甲壳素研究和应用

《中国食品添加剂》 China Food Additives 20o4 No．1 甲壳素研究和应用 郎亚军 张苓花 王运吉 (大连轻工业学院生物与食品工程系，大连 1 16034) 摘要：本文简要介绍了甲壳素和壳聚糖的结构、理化性质及制备，重点对酶法生产甲壳素涉及的酶及甲 壳素酶的基因工程进行了综述，最后对甲壳素及壳聚糖的应用与发展作以展望。 关键词：甲壳素，壳聚糖，甲壳素酶，微生物发酵，基因工程 The Research and Application of Chitin ng ， 岫 ，W ang YmSi (Biotechnology&Food Department，Dalian insfitude of Light Industry，Dalian 1 16034) Abstract：The article briefly introduced the structure，pwperty and preparation of出 liI1 and chitosan，and slⅡm zed the chitinase and the gene engeering of the chitinase．In the last．pointed out the research development of c}litin and chitosan． KeyWOI~ ：Chitin，Chitosan，Chitinase，Microorganismfermentation，Gene e 吨 前言 甲壳素(chitin)又名几丁质，是 自然界中含量 仅次于纤维素的一种多糖，同时，也是地球上数量 最大的含氮有机化合物。其在自然界中主要存在 于节肢动物(主要是甲壳纲如虾、蟹等，含甲壳素高 达 58 85％)、软体动物、环节动物、原生动物、腔 肠动物、海藻及真菌等中，另外在动物的关节、蹄、 足的坚硬部分，动物肌肉与骨结合处，以及低等植 物中均发现有甲壳素的存在。 壳聚糖是甲壳素脱去大部分乙酰基后的产物， 是甲壳素最为重要的衍生物。自从 1811年，法国 科学家H．Braconnnot发现甲壳素以来，甲壳素逐渐 被认识与利用。近年来，国内外相关的研究13趋活 跃，甲壳素和壳聚糖已被现代科学称之为继糖、蛋 白质、脂肪、维生素、矿物质等五大生命要素之后的 第六生命要素。甲壳素和壳聚糖经过改性之后生 成的改性高分子具有无毒、可以完全被生物降解、 在自然界形成良性循环等诸多优点，显示了良好的 应用前景。 l 结构及理化性质 1．1 结构 甲壳素是一种天然高分子化合物，其学名是 B 一 (1—4)一2一乙酰氨基 一2一脱氧 一D一葡萄糖， 是由N一乙酰氨基葡萄糖以 一1，4糖苷键缩合而 成的。 如果把此结构式中糖基上的N一乙酰基大部分 去掉的话，就成为甲壳素最为重要的衍生物壳聚糖。 1．2 理化性质 1．2．1 物理性质 甲壳素是白色或灰白色无定型、半透明固体，相 对分子质量因原料不同而有数十万至数百万，不溶于 水、稀酸、稀碱、浓碱、一般有机溶剂，可溶于浓的盐 酸、硫酸、磷酸和无水甲酸，但同时主链发生降解L7J。 壳聚糖是白色无定型、半透明、略有珍珠光泽 的固体，因原料不同和制备方法不同，相对分子质 量也从数十万至数百万不等，不溶于水和碱溶液， 可溶于稀的盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸， 不溶于稀的硫酸、磷酸。在稀酸中，壳聚糖的主链 83 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2004 No．1 也会缓慢水解，溶液的粘度逐渐降低。 1．2．2 化学性质 甲壳素和壳聚糖化学性质的研究，内容十分广 泛，其分子结构当中含有羟基、氨基和自由基，可以 发生酰化、酯化、醚化、氧化、烷基化、螯合、接枝共聚 及交联等一系列化学反应，这对于研究认识它们的 本质，进行创新性工作，开发新产品有重要意义。 2 制备方法 2．1 甲壳素制备方法 甲壳素的生产一般采取以虾、蟹为原材料脱 钙、脱蛋白和脱乙酰的传统基本工艺，耗碱量极大 且污染严重。随着研究的深入，为了解决原材料单 一 ，污染严重等一系列问题，又发展了微生物法、微 波法和生物制备法等来生产甲壳素和壳聚糖及他 们的衍生物。 2．1．1 提取法 提取法的工序一般为： 虾蟹壳一洗涤一晒干一脱钙一洗涤一脱蛋白 一 洗涤一干燥一粉碎一甲壳素 近十几年来，以蛆皮、蚕蛹壳、蝉蜕、掸子虫、鲍 壳⋯1、云南琵琶甲[ 、中国鲎 3、蜚蠊[ 、鱿鱼骨和乌 贼骨L6j为原料生产甲壳素和壳聚糖也有研究报道。 2．1．2 微生物法 甲壳素的生产一直以来都是采取虾蟹壳单一 原料，采用其他原料生产的非常之少，根据文献 5 可了解我国甲壳素生产存在的问题。 甲壳素是绝大多数真菌细胞壁的主要组成成 分，是真菌菌丝尖端延长部位的主要组分，甲壳素的 生成与真菌菌丝的生长有密切的关系。已有的研究 主要是从柠檬酸发酵废菌丝体中提取，另外，也可从 青霉素、链霉素等发酵废液滤出菌丝体中提取。 近几年来，国内已经研究和开发直接培养真菌 制取甲壳素或直接提取壳聚糖的技术。黑曲霉是 发酵工业最常用的真菌，同时也是含有甲壳素最多 的真菌 8，通过培养黑曲霉菌来生产甲壳素和壳聚 糖 ，这可能使用微生物法生产甲壳素和壳聚糖最有 前途的方法【 。由雅致放射毛霉(Accimonueor el— egams)及鲁氏毛霉(Mucor )[ J等丝状真菌 生产甲壳素及壳聚糖近几年也有诸多研究。 2．2 壳聚糖制备方法 2．2．1 微波法 84 微波法是指在甲壳素脱乙酰基生产壳聚糖的 过程中，采用微波加热方式代替电加热或蒸汽加 热。微波辐射促进有机合成是 80年代后期兴起的 一 项有机合成新技术【11j。 采用微波辐射这一新技术来制备壳聚糖，制备 过程快速，脱乙酰度提高，产品粘度也较高，溶解性 良好。但是，微波法同样也存在缺点，即温度较难 控制，反映温度超过 70℃，分子链断裂速度会加 快，粘度下降L7 J。同时，工业生产中的微波炉的设 计要求严格，以防止微波泄漏对人造成伤害。 2．2．2 酶法制备 由于甲壳素分子量很大，水溶性差，在人体内 不易被吸收。而壳聚糖及其衍生物是其经过降解 生成的一类低聚物，溶解度较高，所以表现的生物 活性也就更加明显。 酶解法又称为生物降解法，即用专一性或非专一 性酶对甲壳素进行降解，制得甲壳低聚糖。与其他三 种方法相比较，采用酶解法生产具有工艺简单，条件 温和，无污染，易控制降解度等优点。因而，现在对酶 法生产甲壳低聚糖研究 日益深入。相应产生的甲壳 素酶学已成为甲壳素学研究的—个重要分支。 3 甲壳素分解代谢过程中涉及的相关酶 3．1 甲壳素酶 甲壳素酶(Chitinase)又称几丁质酶，广泛分布 于细菌、真菌、放线菌等微生物体内，植物的茎、叶、 种子及愈伤组织以及动物的消化液、腺体、胃和肠 粘膜等部位。甲壳素酶的分类及作用机制如表 1。 表 1 甲壳素酶的分类及作用机制 近年来，对来源于植物和微生物的甲壳素酶的 分子量、等电点、Km等酶学性质以及影响酶活性 的温度、pH、金属离子、离子强度等因素已进行 了 大量的研究。目前，动物来源的甲壳素酶的研究尚 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2004 No．1 较薄弱。产生甲壳素酶的微生物如表2所示。参 考文献[16—18 263。 表 2 甲壳素酶的微生物来源 对于产生甲壳素酶的动物种类主要有两栖类、 鸟类及昆虫类等，如蜗牛、鲫鱼、蜥蜴、麻雀、蟑螂、 白蚁、蝙蝠和鳕鱼等。研究表明，动物来源的该种 酶，主要分布于动物的消化液、腺体、胃和肠粘膜等 部位，属于内切酶，甲壳素酶的有无与食物有关，其 原因可能是动物捕食含有甲壳素的猎物所致E163。 在研究鳕鱼(Gadus morhua)几丁质酶时，发现几丁 质酶的分泌与季节有关，这与食物的季节变化不无 关系[17]。 3^．2 壳聚糖酶 壳聚糖酶(chitosanase)和甲壳素酶同属于专一 性酶类，催化水解壳聚糖中的氨基葡萄糖糖苷键。 它主要存在于真菌和细菌细胞中，在单子叶和双子 叶植物中也发现有该酶的活性【203。 不同来源的壳聚糖酶的水解作用根据底物不 同而产生不同的产物。壳聚糖酶也可以分为两种， 即内切酶和外切酶，作用于底物最终得到的主要是 二聚体和三聚体的降解产物和其他低聚糖。 壳聚糖酶的生产被研究较多的是将壳聚糖酶 基因克隆到链霉菌(Streptomyces lividans)上，从而获 得高活性胞外壳聚糖酶【22]。 3．3 非专一性酶类 许多非专一性的酶对甲壳素及壳聚糖也有水 解作用。迄今为止，已经发现有 30多种酶对甲壳 素及壳聚糖有非专一性的降解作用。这些酶主要 来源于动物、植物和微生物，包括糖酶、蛋白酶、脂 肪酶等。 在此类酶中，比较重要的有纤维素酶、溶菌酶、 脂肪酶、甲壳素脱乙酰基酶、壳聚糖脱乙酰基酶、木 瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等。近年来，对甲壳素及壳 聚糖的非专一性酶类的研究较多，且非专一性酶类 比甲壳素酶经济上便宜得多，所以非专一性酶类的 研究及使用具有广阔的前景。 非专一性酶类对甲壳素和壳聚糖也有较好的 降解作用，各种酶的降解机理并不完全相同，但是 几种非专一性酶混合使用降解效果却好于单一的 非专一性酶的作用。 4 甲壳素酶的基因工程 来源于植物和微生物的甲壳素酶一直是研究 的热点。迄今为止，已经克隆出许多源自细菌、真 菌、植物的甲壳素酶基因，成功的构建了大肠杆菌、 链霉菌以及酵母菌等许多工程菌。粘质沙雷氏菌 (Serratia mnrcescens)是研究最为热门的微生物之 一 [I3] 。 同时，采用基因工程，把外源植物的甲壳素 酶的基因进行克隆，构建转基因植物，提高植物抗 性的研究也 日益深人。到目前为止，已对烟草、马 铃薯、油菜、甜菜、胡萝 卜、豌豆、菜豆、黄瓜、拟南 芥、花生、水稻、大麦、杨树等植物的几丁质酶基因 进行了cDNA克隆和序列分析【19,23,27]。 5 甲壳素和壳聚糖的应用 甲壳素作为一种天然高分子化合物，无毒无 味、耐热耐腐蚀、可生物降解，并具有独特的生理活 性。近十几年来，甲壳素和壳聚糖在医药工业、食 品工业、农业、纺织业、造纸业、化妆品、印染、膜材 料、催化及分析化学等众多领域发挥越来越重要的 作用。具体见表 3。 表 3 甲壳素和壳聚糖的应用 应用领域 应 用 医药工业 固定化酶、药物控释载体、絮凝剂、吸附剂、人工透 析膜、医用辅料、人造皮肤、保健剂、色谱载体、分子 筛、手术缝合线、止血材料、医用敷料、药用胶囊、注 射剂、抗凝血剂 食品工业 保鲜剂、防腐剂、澄清剂、、食品添加剂、增稠剂、酶 固定剂、保健剂 水 处 理 絮凝剂、吸附剂、超滤膜、螯合剂 纺织印染 抗菌织物、膜材料、增深剂、上浆剂、整理剂 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 20o4 No．1 化 妆 品 保湿剂 、增粘剂 、乳化稳定剂 造纸工业 施胶剂 、纸张增强剂 、纸张表面改性剂 、抗溶剂 蝴 5 展望 甲壳素作为一种用途广泛的天然高分子化合 物，具有独特的理化性质，除了上述的应用外，可能 还潜在更为广泛的应用领域。我国甲壳素资源丰 富，但是目前生产甲壳素仍然局限于以虾蟹为原料 的提取法上。虽然现在国内已经开展了直接培养 真菌制取甲壳素，但是还未实现普遍的工业化生 产。因此要积极开展此方面的研究，改进工艺技术， 从而打开单一以虾、蟹壳为原料的被动局面。 甲壳素酶学的发展已成为甲壳素研究的一个 重要分支，近年来甲壳素酶的基因工程的研究日益 深入，为甲壳素的生产提供了又一新途径，加速了 甲壳素研究开发的步伐，促进甲壳素类产品生产的 规模化与多样化，使其在国民经济中发挥更重要的 作用。 参考文献 1．陈 忻 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