茶多酚及其氧化产物清除不同体系产生的活性氧自由基的分光光度法 …

第17卷第4期 2 00 0年 4月 精 细 化 _T- F腿 ClⅡ ⅡC vd t7，No 4 Apr 2 0 0 0 茶多酚及其氧化产物清除不同体系产生的 活性氧 自由基的分光光度法研究 一 。 ， (华中农业大学 食品科技系．湖北 武汉 430070) -T 2， (=)6门 > 摘要：用分光光度法测定了茶多酚及其氧化产物对不同体系产生的活性氧 自由基 一和·OH 的清除作用。结果明：对由光照核黄素体系产生的 一．在试验质量浓度范围(8．3～167 u mL)内茶多酚及其氧化产物的最大清除率分别为96 6％和92．1％。对由2-／1~氧．Ⅱ核糖体系产 生的·OH．在实验质量浓度范围(5—800 ug／mL)内茶多酚及其氧化产物的最大清除率分别为 83 4％和88．5％。茶多酚氧化产物，SOD粗酶液，茶多酚对邻苯三酚自氧化产生的 一均表现 出较强的抑制作用，抑翩率分别为66 5％，47 6％．45 3％。茶多酚及其氧化产物与 SOD有显著 的协同增效作用，但氧化产物的效果强于茶多酚。 关键词 茎墨 ；墨至匕 !扭；适丝墨旦直基； 韭 衄 中圄分类号~Q5O3 文献标识码：A 文章编号：1003—5214(2000)04—0241—04 活性氧自由基能引起脂质过氧化作用，引起组织 损伤、细胞功能衰退或丧失，因而导致人体许多疾 病 。活性氧在人体内有三种存在形式： 一、·OH 及H 02，它们是人体新陈代谢的副产物，能损坏生物 分子，导致细胞或组织损坏，并在化学致癌物的致癌 过程中起着不可忽视的作用。抗自由基物质能拮抗 体内过量的自由基。避免组织的氧化损伤，从而预防 相关疾病的发生，维护人体健康。寻找外源性的自由 基清除剂和抗氧化剂已越来越引起人们的重视。大 量研究表明，茶叶中的多酚类化合物具有较强的清除 体内自由基作用及抗氧化作用。台湾国际 Cheng Hsing大学的 YEN Cow．chin．CHEN Hui．yin等 研究 发现，半发酵茶的抗氧化活性大于不发酵茶和发酵 茶 谢笔钧、胡慰望教授 研究发现，茶黄素单酯．2B (TFM-2B)和茶黄素双酯(ⅡD)比表没食子儿茶素没 食子酸酯(EGCG)抑制脂肪氧化酶的作用更强。湖南 医科大学的曹进报道 茶色素具有比儿茶素单体更 优异的抑菌和抗菌毒活性。浙江医科大学心血管专 家楼福庆教授研究表明，茶色素对高血脂症、血液高 牯滞具有很好的预防和治疗作用 。这表明茶多酚 的氧化产物可能比茶多酚具有更优异的生物活性。 收稿13期；1999—09—19 作者通过一定方法制得儿茶素氧化物，并采用分光光 度法测定其在不同体系中清除q 和·OH的作用并 与茶多酚和SOD酶相比较，以探讨其生物活性 1 实验 1．1 材料 茶多酚．四川筠莲茶多酚厂生产；JL茶素氧化产 物的制备：取一定量的高质量分数茶多酚[ (EGCG)>85％]水溶液，加入一定量氧化剂，置磁力 搅拌器上于45 下中速搅拌5 h后终止反应，玲冻 干燥即可。 SOD粗酶液：由华中农业大学食品科技系食品 微生物学研究室提供，系从所培养的食用菌菌丝体 中提取而得。 1．2 实验方法 l 2．1 光照核黄素体系产生0，’一 参照 Be~charp法 。用 pH值为 7．8的0．05 rzol／L混合磷酸盐缓冲液为溶剂，配制含 3．3×10 rzollL核黄索，0．01 mol／L蛋氨酸，4．6×10。mol／L 氯化硝基四氮唑兰(NBT)及各种浓度的儿茶素氧化 产物，在 25 下，4OOO lx照度下光照 30 mln，于 霉 、●／ 芏 新 cI一， 一 一 ⑧ 维普资讯 http://www.cqvip.com 精细化工 F'I~E CHEMICALS 第17卷 560一处测定溶液的吸光度。 1．2．2 2-脱氧一D一棱糖(DR)法产生·OH 依参考文献[7]进行。在洁净干燥的试管中依 次加入0．4mL 50tmnol／L pH值为7 5的KI-I2P仉一 KOH缓冲液，一定浓度的样品，0．1 mL1．04 mmolIL 的EDTA溶液，0．1 mL 10 mmol／L o2溶液，0．1 mL 60 r~moFLDR溶液(对照不加)，0．1ⅡlL 2~-nol／L Vc， 保证各管最终体积为 1 mL，于37。c下保温 1 h后取 出加入 1 mL”(HC1)=25％水溶液终止反应，然后 加1 mLw[硫代巴比妥酸(TBA)]：1％的溶液于沸 水褡上煮沸反应 15 rain，冷却，于532 ml1下比色。 (若有混浊应加入 3 mL正丁醇萃取)。 1．2．3 部苯三酚自氧化体系产生 依参考文献[8]在 20 mL试管中加入 9 mL pH 值为8．2的Tris—HC1缓冲液，于25℃超级恒温水 浴中放置20 min，用微量注射器注入40 25℃预 热的邻苯三酚溶液(45 rmnoL'L~苯三酚于10 nrnol／L HC1中)，立即混匀并倒入 1 cm比色杯中，对照加 9 mLTrls—HCI缓冲液，于温度 25℃下每隔30 B测定 一 次A ，自氧化速率控制在O．06／ram。邻苯三酚 自氧化3 min后，迅速加一滴二硫苏糖醇(ITIT)或 Vc，立即混匀，室温下放置5min后测定 A ，即A。。 2 结果与讨论 2．1 茶多酚及其氧化产物对光照核黄素体系产生 的超氧阴离子自由基 一的清除作用 核黄素在光照条件下产生 ‘， ～能将 NBT 还原为蓝色的甲月替，在 560 nm处测其吸光度为 A，可表示为 ～的含量，加清除剂后能清除 一， 抑制了甲月替的产生，测得其吸光度为Al，则 A— A ，表示 一的减少量。 ● 』 清除率(S)： ×100％ 且 在光照核黄素体中，不同质量浓度的茶多酚及 其氧化物产物，对 ～均有明显清除作用，在低质 量浓度8、3～67 nl1．内，氧化产物的清除作用强 于茶多酚。在实验浓度范围内，茶多酚及其氧化产物 对 ～的最大清除率分别为96、6％和92．1％，实验 结果见表 1。 表 1 茶多酚及其氧化产物对光照核黄索体系产生的 的清除作用 2．2 茶多酚及其氧化物对DR体系产生·OH的清 除作用 2_脱氧一D一核糖法产生·OH的机理如下： 一 EDTA十抗坏血酸—+ 一EDTA十氧化抗坏血酸 (I】 一 EDTA+ q — UH一+-OH十 一EDTA (2) ‘OH十脱氧核糖(DR)— 6a t瑚b— i MDA (3) 2TBA十MDA一 mmo目 (4) 不加清除剂耐吸光度A。，加入清除剂后能清除·OH， 抑制了丙二醛(iDA)的生成，测得吸光度为 A ，试剂 空白吸光度以A：表示，则清除率按下式计算： S ： × 100qb ，l0 结果见表 2。 表2 茶多酚及其氧化产物对2-脱氧一 —核糖体系产生的 ·OH的清除作用 从表2可知，茶多酚及其氧化产物在质量浓度 为5～800 vg／mL时对·OH均有较强的清除作用，并 在一定质量浓度范围内，随着质量浓度增加，清除率 上升，当质量浓度继续增加时，清除率又呈下降趋 势。在实验质量浓度范围内，茶多酚最大清除率为 83．4％，其氧化产物为88．5％。 维普资讯 http://www.cqvip.com 第4期 李春美，等：茶多酚及其氧化产物清腙不同体系产生的活性氧自由基的分光光度法研究 z．3 SOD、茶多酚及其氧化产物对邻苯三酚自氧化 的抑制作用 不加抑制剂的情况下，邻苯三酚自氧化 3 min 后加终止剂终止，测得吸光值 A。，即可表示邻苯三 酚自氧化速率。加入抑制剂后，它们能清除邻苯三 酚自氧化产生的 ‘，从而使邻苯三酚自氧化速率 降低，在上述"Iris—HE1缓冲液中预先加入一定量的 抑制剂(SOD，茶多酚或其氧化产物)，再按上述方法 测定邻苯三酚的自氧化率得到A。，同时做一试剂空 白A． ，则抑制率按如下公式计算： 抑制率(s)：垒_二 _二I生 ×100％ ，lO 经测定，所用SOD粗酶液抑制率为47．6％，其 他结果如表 3所示。 表3 茶多酚及其氧化产物对邻苯三酚自氧化的抑制作用 从表3可知，在质量浓度相同的情况下，茶多酚 氧化产物抑制邻苯三酚自氧化的能力强于茶多酚， 在各个质量浓度条件下均强于所使用的 SOD粗酶 液；而且茶多酚及其氧化产物在该体系中与SO1)粗 酶液均表现出协同增效作用，但茶多酚氧化产物的 协同增效作用比茶多酚强。 2．4 茶多酚及其氧化产物清除活性自由基的机理 探讨 儿茶素及其氧化产物的基本结构单元为黄烷醇， 与其抗氧化活性有关的结构因素有酚羟基的数目和 位置，单体的结合方式产生的空间位阻也有一定的关 系。儿茶素类及其氧化物含有多个游离酚羟基，具有 很强的提供氢质子的能力，使具有高度氧化性的自由 基还原，从而达到终止自由基链锁反应，达到清除自 由基的目的。而且，儿茶素类在与自由基反应的过程 中，分子内能形成氢键，生成稳定的自由基中间体，抑 制了原来的自由基链锁反应。儿茶素类在氧化过程 中发生聚合，使其与相应的儿茶素相比，有更多的酚 羟基。在儿茶素的氧化过程中，酸性增强，而使氧化 产物能形成更大的供氢体。因此儿茶素氧化产物有 可能比儿茶素单体的抗氧化活性更强。 邻苯三酚 自氧化是一类链式反应，在自氧化过 程中， 不断消失又不断生成，达到稳定状态时， 其质量浓度保持恒定。茶多酚及其氧化产物和SOD 均能清除 o2一，而使邻苯三酚的自氧化速率降低， 从而达到抑制邻苯三酚自氧化的目的。 3 结论 在生物体系中，02～的损伤作用主要是使核酸 链断裂，多糖解聚，以及不饱和脂肪酸过氧化作用， 造成膜损伤，改变线粒体氧化磷酸化作用。 ’在 细胞中被铁配合物催化能与 反应生成·OH， -OH是一个氧化能力更强的自由基，在人体内一旦 生成，反应性高，速度快，极具破坏性，能造成 DNA、 细胞组织的损伤 。对茶多酚及其氧化产物的研究 表明，它们对不同体系产生的自由基 一和-OH均 有明显的清除作用。在所实验质量浓范围内对光照 核黄素体系产生的 ～的最大清除率分别为 96．9％和92．1％，对 DR体系产生的-OH，其最大清 除率分别为83．4％和88．5％，而且它们对邻苯三酚 自氧化均有明显的抑制作用，并与SOD粗酶液具有 协同增效作用，且茶多酚氧化产物的作用强于茶多 酚。因此，茶多酚氧化产物作为一种理想的自由基 清除剂和抗氧化剂，必将具有良好的开发应用前景。 参考文献： [1] 贾之慎．扬贤强．茶多酎清除活性氧自由基的分光光度法研究 [J]茶叶，1993 19(1)：25 [2] YEN Go~-chin．cHEN I-hfi一 n Anfio~idant 6v竹0f varI舢s L ∞ 出】n陀 on to their∞ 邮 曲 [J]J A c F呻d 0I绷， 1997．45：3o一34． [3]谢笔钩．石 煌．胡慰望．绿茶、乌龙茶、红茶中主要组分和酚类 化合物抑制脂肪氧合酶活性和抗油脂 自动氧化特性的研究 [J] 天然产物研究与开发，1994 6(4)：20—23 [4] 曹 进．茶色素抗菌抗病素忭用的研究进展[J]中草药．1998， 29(9) 06—638 [5] 项秀兰，李 楠，张小安 ．茶叶多元酚及其衍生物茶色素的目f 究进展[J]食品科学，1997．18(1)：10—11 【6J B哪Ll cII 却 C，Fndo~ich ir n Strpea~d~ 8n L皓e：improved 船啦 叽d姒ass a仰I汹 k m垴e J] 越^ Bi hm， 1971，44：276—287． 【7 J BⅢTy Halliwell，cu址 妊 J M c，Azno~aOI d邮 维普资讯 http://www.cqvip.com 精细化工 FINE CHEMICALS 第17卷 method：Ⅱ rrd e Test-Tub,． assay detercrfina~an rate cotlstants for reactions h—删 rad&ds【J]．A| Bioeh~ swy．1987， (165)：215—219． 8] 静天玉，赵晓瑜 用蓥止剂改进楣氧化物歧化酶邻苯三酚铡活 法[J 生物化学与生物物理进展．1995．丑(1)}84—86 [9]Davis cq_㈣ ∞．o-qs~r~llca]s and human disease[C]．Ann Int Med l987 la7—526 作者简介：李春美(1973一)，女．华中农业大学食品科技系 在读博士研究生。主要从事天然产物化学的研究工作 曾 参与银杏叶黄酮提取技术的研究工作，现主要从事茶多酚及 其衍生物的制备分离及生物活性研究。已在国内核心期刊 上发表相关论文多篇。 Investigation with Spectrophotomeric Method on the Radical Scavenging Effect ofTea Polyphenol andits Oxidant IJl Cliun—mei．X1E Bi-jtm (凸 仲憎 ofFood Soence and Tarhndogy，Hmghong地位E血胛 Un／ters时．Wuha~430070， ) Ab：h t：The radical sc 即 “g effects of tea polyphenol(TP)and its oxidant weIE investigated with spectrophotomeric methodin different systems．The result showedthat， tea p0lyphenol andits oxidant had saong scavengingeffectsto bedl hydroxylm出 and superoxide radical generated by different systems．Inthe deoxyrlbose system．in thetest concentration rangefrom 8．3 vg／mLto167 vg／mL．the n~ nxlm scavenging rate ofTPandits oddantto superoxlde radicalwere 96．6％ and 92．1％ respectively．Intheflavins system themaximum scavenging rate ofTPandits oxidantto hyai~yl radical were 83．4％ and 88．5％ respectivelyinthetest concentration r,dllgefrom 5 VeCmLto 800vg／mL Inthe pyrogallol autoxidation sy ．stem，themaxmarminlfihition rate of'137 oxidant，crude SOD and'137眦 66．5％，47 6％ and 45 3％ sp。cti他b，and both TPandits oxidant have building actionto crude SOD，butthe effect ofTP oxidant was strongerthan TP． Key w删 s：tea polyphonol：oxidant；radical system；spectrophotomeric method (上接 227页) Study ofHydrogenation ofEthyl Benzoate Catalyzed by Silica-supported Carboxymethyl Cellulose-platinmn Complex JIN Feng-you (啦Ⅻ of 咖 ，Su2hua?~onna／，Std／u~152061， ) Abstract：A natural polymer catalyst，silica·supported carl3oxymethyl ceHulose-phtinum complex(abbreviated as Si— CMC—Pt)tms beensynthesizedandfoundto catalyzethe hydrogenation of ethyl benzoateto ethyl cyclohexaneccorhoxylate in about 100％ yield at 60一’7o ℃ and 0．1 MPa hydr~en pressure The catalyst is stable and cmdd be rellS~l for several times without any change in catalytic property, ． Key words',13oly／／ler catalyst；hydragenation；ethyl benzoate ： 《精细化工》杂志编辑部电子信箱变更紧急 各作者 、读者 、广告客户 ：因大连市电信局增容 ，《精细化工》杂志编辑部新的 ；为 ：finechem@mail．dlpu．In．cn 望周知 。 《精细化3"))1998、1999全年精装合订本继续 出售 甜青细化~_)1998、1999年全年精装合订本8o元／年本(含包装、邮挂费)，数量有限，欲购从速，款到发 以 {_ 途 一 用 {_ 及 _! 名 j_ 姓 {_ 址 _l 地 {_ 编 {_ 邮 一 的 一 你 一 楚 _} 清 一 写 1- 上 1_ 单 1_ 款 一 汇 _} 在 一 务 {_ 玉 _} 崔 j_ 黼 ～ 姒 一 连 一 大 {_ 一 人 款 一 收 {_ 维普资讯 http://www.cqvip.com