同生 理状态下小肠细胞生长能力是维持小肠正常形态,结构和功能 的关键.大鼠鼠龄相对于人的年龄阶段的关系如下:1,3,6, ? l852? 12,18,24月龄大鼠分别相当于人类的3—5岁,10—12岁,18— 20岁,35—4JD岁,50—55岁,65—70岁.因此笔者选择1,3,6, 12,18,24月龄大鼠观察增龄变化过程.由于水,糖类,蛋白质 和脂肪的消化产物主要是在十二指肠和空肠吸收,因此本实验 将空肠上段做为研究对象.本研究结果证明,在6月龄(壮 年),机体处于最活跃的代谢状态,这时对空肠能量吸收能力的 要求是最高的,同时空肠细胞的磨损,死亡数量也是最多的. 为了适应这种生理状态,大鼠空肠细胞生长,修复能力也达到 了最高水平,以保证空肠在这种状态下的充分的吸收面积.然 而,老化状态下(24月龄),大鼠空肠细胞的增殖能力明显减弱, 这可能破坏了空肠细胞生长与死亡的动态平衡,大鼠空肠对外 界环境变化的适应能力下降,大鼠空肠细胞的数量逐渐减少. 导致大鼠空肠绒毛数量减少,在空肠形态学的表现为24月龄 大鼠空肠绒毛低矮宽阔,稀疏,甚至肿胀等,造成了空肠吸收面 积的减少,空肠吸收功能减退.此与Martin等的研究结果相 似:对5—32个月9个年龄阶段小鼠进行的研究显示,肠隐窝和 绒毛数量随年龄变化存在着统计学差异,在7月龄时最高. 消化道功能是在神经和体液的调节下完成的,肠道的神经 系统不仅分泌不同的神经递质以兴奋和抑制肠道运动和腺体 分泌.],而且拥有体内最大的免疫系统,它的功能是分辩来 自食物的抗原,细菌和寄生虫,保护机体免受来自外界环境的 毒物和刺激物的损害,保证机体内环境的稳定].20年来的 研究证明,交感神经系统做为肠道神经系统的组成部分,不仅 释放去甲肾上腺素(NE)抑制肠道的蠕动以达到肠道容受性舒 张的作用,而且交感神经支配所有的淋巴组织,调节着机体的 免疫反应’.研究发现在脓毒症时肠道是NE的主要来 源[13,14].正因为脓毒症时肠源性NE释放的增加,促使人们对 肠道NE生物合成的变化进行观察.脓毒症时对于小肠NE合 成的限速酶一TH的研究发现,在脓毒症早期和晚期阶段,肠 源性NE的升高是由TH的蛋白和基因表达增加所引起的”. 同时在小肠移植的研究中也将TH作为完全外来神经去神经支 配的观察指标.所以本研究也把TH做为观察交感神经数 量和功能变化的一个指标. 本研究对大鼠空肠的肌间神经丛交感神经TH做了免疫组 织化学染色观察,发现大鼠空肠肌间神经丛TH同样存在着随 龄变化趋势:自1月龄时大鼠空肠肌间神经丛交感神经TH阳 性表达逐增强,至6月龄时达到最高,其后逐渐下降,24月龄时 表达明显降低.说明由于TH的降低引起NE合成的下降,可 能导致空肠功能的进一步改变.一方面,对空肠运动功能的影 响,由于NE的释放,同时结合其他抑制性神经递质,可引起空 肠的容受性舒张,这一点对空肠来说相当重要.空肠的容受性 舒张使得食物能够在空肠与消化酶充分接触,营养物质得以充 分的消化和吸收.从本研究的结果来看,在青壮年大鼠空肠肌 间神经丛交感神经NE合成最为活跃,空肠的容受性舒张能力 最强,结合其最大的吸收面积,可以说青壮年大鼠的吸收能力 最强,当然这也与其旺盛的新陈代谢能力有关.反观老龄大鼠 (24月龄),空肠肌间神经丛交感神经NE合成能力显着减弱, 空肠容受性舒张能力明显下降,结合其最小的吸收面积,可以 认为老年大鼠空肠吸收功能最弱,这可能与其较低的新陈代谢 中国老年学杂志2007年l0月第27卷 水平有关.也可认为这种表现与肠壁肌层的强弱相适应,青壮 年和老年大鼠分别有其最强与最弱的肌层,是否可以考虑空肠 肌间神经丛交感神经合成NE的能力在老年状态下降低是对其 肌层减弱的另一种适应,这个推断仍然需要进一步的研究证 实.但不能否认的是NE合成能力的降低是在生理情况下发生 的,一旦处于应激状态,NE含量下降,可能更突显空肠功能的 不良.另一方面,在肠道免疫问上,去甲肾上腺素能神经纤 维释放NE可通过特殊的d,13受体作用于免疫细胞来调节免疫 反应,在应激的状态下,局部释放的去甲肾上腺素,或儿茶酚胺 比如肾上腺素,影响淋巴细胞的运动,循环和增生,同时影响着 淋巴因子的产生和不同类型的淋巴细胞活化.对人类的调 查显示,老年人与肠道有关的感染性疾病和肿瘤的发病率与死 亡率明显增加,感染性疾病在导致老年人死亡和损害健康的疾 病中占第4位,WHO公布的资料表明老年群体因胃肠道感染 性疾病所致的死亡率较年轻群体增加了400倍,此外,在住院 病人中25%的胃肠炎患者是60岁以上的老年人,同时85%死 于腹泻].本研究发现在老年期NE合成的减弱,可能导致老 年个体在遭受感染因素的应激情况下,机体免疫反应的降低, 是否可以认为NE合成能力的减弱是老年个体肠道免疫和免疫 功能降低的原因之一,还需要进一步的系统研究证明. 总之,空肠在老年状态下的这些结构水平变化,提示在应 激状态下,一定要注意空肠功能的保护.进一步研究老年状态 下空肠的分子生物学变化,寻找改善和保护空肠功能的新型小 分子治疗药物可能具有潜在的应用价值. 4参考文献 1liboshiY,NezuR,KennedyM,et.T0t8lparenteralnutritiondecreases luminalmucousgelandincreasedpermeabilityofsmallinstestine(J].J ParentEntNutr,1994;18(4):346-50. 2施新猷.医用实验动物学(M].北京:人民军医出版社,1999:388. 3MartinK,KirkwoodTBL,PattenCS.AgechangesinstemceHsofmurine smallintestinalcrypts[J).ExpCellRes,1998;241(2):316-23. 4KadowakiM,YonedaS,TakakiM.Involvementofapurinergicpathwayin thesympatheticregulationofmotilityinratileum[J].AutonNeurosci, 2003;104(1):10-6 5HalleTD.肠神经内分泌[J].国外医学?外科学分册,1992;4:203. 6姚泰.生理学(M].北京:人民卫生出版社,2001:220-2. 7FumessJB.Typesofneuronsintheentericnervoussystem(J].JAuton NervousSystem,2000;81(1):87-96. 8PalmerJM,Greenwood—VanMeerveldB.Integrativeneuroimmunomod ula— tionofgastrointestinalfunctionduringentericparasitism[J].JParasitol, 2001;87:483-504. 9SharkeyKA,MaweGM.Neumimmuneandepithelialinteractionsinintes— tinalinflammation[J].CurtOpinPharmacol,2002;87(2):669-77. 10ElenkovIJ.WilderRL.ChrousosGP,et.Thesympatheticnerve—an integrativeinterfacebetweentwosupersystcms:thebrainandtheim- munesystem[J].PharmacolRev,2000;52(4):595-638. 11SandersVM,S~aubRH.Norepinephrine,thebeta—adrenergicreceptor, andimmunity[J].BrainBehavImmun,2002;16:290—332. 12StraubRH,MayerM,KreutzM,eta1.Neurotransmittersofthesympa— theticnerveterminalalepowerfulchemoattractantsform0nocy,es[J].J 赵珩等去卵巢后痴呆大鼠模型B淀粉样蛋白及tau蛋白的变化及倍 美力的干预作用第l9期 Leukoc,Biol,2OOO;67(4):553-8. 13HahnPY,WangP,TaitSM,eta1.Sustainedelevationincirculatingcate— cholaminelevelsdufngpolymlcmbialsepsis[J].Shock,1995;4:269- 73. 14YangS,KooDJ,ZhouM,eta1.Gut—derivednorepinephrineplaysacfiti? 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[2007-07—10收稿2007-08-01修回] (编辑宋秀芝) 去卵巢后痴呆大鼠模型p淀粉样蛋白及tau蛋白的变化及倍美力的 干预作用 赵珩于振香张海英张昱李晶(吉林大学第一医院老年病科,吉林长春130021) [摘要]目的观察去卵巢后痴呆大鼠模型海马CA1区B淀粉样蛋白(AB)及tau蛋白阳性神经元的变化及倍美力(Premain)对其的影响, 探讨倍美力的脑保护作用机制.方法采用穹窿海马伞切除术制备AD模型鼠,切除穹窿海马伞,双侧卵巢切除制备痴呆及雌激素缺乏复合模型 鼠,采用Morris水迷宫观察其行为学改变,利用免疫组织化学染色法测定大鼠海马CA1区AB及tau蛋白阳性神经元的表达.结果倍美力治疗组 大鼠学习,记忆能力增强,海马CA1区AB及tall蛋白阳性神经元的表达低于正常组及模型组.结论倍美力有助于改善痴呆及雌激素缺乏复合模 型鼠的学习及记忆能力. 【关键词]倍美力;老年性痴呆;B淀粉样蛋白(AB):taU蛋白 [中圈分类号】R749.16[文献标识码】A(文章编号】1005-9202(2007)19-1853-03 Changesofamyioidbetaandtauproteinintheovarie~~tomizeddementiamo delratsandtheinterventioneffectofPremain ZHAOHeng,YUZhen-Xiang,ZHANGHai-Ying,eta1. DepartmentofGeriatrics,TheFirstHospitalofJi~inUniversity,Changchun130021,Jflin,China 【Abstract】 ObjectiveToobservethechangesofpositivecellsofamyloidbeta(At3)andtauproteininhippocampusCA1regionof theovariectomizeddementiamodelratsandtheeffectofPremainonittodiSCUSStheactionmechanismofprotectionofPremainon brain.MethodsThedementiaandhormonopriviamodelratswereestablishedbyovariectomyandtransectedhippocampalfimbria-fomix~ TheabilityoflearningandmemoryweretestedwithMorriswatermazeandthepositivecellsofAt3andtauproteininhippocampusCA1re— gionweremeasuredwithimmunohistochemistry.ResultsTheabilityoflearningandmemorywereincreasedobviouslyinPremaingroup. TheexpressionofAt3andtauproteinwasdecreasedsignificantlyinPremaingroupcomparedwiththoseofmodelandcontrol groups.ConclusionsPremaincouldimprovetheabilityoflearningandmemorybydecreasingthelevelofAt3andtauproteininhippocam— pusCA1regionindementiaandhormonopriviamodelrats. 【Keywords】 Premain;Alzheimersdisease(AD);Amyloidbeta(At3);tauprotein 流行病学调查表明,AD的发病率有着明显的性别差异,绝 经后妇女的发病率较同年龄组的男性高出1.5—3倍,雌激 素水平的下降可能是导致AD的原因之一.研究证实雌激素 替代治疗可改善AD患者的认知能力,减少AD的发生,但其机 制尚不清楚.大鼠双侧穹窿海马伞切除术是较理想的AD模 型,本研究在此基础上切除大鼠双侧卵巢建立雌激素缺乏AD 复合模型鼠,补充雌激素一倍美力,检测海马CA1区At3及tau 蛋白阳性神经元的表达,探讨雌激素的脑保护作用机制. 基金项目:吉林省发展计划委员会基金资助课题(2005-2008) l江苏省泰州市人民医院神经内科 通讯作者:张昱(1942-),女,教授,博士生导师,主要从事老年痴呆及 脑血管病研究. 作者简介:赵珩(1965一),女,在读博士,主要从事老年痴呆及脑血管 病研究. 1材料与方法 1.1试剂与仪器雌激素(倍美力Premain)购自上海通用药 业股份有限公司;AB和tau均为兔抗大鼠抗体,购自北京博奥 素公司;免疫组化sP法试剂盒,DAB显色试剂盒购自福州迈新 试剂公司.水迷宫试验装置(MorrisWaterMazeLW—II型)购自 中国医学科学院药物研究所. 1.2方法 1.2.1动物分组与模型制作健康雌性Wister大鼠3O只,鼠 龄4个月,体重250—300g,由吉林大学基础医学部实验动物 中崾供.将大鼠随机分成倍美力组(premaingroup),模型组 (modelgroup)及对照组(controlgroup)各10只.倍美力组及模 型组:用10%水合氯醛0.33ml/100g腹腔麻醉动物,将其固定 在大鼠脑立体定位仪上,参照大鼠脑立体定位图谱取前囟后 2.2mm,中线左右各旁开l_0mm处,牙钻钻开颅骨,切开骨