肾透明细胞癌之ALK融合基因表达及功能研究.doc

肾透明细胞癌之ALK融合基因达及功能研究.doc 肾透明细胞癌之ALK融合基因表达及功能研究 前 言 肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于膀胱癌[1]。目前，在全球肿瘤新病例中，肾癌发病率以平均每年 2.5% 的速度增长，占所有新发肿瘤的 2%,3%[2]。每年全球有 273,518 名肾癌新发病例，并有 116,368例患者因该病而死亡。而在中国，每年新发病例有 32,508 例，死于该病有10,675 例[3]。肾癌起源于肾实质中肾小管上皮细胞，又称肾细胞癌。肾细胞癌的病理类型多样，最常见病理类型是肾透明细胞癌，约占肾癌的 80%,85%[4]。近年来，影像学的发展给患者带来福音，使得多数肾癌患者在诊断时属于局限性肾癌，手术切除可以治愈大部分早期患者，预后较好，5 年生存率?期65%,93%、?期 47%,77%，但是仍有 20%,40%的患者手术后出现复发或者远处转移[5]。然而，近三分之一的患者在确诊时已出现远处转移。特别是转移性肾癌的预后相当差，5 年生存率不到 10%[5,6]。因此，临床上面临的一项重大挑战是晚期转移性肾癌的患者如何寻找新的诊断和治疗方法。随着肾癌发病分子机理阐明和报道，使得在分子水平上针对其发病机制研发新靶点药物成为可能，如抑癌基因 VHL 在 80%的肾透明细胞癌患者中存在失活，从而激活 mTOR 信号通路，诱导 VEGF 的表达。因此，针对此信号 通 路 的 分 子 靶 向 药 物 成 为 研 究 的 热 点 并 先 后 问 世 : 贝 伐 单 抗bevacizumab)，舒尼替尼sunitinib)，索拉非尼sorafenib)，替西莫司temsirolimus)，依维莫司everolimus)，帕唑帕尼pazopanib)和阿西替尼axitinib)[7]，已经成为晚期转移性肾癌治疗的一二线药物，虽然在治疗上带来令人鼓舞的成绩，但是达到完全缓解无病生存的患者还是很少。 ALK 基因编码细胞膜受体蛋白，属于酪氨酸激酶受体家族。在生理状态下，配体与受体相结合后引起 ALK 二聚化，继而胞内酪氨酸残基磷酸化，活化下游信号通路[8]。在 ALCL 中首次发现 ALK 基因与 NPM 形成融合基因具有致癌活性[9]。后继研究在 IMT、NSCLC 和卵巢癌中发现有 ALK 异位形成新的融合基因[10,11,12]。在 NB 中也有 ALK 基因突变的报道[13]。此外，在炎性乳腺癌、食管癌、NB 中发现有 ALK 基因扩增[14,15,16]。PI3K/AKT、RAS/Raf/MEK/ERK 和 JAK/STAT3 等下游信号通路由于 ALK 基因突变、扩增或者形成新的融合基因异常激活，参与肿 瘤的发生发展[17]。2007 年，日本学者 Soda 等首次报道在肺腺癌患者手术标本中发现EML4-ALK 融合基因。进一步研究将转染 EML4-ALK 融合基因的小鼠 3T3成纤维细胞接种到裸鼠体内成瘤[11]。其他学者报道 EML4-ALK 融合基因阳性的人体肺癌组织中 ALK 基因 mRNA 水平显著升高[18]。这些研究证实了EML4-ALK 融合基因具有致瘤作用，在 NSCLC 发生发展中起着至关重要的作用。因此，针对 ALK 的靶向治疗成为肿瘤治疗研究的热点。而在临床上已经报道多例 ALK 抑制剂用于 NSCLC、ACLC、IMT 的治疗[19,20]。克唑替尼Crizotinib)是一种 ALK 抑制剂，Crizotinib 与 ATP 竞争性结合 ALK 激酶催化区域起到抑制 ALK 作用[21]。细胞学实验证实，Crizotinib对 ALCL、NSCLC 及 NB 等肿瘤中某些有 ALK 扩增或易位的细胞株具有抑制作用[22]。2011 年 8 月，由于 Crizotinib 在临床试验中取得良好的临床疗效，FDA 批准 Crizotinib 用于 NSCLC 的治疗[23]。目前研究表明，EML4-ALK 融合基因的发现和其抑制剂良好的治疗前景为肿瘤患者的靶向治疗开辟了新的道路[24]。 第一部分 ALK 融合基因在肾透明细胞癌中的表达 1.实验 收集 25 对和 62 对肾透明细胞癌及其对应的癌旁组织，分别来自解放军总医院和第二军医大学附属长海医院在 2011 年至 2013 年期间接受手术切除的肾透明细胞癌。所有标本均获取患者本人书面同意并且本研究通过中国人民解放军总医院和长海医院伦理委员会批准。标本收集严格遵守标本管理相关规定，标本离体后立即切成 3 小块，其中一块组织放入 10%福尔马林固定液中固定。另一小块放入 RNAlater 中，最后一块放入液氮罐中长期保存。患者临床病理资料见表 1.1。 1.2 实验试剂 (1) 10%福尔马林固定液上海亿欣生物科技有限公司) (2) RNAlater德国 Qiagen 公司) (3) 二甲苯溶液上海紫一试剂厂) (4) 乙醇台山市众城化工有限公司) (5) 30% 过氧化氢江阴市通途商贸有限公司) (6) 山羊血清封闭液北京市中杉金桥生物技术有限公司) (7) EDTA 抗原修复液北京市中杉金桥生物技术有限公司) (8) 一抗稀释液北京市中杉金桥生物技术有限公司) (9) ALK(D5F3)XP Rabbit MAb美国 Cell Signaling 公司) (10) Dako REAL TM EnVision TM Detection System, Peroxidase/DAB+,Rabbit/Mouse丹麦 Dakota 公司) (11) 二氨基联苯胺北京市中杉金桥生物技术有限公司) (12) 苏木精和伊红北京市中杉金桥生物技术有限公司) (13) 盖玻片北京市中杉金桥生物技术有限公司) (14) Ttizol美国 Invitrogen 公司) (15) 氯仿上海志纯有机玻璃制品有限公司) (16) 异丙醇上海江莱生物科技有限公司) (17) ReverAid First Stand CDNA Synthesis Kit美国 Thermo Scientific 公司) (18) GoTaq Green Master Mix美国 Promega 公司) (19) 琼脂糖英国 OXOID 公司) (20) DNA 分子 Marker:Marker D2000、Marker I、II、HI、IV北京天根生化科技有限公司) 2.实验方法 PCR 扩增目的 DNA 片段:采用 PCR 技术从表达 EML4-ALK variant 1 和EML4-ALK K589MEML4-ALK 激酶结构域中 ATP 结合位点上核苷酸 589处的赖氨酸被甲硫氨酸所取代，失去激酶的活性)质粒中扩增出所需的EML4-ALK variant 1 和 EML4-ALK K589M 基因片段。其中表达EML4-ALK variant 1 和 EML4-ALK K589M 质粒由日本 Manabu Soda 教授赠送。转化和挑单克隆:将含有目的片段的 PCR 产物和和 pLVX-IRES-Puro 载体转化进入大肠杆菌菌株 DH5α 感受态细胞，将菌体均匀的涂布在含丁氨卡那霉素抗生素平板上。将平板放在 37?温箱孵育 8-10 h 培养，取出平板，在每个 5ml LB 培养液中加入 5μl 丁氨卡那霉素，挑单克隆，挑单克隆过程中注意无菌观念，每三个靠近的菌落中挑选一个，所挑选菌落应有大有小，每个平板各挑 8 个 LB 管，置于摇床中 8,9 h。 .. 第三部分 EML4-ALK 融合基因表达.....41 1. 实验材料............41 2. 实验方法............42 3. 实验结果............43 3.1 细胞生长曲线和克隆形成实验 ........43 3.2 ALK 抑制剂 TAE684 生长抑制实验 .......44 3.3 裸鼠皮下成瘤实验.......45 4(实验讨论...........46 第三部分 EML4-ALK 融合基因表达对 HK-2 细胞功能学的研究 1.实验材料 1.1 细胞株 (1) 空载体 HK-2 细胞株 (2) 表达 EML4-ALK variant 1 HK-2 稳转细胞株 (3) 表达 EML4-ALK K589M HK-2 稳转细胞株 1.2实验动物 雌性 Balb/c 裸鼠SPF 级):6,8 周龄，购自北京市维通利华实验动物技术有限公司，饲养于解放军医学院的动物中心，灭菌水和饲料供自由摄入，SPF清洁级。 . 结论 本研究首次在肾透明细胞癌中发现 EML4-ALK 融合基因，为进一步明确其在肾透明细胞癌中的作用，我们构建并获得长时间稳定表达 EML4-ALK 的人肾近曲小管上皮细胞 HK-2 细胞株。为了明确 EML4-ALK 对 HK-2 细胞在体内和体外对生长增殖的作用，首先进行体外功能学研究。通过超速流式细胞分选系统给细胞进行计数，经培养后每隔 3 天计数，直至 15 天，绘制细胞生长曲线，从结果上来看，HK-2EML4-ALK variant 1 组细胞生长明显优于 HK-2 空载体组和 HK-2EML4-ALK K589M 组的细胞。克隆形成实验结果也表明，相对于 HK-2 空载体组和 HK-2 EML4-ALK K589M 组， HK-2 EML4-ALK variant 1 组克隆形成率明显增加。从细胞生长曲线和集落形成试验结果是一致，EML4-ALK variant 1 能增强细胞的生长和增殖的能力。TAE684 是一种有效的，选择性的 ALK 抑制剂，能选择性有效抑制 ALK 激酶。文献报道能有效抑制Ba/F3 NPM-ALK细胞和表达NPM-ALK人类ALCL细胞的增殖[44,45]。因此，通过检测 TAE684 对表达 EML4-ALK HK-2 细胞的生长抑制情况，为下一步在肾透明细胞癌中使用 ALK 抑制剂奠定实验基础。根据文献报道[46,47]在细胞系研究中浓度选择从 1nM,10μM 范围。细胞接种到 96 孔板生长，并按 1nM,10μM 浓度加入 TAE684，72 小时后用 CellTiter-Glo 发光法检测 HK-2 空载体组、HK-2EML4-ALK variant 1 组和 HK-2EML4-ALK K589M 组细胞的活力，从而反应细胞增殖和存活情况。随着 TAE684 浓度增加，细胞生长速率明显减慢，与 HK-2空载体组和 HK-2 EML4-ALK K589M 组相比较，在 HK-2 EML4-ALK variant 1 组细胞生长抑制更加明显。从测定 IC50 结果来看，HK-2 空载体组 IC50 为 2.590μM，HK-2 EML4-ALK variant 1 组 IC50 为 0.340μM，HK-2 EML4-ALK K589M 组 IC50为 1.216μM。Luciferase 表达系统和 IC50 结果说明 TAE684 能选择性作用于EML4-ALK variant 1 组细胞，抑制 EML4-ALK variant 1 HK-2 细胞的增殖。 ..........